冠状病毒mRNA疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗领域，具体涉及冠状病毒mRNA疫苗及其应用。

背景技术

疫苗是预防传染病的最有效手段之一，在根除天花、脊髓灰质炎、水痘等传染病方面发挥了关键作用。传统的重组蛋白疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗等研发周期长、成本高、生产工艺比较繁杂，在应对新发、突发传染病时不能及时有效地控制疾病的传播，给人们带来了灾难性的损失。

随着新型冠状病毒SARS-CoV-2疫情的爆发，mRNA疫苗开始进入大众的视野，相对传统疫苗，mRNA疫苗不需要繁杂的菌株筛选过程，只需要知道mRNA序列，通过体外转录合成，再经递送载体包裹等简单几步，大量缩减了时间成本。同时，生产工艺较传统疫苗简单，且能同时激发细胞和体液免疫应答，适合快速响应新发、突发传染病。

然而，SARS-CoV-2易发生突变，如果针对新的突变株开发疫苗，那么疫苗的更新速度注定落后于病毒的变异速度。因此，急需开发一种通用型新冠mRNA疫苗能够应对多种病毒突变株以及未出现突变株甚至是相关类型的冠状病毒等，且提供持久保护作用。

发明内容

本文涉及包含一种或多种核酸分子的组合物(例如疫苗)，所述核酸分子编码能够引发针对冠状病毒的强效中和抗体反应的高免疫原性抗原。本文的核酸分子用于表达冠状病毒刺突(S)蛋白的关键中和结构域，当单独或组合用作免疫原性组合物或疫苗时，能有效诱导保护性免疫，以保护受试者免于天然病毒感染和/或减轻感染的症状。

在本文的一个方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码冠状病毒的受体结合结构域(RBD)的开放阅读框(ORF)，其中所述受体结合结构域至少包括对应于SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的第457、478、484和493位中的一个或多个位点的氨基酸突变成天冬酰胺(Asn，N)。

在一些实施方式中，所述受体结合结构域可以进一步包括对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第417和/或452位的氨基酸突变成天冬酰胺(N)。

在一些实施方式中，所述受体结合结构域进一步包括对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第459、480、486和495位中的一个或多个位点的氨基酸突变成苏氨酸(Thr，T)。

在一些实施方式中，所述受体结合结构域进一步包括对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第419和/或454位的氨基酸突变成苏氨酸(T)。

在一些实施方式中，所述ORF还可以编码与所述RBD连接的三聚化结构域。本领域技术人员应理解，对于三聚化结构域没有特别的限制，只要它能使本文的核酸分子编码的RBD融合前三聚体的状态。在一些具体实施方式中，所述三聚化结构域为噬菌体T4纤维蛋白来源的三聚体折叠结构域(T4f)。在一些具体实施方式中，所述三聚化结构域具有SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，所述三聚化结构域由具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，所述RBD和所述三聚化结构域可以直接连接。

在一些实施方式中，所述RBD和所述三聚化结构域可以经由可切割或不可切割的连接子连接。在一些实施方式中，所述连接子可以为(G

在一些实施方式中，所述ORF还可以编码信号肽。在一些实施方式中，所述信号肽可以与所述RBD连接。在一些实施方式中，所述信号肽相对于SARS-CoV-2可以是异源的。在具体实施方式中，所述信号肽具有有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，所述信号肽由具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，所述RBD可以具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述RBD可以具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述RBD可以具有与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述RBD可以具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述RBD可以包括与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述RBD可以包括SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述RBD可以包括与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述RBD可以包括SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子的开放阅读框(ORF)可以包括与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核酸分子的开放阅读框可以包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子的开放阅读框(ORF)可以包括与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核酸分子的开放阅读框可以包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子可以包括与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核酸分子可以包括SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子可以包括与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核酸分子可以包括SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子可以为信使核糖核酸(mRNA)分子。

在一些实施方式中，所述核酸分子还可以包括5’非翻译区(5’UTR)。在一些实施方式中，所述5’非翻译区可以具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子还可以包括3’非翻译区(3’UTR)。在一些实施方式中，所述3’非翻译区可以具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述mRNA分子还可以包括5’帽，任选地选自例3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G；G(5’)ppp(5’)A；G(5′)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G。

在一些实施方式中，所述mRNA分子还可以包括多聚A尾。在一些实施方式中，所述多聚A尾任选地具有约100个核苷酸。

在一些实施方式中，所述mRNA分子可以包含化学修饰，任选地包括1-甲基假尿苷。

在本文中，通过上述位点的氨基酸突变成天冬酰胺，表达的RBD能够在翻译后修饰的过程中被糖基化(N-糖基化)。这些糖基化修饰能够遮盖易突变表位，使得更多保守位点得以暴露从而产生更为广谱的抗体。

