紫丹参甲素在制备AMPK激动剂中的应用

技术领域

本发明涉及医药制剂技术领域，特别涉及紫丹参甲素在制备AMPK激动剂中的应用。

背景技术

内皮功能障碍是心血管疾病发生和进展的重要环节之一。因此，尽早改善血管内皮功能是预防和管理高血压等心血管疾病的有效措施。

单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种高度保守的多底物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它主要参与了细胞和整个器官的代谢调节。同时，研究表明，AMPK在心血管保护方面同样发挥了关键作用。在高血压病和肺动脉高压方面：研究发现平滑肌细胞特异性敲除AMPK能诱导肺动脉高压(Nat Commun.2022；13(1):5034.)。二甲双胍能通过激活AMPK抑制肺动脉高压的发展(Eur J Pharmacol.2023；946:175579.)饥饿素具有激活AMPK的作用，能通过激活AMPK抑制血管紧张素II诱导的血压升高(Clin ExpHypertens.2023；45(1):2208774.)。在心室重构方面：基因敲除AMPK能加重心梗后的心肌纤维化(Basic Res Cardiol.2021；116(1):10.)，二甲双胍能通过激活AMPK抑制高血压病大鼠的心室重构(J Am Heart Assoc.2020；9(7):e015154.)。

紫丹参甲素(Przewaquinone A)提取自甘西鼠尾草，甘西鼠尾草又名大紫丹参、紫丹参、甘肃丹参。紫丹参甲素是甘西鼠尾草(紫丹参)中特有的成分，其他类型的丹参中并不含有紫丹参甲素。紫丹参甲素的药理学研究很少，有研究发现紫丹参甲素具有抑制血管新生的作用，活性强于其他的丹参成分(朱路平.甘西鼠尾草化学成分及其血管新生抑制活性的研究[D].昆明理工大学，2013.)。该课题组还申请了紫丹参甲素通过抑制血管新生治疗肝癌的专利(CN 102961384 B)。心血管活性方面仅有一篇文章报道了紫丹参甲素可以改善内皮依赖性的血管舒张功能(J Nat Prod.2008；71(11):1825-8.)。现有的出版物及现有技术中并未公开或暗示紫丹参甲素也能治疗高血压、肺动脉高压、心肌肥厚的相关内容，也未见报道其与AMPK的关系。

因为以上原因，若能提供紫丹参甲素在相应领域中的应用，对高血压、肺动脉高压、心肌肥厚相关疾病的预防和辅助治疗则具有重要意义。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

针对上述现有技术中存在的不足，提供紫丹参甲素在制备预防高血压、肺动脉高压和心肌肥厚药物中的应用。

本发明的技术方案：

作为本发明其中一个方面，本发明提供了紫丹参甲素在制备AMPK激动剂中的应用。

优选地，所述激动剂包括但不限于药物、保健品、功能食品、特殊医疗用途食品或其他生物制品，用于促进AMPK的激活。

优选地，所述激动剂为适用于口服或肠胃外给药的多剂型或单位剂型，包括但不限于片剂、粉剂、硬或软胶囊、悬液、可注射制品或乳液。

作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供紫丹参甲素在制备激活AMPK活性防治高血压的药品、保健食品中的应用。

优选地，所述高血压选自原发性高血压病、肺动脉高压、肾性高血压中的至少一种。

作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供紫丹参甲素在制备激活AMPK活性防治心肌肥厚的药品、保健食品中的应用。

优选地，所述心肌肥厚是选自肥厚型心肌病、扩张型心肌病、高血压心脏病、慢性心力衰竭中的至少一种。

作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供紫丹参甲素在激活Ang II诱导人脐静脉内皮细胞p-AMPKα、AMPKα表达中的应用，所述紫丹参甲素能提高AngII诱导的p-AMPKα、AMPKα表达降低。

有益效果：

紫丹参甲素能浓度依赖性地促进AMPK的激活，与AMPK有着较强的结合能力，具有稳定的结合性，可能是一种天然的新型AMPK激动剂；并且紫丹参甲素具有降低血压、抑制心肌肥大的作用；为今后开发紫丹参甲素的功能性食品用于预防高血压病、肺动脉高压、心肌肥厚等疾病提供了依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为紫丹参甲素对血管紧张素II导致的雄性C57BL/6小鼠心肌肥大的影响数据图，其中(A)小鼠左心室壁厚度；(B)小鼠右心室壁厚度；(C)小鼠心脏体重比；

图2为紫丹参甲素对血管紧张素II诱导雄性C57BL/6小鼠高血压模型血压的影响数据图，其中(A)小鼠收缩压；(B)小鼠舒张压；

图3为紫丹参甲素对血管紧张素II诱导人脐静脉内皮细胞p-AMPKα、AMPKα表达的影响数据图，其中(左图)紫丹参甲素对AngII诱导人脐静脉内皮细胞p-AMPKα、AMPKα表达的影响；(右图)p-AMPKα、AMPKα相对表达量；

图4为AMPK-紫丹参甲素络合物的三维晶体结构示意图；

图5为紫丹参甲素与AMPK结合分子动力学模拟结果示意图，其中(A)0-100ns的表面可视化模型；(B)重原子均方根偏差(RMSD)变化曲线；

图6为表面等离子共振成像结果示意图；

图中#、*均代表具有显著差异。

具体实施方式

以下将结合具体实施方案来说明本发明。需要说明的是，下面的实施例为本发明的示例，仅用来说明本发明，而不用来限制本发明。在不偏离本发明主旨或范围的情况下，可进行本发明构思内的其他组合和各种改良。

本发明所使用的化学试剂若无特殊说明，均为普通市售分析纯。实施例所使用紫丹参甲素的分子式为C

实施例1

紫丹参甲素抑制血管紧张素II(Ang II)诱导的小鼠心肌肥大实验

取50只小鼠(六周龄)，体重在22.5±2.5g之间，饲养条件为温度25±2℃，空气流通，自由饮水，光照/