本文的另一方面提供了一种组合物，其包括：本文提供的核酸分子；和，脂质纳米颗粒(LNP)。

在一些实施方式中，所述核酸分子在所述脂质纳米颗粒中。

在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒可以包括可电离脂质。在一些实施方式中，所述可电离脂质可以包括具有以下结构的化合物：

在具体的实施方式中，所述可电离的阳离子脂质可以是式V所示的化合物。

在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒还可以包括中性脂质。在一些实施方式中，所述中性脂质可以选自1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二-十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)、1-油酰基-2胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂，和其混合物。在具体的实施方式中，所述中性脂质可以是DOPE。

在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒还可以包括固醇。在一些实施方式中，所述固醇可以选自胆固醇、粪生固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、芸苔固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和其混合物。在具体的实施方式中，所述固醇可以是胆固醇。

在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒还可以包括聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。在一些实施方式中，所述PEG修饰的脂质可以选自PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油和其混合物。在一些实施方式中，所述PEG修饰的脂质可以选自DMG-PEG、PEG-c-DOMG(也称为PEG-DOMG)、PEG-DSG和PEG-DPG。在具体的实施方式中，所述PEG修饰的脂质可以是DMG-PEG，例如PEG2000 DMG。

在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒可以包括约20～60mol％可电离的阳离子脂质。

在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒可以包括约5～25mol％中性脂质。

在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒可以包括约25～60mol％固醇。

在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒可以包括约0.4～15mol％PEG修饰的脂质。

本文的又一方面提供了一种用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文的核酸分子或组合物。

本文的又一方面提供了本文的核酸分子或组合物在制备用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的药物中的用途。

在一些实施方式中，所述冠状病毒包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2或SARS样冠状病毒WIV-1。

在一些实施方式中，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2原始株、SARS-CoV-2Omicron突变株、SARS-CoV-2Delta突变株、SARS-CoV-2Beta突变株、SARS-CoV-2Gamma突变株、SARS-CoV或WIV-1。

在一些实施方式中，本文的核酸分子或组合物能有效地在受试者中诱导针对SARS-CoV-2的中和抗体反应。

在一些实施方式中，本文的核酸分子或组合物能有效地在受试者中诱导针对SARS-CoV-2的T细胞免疫反应。

在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2冠状病毒可以包括任意的突变株。在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2冠状病毒可以包括Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1529)。

本文证明了经糖基化修饰的mRNA疫苗能够诱发机体产生较强的抗体反应，且相应抗体可有效中和多种冠状病毒(例如SARS-CoV-2野生型及其突变株、SARS-CoV、WIV1-CoV等)，且随着第2针免疫时间间隔的延长，所有mRNA疫苗组抗体滴度都有逐渐升高的趋势。本文提供的疫苗为以SARS-CoV-2冠状病毒感染性疾病以及更广泛的疾病预防提供了一种新的治疗策略。

附图说明

图1示出了LNP及mRNA结构。其中，(A)LNP组成、结构及LNP/mRNA复合物示意图，(B)三种mRNA组成，(C)体外转录mRNA的质粒在HEK-293T细胞中的逆转录情况，(D)WB验证3条mRNA在HEK-293T细胞中的蛋白表达情况。

图2示出了LNP/mRNA复合物理化性质表征结果。其中，(A)LNP/mRNA复合物透析前后粒径、PDI变化，(B)LNP/mRNA复合物的粒径、PDI统计及包封率、负载率检测结果，(C)LNP/mRNA复合物电镜结果(上图为下图的放大结果)，(D)LNP及LNP/mRNA复合物的pKa检测结果。

图3示出了LNP转胞吞能力评价结果。其中，(A)转胞吞示意图，(B)流式检测LNP/Cy5-核酸在HEK-293T细胞中的转胞吞能力检测结果，(C)对B图中细胞胞吞效率定量结果，(D)CLSM检测LNP/mRNA复合物在HEK-293T细胞中的转胞吞能力的结果，Mock为空白对照，标尺：10μm，(E)对D图细胞中Cy5信号定量结果。

图4示出了LNP在不同条件下的稳定性评价结果。其中，LNP包裹表达荧光素酶蛋白的mRNA后，分别在4℃、25℃和37℃储存1d、3d、7d，小鼠肌肉给药(A)6h(B)24h(C)48h小鼠体内及脏器的荧光素酶表达情况。

图5示出了中和抗体评价结果。其中，(A)LNP/mRNA在小鼠上的免疫给药方案，(B)实验终点，小鼠血清RBD蛋白特异性IgG滴度评价结果，(C-F)针对冠状假病毒的抗体中和评价结果，(G-H)针对野生型SARS-CoV-2和Omicron的抗体中和评价结果。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图6示出了SARS-CoV-2RBD特异性肽库刺激后，分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4的CD4+Tem细胞的百分比。

图7示出了SARS-CoV-2RBD特异性肽库刺激后，分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4的CD8+Tem细胞的百分比。

图8示出了H&E评价LNP/mRNA在小鼠体内的安全性结果，标尺：100μm。

具体实施方式

SARS-CoV-2是一种单链RNA病毒，通过其表面S蛋白与宿主细胞(如人肺上皮细胞)表面受体血管紧张素转换酶II(Angiotensin I Converting Enzyme 2 or AngiotensinII Converting Enzyme,ACE2)结合从而感染宿主细胞。S蛋白是一种I型跨膜蛋白，包括S1和S2两个亚基。S1的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)识别并结合宿主细胞表面ACE2，然后S2将病毒包膜与宿主细胞膜融合，以促进病毒RNA的进入。因此，S蛋白在SARS-CoV-2感染过程中至关重要，针对S蛋白或RBD结构域开发SARS-CoV-2疫苗是预防COVID-19的有效策略。

由于SARS-CoV-2的RBD蛋白发生突变的频率较高，导致现阶段的疫苗和抗体的防治效果下降。本文通过筛选，发现在特定RBD蛋白的氨基酸位点上引入N-糖基化修饰，使得更多保守的抗原表位得以暴露从而产生针对新冠病毒及其突变株更为广谱的中和抗体。

在本文的一些实施方式中，通过将特定位点的氨基酸突变成天冬酰胺(N)，以及所述特定位点起第三位氨基酸突变为苏氨酸(T)，使得修饰位点的氨基酸序列满足“N*T”的结构，以在翻译后修饰中引入N-糖基化修饰。

同时，本文的核酸分子(例如mRNA)可以在3’段加入编码噬菌体T4纤维蛋白来源的三聚化结构域(T4f)，从而能使表达的RBD蛋白保持融合前三聚体状态。

本文提供的疫苗能够预防或治疗SARS-CoV-2及其突变株以及其他冠状病毒，且具有中和效率平衡与广谱性的中和抗体。

本文中，在S蛋白中引入N-糖基化修饰，通过对RBD蛋白上突变位点(K417、L452、R457、T478、E484、Q493)进行糖基化修饰以遮盖易突变表位，使得更多保守位点得以暴露从而产生更为广谱的抗体，同时在mRNA的C端加入噬菌体T4纤维蛋白来源的三聚体折叠结构域(T4f)使RBD蛋白保持融合前三聚体状态，最后设计得到了密码子优化的野生型(WideType,WT)、糖基化修饰突变1(Mutation 1,M1)(K417N、L452N、R457N、T478N、E484N、Q493N)和糖基化修饰突变2(Mutation 2,M2)(R457N、T478N、E484N、Q493N)的RBD mRNA(mRBD)疫苗，以期获得通用型抗冠状病毒mRNA疫苗。

本文合成了应对多种SARS-CoV-2突变株及其他冠状病毒的野生型(WT)和糖基化修饰(M1和M2)的RBD mRNA疫苗。通过LNP递送mRNA疫苗评价其免疫小鼠后产生的SARS-CoV-2RBD特异性IgG抗体滴度以及在多种冠状假病毒和真病毒中的中和抗体活性。发现本文的糖基化修饰的mRNA疫苗对新冠突变株以及其他冠状病毒株有更高的中和活性，为可电离脂质体用于mRNA递送以及冠状病毒通用型mRNA疫苗的设计提供了新的思路和理论依据。

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本文的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒直径约80～120nm，基因组全长约27-32kb，是已知RNA病毒中基因组最大的病毒。本文中的冠状病毒可以包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2或SARS样冠状病毒WIV-1等。

SARS-Cov-2：国际病毒分类委员会对新型冠状病毒的命名。SARS-CoV-2包括原始株和各种突变株：SARS-CoV-2奥米克戎突变株(即Omicron突变株)、SARS-CoV-2德尔塔突变株(即Delta突变株)、SARS-CoV-2贝塔突变株(即Beta突变株)和SARS-CoV-2伽马突变株(即Gamma突变株)等。SARS-CoV-2主要由四种结构蛋白构成：刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)和包膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)。

S蛋白是一类很大的三聚体跨膜糖蛋白，有着大量糖基化的修饰，其在病毒表面形成特殊的花冠结构。它首先结合细胞表面的受体，然后发生“变形”，顺势将病毒包膜与细胞膜融为一体，从而将病毒内的遗传物质注入细胞，达到感染细胞的目的。Spike蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。

脂质体(LNP)，也称脂质纳米粒子、脂复合体及/或纳米脂质体，并入的核酸(例如DNA或RNA)可完全或部分位于脂质层/膜内或与脂质层/膜的外部表面缔合的LNP的内部空间中。将核酸并入LNP中的目的为保护核酸，使得RNA免于可含有使核酸及/或引起核酸快速分泌的系统或受体降解的酶或化学物质或条件的环境。此外，可促进核酸的吸收，且因此可增强核酸的治疗功效。LNP可以具有不同尺寸，例如但不限于：多层囊泡(MLV)，其直径可为数百纳米且可含有一系列由窄水性隔室分隔开的同心双层；小单细胞囊泡(SUV)，其直径可小于50nm；及直径可在50nm与500nm之间的大单层囊泡(LUV)等。

核酸分子是由携带遗传信息的连接核苷酸构成的大分子，并且通过指导蛋白质合成过程，指导大部分(如果并非全部)细胞功能。核酸包含核苷酸(核苷酸单体)的聚合物。因此，核酸也称为多核苷酸(也称为多核苷酸链)。核酸的两个主要类别是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA构成所有自由生活的生物体和大部分病毒中的遗传物质。RNA是某些病毒的遗传物质，但也在所有活细胞中发现，在所述活细胞中，RNA在细胞过程中、最显著的是在蛋白质的制备中起重要作用。

核苷是核酸(例如DNA和RNA)的结构亚基。核苷由共价附接至五碳碳水化合物核糖或“糖”(其为核糖或脱氧核糖)的含氮碱基(核碱基)、通常为嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)或嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)构成。核苷酸由含氮碱基、糖(核糖或脱氧核糖)和一个至三个磷酸基团组成。本质上，核苷酸仅仅是具有一个或多个额外磷酸基团的核苷。

核酸的核碱基部分的特征在于嘌呤碱基：腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；和嘧啶碱基：胞嘧啶(C)、DNA中的胸腺嘧啶(T)和RNA中的尿嘧啶(U)。核酸的糖部分的特征在于DNA中的脱氧核糖、RNA中的核糖。五个核苷通常分别缩写为其单字母代码A、G、C、T和U。然而，胸苷更通常地写为“dT”(“d”代表“脱氧”)，因为其含有2’-脱氧呋喃核糖部分而非尿苷中发现的呋喃核糖环。这是由于胸苷在脱氧核糖核酸(DNA)而非核糖核酸(RNA)中发现。相反，尿苷在RNA中而非DNA中发现。其余三个核苷可在RNA和DNA二者中发现。在RNA中，其将表示为A、C和G，而在DNA中，其将表示为dA、dC和dG。

本领域技术人员应理解，除非另有说明，否则本申请中所阐释的核酸序列可在代表性DNA序列中列举“T”，但在序列表示mRNA的情况下，“T”将被取代为“U”。因此，所公开和由本文特定序列识别号鉴定的任何DNA还公开了与DNA互补的相应mRNA序列，其中DNA序列的每个“T”被“U”取代。

在一些实施方式中，所述三聚化结构域可以与蛋白质或多肽连接(形成融合蛋白)时，能够允许融合蛋白与其他含有三聚化结构域的融合蛋白相互作用，使其形成三聚体结构。任何已知的三聚化结构域可以用于本文。在一些实施方式中，所述三聚化结构域可以包括，但并不限于，HIV-1gp41三聚化域、SIV gp41三聚化域、埃博拉(Ebola)病毒gp-2三聚化域、HTLV-1gp-21三聚化域、T4纤维蛋白三聚化域(即，折叠子(foldon))、酵母热休克转录因子三聚化域和人胶原三聚化域。

在一些实施方式中，本文的核酸分子中的ORF编码与冠状病毒抗原(例如RBD)融合的信号肽。所述信号肽通常是位于蛋白质N末端的15～60个氨基酸，其是分泌途径上跨膜易位所需要的，普遍控制真核生物和原核生物中大部分蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生的前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导至粗内质网(ER)膜，并且起始生长的肽链穿过其转运以进行加工。ER加工产生成熟蛋白质，其中信号肽通常通过宿主细胞的ER驻留信号肽酶从前体蛋白切割，或者其保持未切割并作为膜锚起作用。信号肽也可促进蛋白质靶向细胞膜。

在一些实施方式中，所述信号肽的长度可以包括15～60个氨基酸。例如，所述信号肽的长度可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸。在一些实施方式中，所述信号肽的长度为20～60、25～60、30～60、35～60、40～60、45～60、50～60、55～60、15～55、20～55、25～55、30～55、35～55、40～55、45～55、50～55、15～50、20～50、25～50、30～50、35～50、40～50、45～50、15～45、20～45、25～45、30～45、35～45、40～45、15～40、20～40、25～40、30～40、35～40、15～35、20～35、25～35、30～35、15～30、20～30、25～30、15～25、20～25或15～20个氨基酸。

来自异源基因的信号肽(其调控自然界中除冠状病毒抗原外的基因的表达)是本领域中已知的，并且可测试其期望性质，然后并入本文的核酸中。在具体的实施方式中，所述信号肽可以具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本文的核酸分子还包括5’UTR和/或3’UTR。

在本文的核酸分子的开放阅读框(ORF)是一段连续的DNA或RNA，以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG或AUG))开始，并以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA，或UAA、UAG或UGA)结束。ORF通常编码蛋白质。应理解，本文公开的序列还可包含额外的元件，例如5’UTR和3’UTR，但与ORF不同，这些元件不一定存在于本文的mRNA中。还应理解，本文的核酸分子(例如mRNA)可包括任意的5’非翻译区和/或3’UTR。示例性UTR序列提供于序列表中(例如，SEQ IDNO:16和17)。然而，其他的UTR序列可使用或替换本文所述的任何UTR序列。还可从本文提供的mRNA中省略UTR。

在一些实施方式中，本文的核酸分子配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。脂质纳米颗粒通常包含可电离的阳离子脂质、非阳离子脂质(即，中性脂质)、固醇和PEG修饰脂质组分以及目标核酸分子。本文的脂质纳米颗粒可使用本领域中通常已知的组分、组合物和方法产生。

在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒包括至少一种可电离的阳离子脂质、至少一种中性脂质、至少一种固醇和至少一种PEG修饰脂质。

两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，空位)的情况下，比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列中都存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。由于空位不是核苷酸或氨基酸，所以靶序列中存在的空位不计在内。同样，由于计入靶序列核苷酸或氨基酸，而不计来自参考序列的核苷酸或氨基酸，所以不计参考序列中存在的空位。

可以通过以下过程来计算序列同一性百分比：确定其中两个序列中都出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数，以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可使用易用于在线使用和下载的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，用于蛋白质和核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher、生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。

在一些实施方式中，本文所用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，尤其是人。本文描述的组合物和方法适用于人的疗法和兽医应用。在一些方面，受试者是哺乳动物，在其它方面，受试者是人。如本文所用，“哺乳动物受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、家养动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。在具体的实施方式中，所述受试者是人。

下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。

实验材料

RBD质粒构建(南京金斯瑞生物科技有限公司)；

SARS-CoV-2Spike RBD Rabbit pAb(A20135，ABclonal)；

Ribogreen(R11491,Thermo Scientific)；

HiScribe T7 Quick High Yield RNASynthesis Kit(E2060S，NEW ENGLAND

线性化酶BstZ17I-HF(R3594L,NEW ENGLAND

DH5α感受态细胞(C502-03，南京诺唯赞)；

质粒小提试剂盒(CW0500，康为世纪生物科技有限公司)；

细胞爬片(YA0350，索莱宝)；

Luciferase Assay System(E1501,Promega)；

小鼠抗新型冠状病毒S-RBD蛋白IgG抗体检测试剂盒(万泰生物)；

CD3(17A2)Rat mAb(FITC Conjugate)(86603S，Cell Signaling Technology)；

CD4(RM4-5)Rat mAb(APC Conjugate)(82116S，Cell Signaling Technology)；

CD8α(2.43)Rat mAb(PE Conjugate)(56984S,Cell Signaling Technology)；

Brilliant Violet 421

PE/Cyanine7 anti-mouse IL-4(504118，BioLegend)；

Brilliant Violet 785

PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse IFN-γ(505822，BioLegend)；

PE/Dazzle

Zombie NIR

TruStain FcX

SARS-CoV-2Spike RBD Peptide poll(PP002，SinoBiological)；

BD Cytofix/Cytoperm

实验方法

(1)质粒的线性化、体外转录和加帽加尾

1.质粒的线性化，体系如下表1所示。

表1

2.线性化质粒的纯化

1)用500μL的苯酚、氯仿混合物，充分混合均匀以萃取DNA，12000g，4℃离心15min。

2)吸弃上清，再次加入等量的氯仿，12000g，4℃离心15min。

3)加入1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，在-20℃沉淀DNA至少30min。

4)4℃，12000g离心15min，沉淀DNA，小心弃掉上清液。

5)用1mL 75％的乙醇洗涤沉淀，12000g，4℃离心15min去掉上清。

6)冰上晾干，用DEPC水溶解并检测线性化质粒的浓度。

3.体外转录及加帽、加尾

1)体外转录及加帽，体系如下表2所示。

表2

2)加入4μL的DNA酶Ⅰ以去除体系中残余的线性化质粒，37℃孵育15min。

3)加Poly A尾，体系如下表3所示。

表3

4)mRNA纯化：在上一步反应中加入50μL LiCl溶液-20℃放30min，4℃12000rpm离心15min，吸弃上清并加入1mL预冷的75％乙醇溶液，4℃12000rpm离心10min。

去掉上清，冰上晾干并用DEPC水重悬沉淀，将mRNA在65℃金属浴中加热5-10min助溶，之后测量浓度并保存于-80℃。

(2)LNP制备及包裹mRNA

LNP由四种脂质组成，分别是可电离脂质(即关键脂质，Key Lipid)、磷脂(DOPE)、胆固醇(Cholesterol)和PEG脂质(DMG-PEG

LNP包裹mRNA步骤：首先将mRNA浓度调整为500-1000ng/μL，然后脂质体与mRNA按照质量比15：1混合并在50℃孵育20min；接下来将脂质体纳米复合物转移到100KDa透析管中在1×PBS里透析2h。透析过程中未包被的mRNA以及无水乙醇都被1×PBS取代/稀释，透析后的液体即为最终脂质体纳米复合物。

(3)LNP/mRNA复合物包封率的测定

利用荧光染料RiboGreen与mRNA结合后能发出荧光的原理，在制备好的纳米复合物透析后加入RiboGreen避光3-5min，然后用酶标仪检测荧光强度。根据公式计算包封率：包封率(％)＝脂质体包入的mRNA/(透析后纳米复合物中的总mRNA)×100％。

(4)脂质纳米颗粒pKa检测

通过pKa来表征脂质纳米颗粒的电离性能。首先，制备1mL脂质纳米颗粒；然后在蒸馏水中配置100mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、100mM MES、100mM乙酸铵、1300mM NaCl和100μM TNS(2-(p-toluidino)-6-napthalenesulfonic acid)储存溶液；接下来，制备一系列在不同pH条件(pH 2.0-12.0)下的纳米溶液，纳米溶液中包含10mM HEPES、10mM MES、10mM乙酸铵、130mM NaCl以及脂质纳米颗粒；取396μL纳米溶液和4μL的TNS原液混合均匀；在96孔黑板上加入100μL的样品溶液(3个复孔)，在321nm的激发波长和445nm的发射波长下检测荧光值并记录；最后，通过Henderson-Hasselbach方程(GraphPad Prism v.8)拟合，计算脂质纳米颗粒的pKa。

(5)LNP转胞吞能力检测

预先将细胞爬片放到24孔板中，然后将HEK-293T细胞按照5×10

(6)脂质体热稳定性评价

分别在距离给药第0d、1d、3d、7d制备LNP/mLuc复合物，然后将第1d、3d、7d制备的LNP/mLuc复合物分别储存在4℃、25℃和37℃，在第7d统一给小鼠肌肉注射LNP/mLuc复合物，距离给药6h、24h、48h后分别进行生物发光成像；并且在6h、24h、48h每组分别解剖1只小鼠看各脏器及肌肉组织中荧光素酶的表达。具体分组信息如下表4所示。

表4

(7)动物免疫实验

评价LNP递送mRBD疫苗在小鼠体内产生抗体后，该抗体在细胞水平(HEK-293T-ACE2细胞或Vero细胞)上抑制真/假病毒侵染细胞的效果。

首先将LNP/mRBD(mRBD给药剂量为0.5mg/kg)通过肌肉注射免疫小鼠，并在第14d、21d、28d后分别等量进行二次免疫。在距离二次免疫14d后即为实验终点，小鼠摘眼球取血，并将血液样本室温静置2h后，3500rpm离心15min收集上清，56℃灭活30min，冻存在-80℃备用。具体实验分组如下表5所示。

表5

(8)小鼠抗新型冠状病毒(2019-nCoV)S-RBD蛋白IgG抗体检测

将小鼠血清用样品稀释液从1：10开始进行10倍梯度稀释，轻轻震荡混匀，每孔加入稀释好的样品或阴、阳性对照100μL。用封板膜封板后，置37℃温育30min后用洗涤液清洗5遍，每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外，置37℃继续温育30min后用洗涤液清洗5遍，然后每孔加入显色剂A、B液各50μL，37℃避光显色15min，再加入50μL终止液，酶标仪于450nm处检测吸光度值A。样品A值≥临界值(CUTOFF)为2019-nCoV S-RBD抗体阳性，样品A值≤临界值(CUTOFF)为2019-nCoV S-RBD抗体阴性。抗体滴度＝最大稀释倍数为阳性对应的A值÷CUTOFF×稀释倍数。

(9)脾单细胞胞内细胞因子流式分析

为进一步评价疫苗细胞免疫应答水平，应用光谱细胞分析仪(型号：LE-ID 7000C)检测胞内因子的分泌，分析RBD肽库刺激小鼠脾单细胞后，T淋巴细胞分泌细胞因子的偏向与强度。使用荧光抗体标记细胞表面CD3、CD4与CD8和胞内因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4。流式分选CD3

1)首先在实验终点，分离小鼠脾单细胞，即用手术剪刀将脾剪碎，然后通过40μm滤网过滤，并去除其中的红细胞，最后得到脾单细胞。

2)将脾单细胞调节细胞浓度至2×10

3)收集细胞300×g离心5min，去掉上清，加入500μL含的2％FBS的PBS重悬清洗细胞两次。然后加入100μL(0.25μg/孔)抗小鼠CD16/CD32单抗，4℃封闭20min。

4)300×g离心5min，用500μL含2％FBS的PBS清洗细胞1次后，每孔加入100μL含CD3(0.5μg/孔)，CD4(0.125μg/孔)，CD8(0.125μg/孔)混合抗体稀释液，4℃染色30min。

5)300×g离心5min离心沉淀细胞，用500μL含2％FBS的PBS清洗细胞2次后，每孔加入250μL细胞固定/破膜液4℃20min。

6)300×g离心5min，吸弃上清，加入500μL 1×破膜液重悬清洗细胞2-3次后进行胞内因子染色，每孔分别加入100μL破膜液稀释的anti-IFN-γ(1μg/孔)，anti-TNF-α(0.125μg/孔)，anti-IL-2(0.2μg/孔)、anti-IL-4APC(0.125μg/孔)4℃染色45min。

7)300×g离心5min清洗细胞，弃上清，最终加入500μL Cell staining buffer重悬细胞进行上机检测。分组如下表6所示。

表6

(10)假病毒中和实验

将稳定表达ACE2的HEK-293T细胞(HEK-293T-ACE2)按照每孔5×10

(11)真病毒中和实验

感染前24h将10

实施例1：LNP及mRNA结构

LNP由4种脂质组成，分别是关键脂质(Key Lipid)、磷脂(DOPE)、胆固醇(Cholesterol)和PEG脂质(DMG-PEG

实施例2 LNP/mRNA理化性质表征

本实施例对LNP/mRNA的理化性质进行了评价。结果显示，LNP负载mRNA透析前(约120nm)后(约130nm)粒径变化不大，且粒径总体较小，多分散系数(Polydispersity index,PDI)均小于0.15，证明LNP/mRNA纳米体系粒径十分均一，同时由包封率和负载率可知LNP可高效负载三种mRNA(参见图2A,B)。TEM结果显示LNP负载的3种mRNA均呈现规则的球形(参见图2C)。递送载体系统的pKa值处于6.0至6.5时，通常可响应内涵体pH值改变迅速离子化，从而与内涵体膜成分中的阴离子脂质(如磷脂酰丝氨酸)发生相互作用，破坏内涵体膜稳定性，促使核酸分子从内涵体中逃逸到细胞质，同时释放核酸分子。本实施例中，LNP及LNP/mRNA体系的pKa值分别为6.12和6.32，即LNP在pH小于6.12的环境中，即可带正电荷，促进mRNA分子在内涵体中的逃逸(图2D)。

实施例3 LNP转胞吞能力评价

使用注射器在小鼠腿部肌肉注射疫苗时，只能在注射点释放疫苗。而mRNA疫苗在体内产生中和抗体主要通过进入三类细胞：1)体细胞(包括肌肉细胞和皮下细胞等)、2)注射部位的组织驻留免疫细胞和3)二级淋巴组织的免疫细胞(包括淋巴结和脾脏)，进而发挥体液和细胞的双重免疫作用。为了验证本文的LNP具有转胞吞能力，从而可引起肌肉深层组织及浅表部位的免疫，通过FACS和CLMS评估LNP递送Cy5标记的核酸(Cy5-labellednucleic acid，Cy5-NA)转染HEK-293T细胞后，评估其转胞吞能力(参见图3A)。如图3B、C所示，LNP/Cy5-NA分别以1μg/mL和5μg/mL转染HEK-293T细胞，发现(i)、(ii)和(iii)中均有Cy5信号，(ii)中的Cy5信号是由(i)中的细胞“吐”出来后被(ii)中的细胞胞吞所得；(iii)中的Cy5信号是由(ii)中的细胞“吐”出来后被(iii)中的细胞胞吞所得，CLSM的结果与FACS结果相吻合(参见图3D,E)，证明LNP具有转胞吞能力。

实施例4 LNP/mRNA的热稳定性评价

为了评估本文的LNP是否具有一定的热稳定性，首先，制备LNP并包裹表达荧光素酶蛋白的mRNA透析后在4℃、25℃和37℃环境中分别储存1d、3d、7d，同时在成像当天再次制备LNP，包裹mRNA并透析。然后将所有不同储存条件下的LNP/mRNA复合物肌肉注射小鼠，并在给药后6h、24h、48h对小鼠体内和体外主要脏器进行成像。由图4A-C可以看出，该体系在4℃、25℃和37℃环境中储存3d以内，mRNA的表达几乎不受影响，储存7d会有一定程度的降解。同时该体系注射入小鼠肌肉后可持续表达蛋白48h以上。最重要的是，肌肉给药后，mRNA只在肌肉部位表达蛋白，并未在小鼠肝脏或者其它脏器中表达，减少了不必要的肝脏毒性，相较于很多脂质体递送mRNA肌肉给药后大部分都会去肝脏，本文的LNP更适合安全、高效地递送mRNA疫苗。

实施例5 LNP/mRNA体内免疫效果评价

为了评价LNP/mRNA体内免疫效果，使用3种mRNA(WT、M1、M2)疫苗开展小鼠免疫实验，分别在注射第一针疫苗后的第14d，21d，28d开展第二针免疫，mRNA剂量均为10μg/只。每组小鼠均在距离第2针免疫后的第14d采血开展血清学评价(参见图5A)。通过ELISA检测小鼠血清中SARS-CoV-2RBD特异性IgG抗体滴度，结果显示野生型RBD的mRNA疫苗(WT)表现出较高的抗体滴度，且随着第2针免疫时间间隔的延长，所有mRNA疫苗组的抗体滴度都有逐渐升高的趋势(图5B)。在假病毒的中和实验中，突变RBD mRNA疫苗(M1、M2)在小鼠体内产生的中和抗体对新冠原始毒株的中和效果弱于WT疫苗，这与ELISA结果一致(图5C)，推测主要原因是由于糖基化修饰遮蔽了野生型RBD的部分表位，导致诱导的总抗体滴度降低。但在第2针免疫间隔28d时差别不大：达到100％抑制效果时的血清稀释倍数(NT titer)为853.3、746.67、746.6。与此相对应，突变RBD的mRNA疫苗组血清对SARS-CoV-2Omicron BA.5突变株的中和效果优于野生型RBD疫苗(图5D)，特别是对SARS-CoV(2003)(图5E)以及蝙蝠来源的新型SARS样病毒WIV1-CoV具有显著升高的中和效果(图5F)。在真病毒SARS-CoV-2原始株与Omicron BA.5的感染实验中，3款mRNA疫苗表现出了与假病毒类似的趋势(图5G,H)。在整体结合抗体滴度下降的情况下，糖基化修饰的mRNA疫苗表现出了对突变株以及其他冠状病毒株更高的中和活性，研究结果为新冠通用型mRNA疫苗的研发了提供了新的思路。

实施例6 LNP/mRNA体内免疫应答评价

在小鼠免疫实验的终点，分离小鼠脾单细胞进一步探究mRNA疫苗是否诱导新冠病毒特异性T细胞免疫应答，以及IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5细胞因子的分泌和分泌细胞因子的T细胞类型。使用SARS-CoV-2RBD特异性肽库刺激小鼠脾细胞8h后，进行胞内因子染色并用光谱细胞分析仪检测。图6-图7的结果表明，相较于PBS组，整体趋势是第2次免疫时间越久，IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4细胞因子表达显著增加，免疫应答效果越好，且两种突变的mRNA疫苗要优于野生型的mRNA疫苗；同时免疫小鼠的CD4+T细胞诱导更显著的IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌(图6)。综上，两次mRNA疫苗(10μg)免疫可诱导SARS-CoV-2特异性的辅助T细胞和细胞毒性T细胞的免疫应答和长时间的免疫记忆。

实施例7 LNP/mRNA体内安全性评价

在小鼠免疫实验中，分别在距离第2针免疫后的第14d终止实验，取小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)进行H&E染色，观察到LNP/mRNA复合物和PBS组相比没有差异，即LNP/mRNA不会引起主要器官的炎症或其他病理变化，并且与体内的血液环境兼容(参见图8)。因此，肌肉注射LNP/mRNA疫苗是安全的。

以上实施例表明，通过体外转录技术得到了密码子优化的3种mRNA(WT、M1和M2)疫苗，并评估了本文的LNP具有较好的转胞吞能力和热稳定性。进一步研究了LNP/mRNA体系免疫小鼠后中产生的SARS-CoV-2RBD特异性IgG抗体滴度以及在多种冠状假病毒和真病毒中的中和抗体活性，结果证明野生型RBD的mRNA疫苗(WT)表现出较高的抗体滴度，且随着第2针免疫时间间隔的延长，所有mRNA疫苗组抗体滴度都有逐渐升高的趋势。在假病毒的中和实验中，突变RBD mRNA疫苗(M1、M2)在小鼠体内产生的中和抗体对新冠原始毒株的中和效果弱于WT疫苗，但对SARS-CoV-2Omicron BA.5突变株、SARS-CoV(2003)、蝙蝠来源的新型SARS样病毒WIV1-CoV的中和效果优于野生型RBD疫苗。在真病毒SARS-CoV-2原始株与Omicron BA.5抗体中和实验中，3款mRNA疫苗表现出了与中和假病毒类似的趋势。在整体结合抗体滴度下降的情况下，糖基化修饰的mRNA疫苗表现出了对突变株以及其他冠状病毒株更高的中和活性。最后通过H&E证明了该体系具有良好的安全性，本文为可电离脂质体用于mRNA的高效递送及冠状病毒通用型mRNA疫苗的设计提供了新的思路和理论依据。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。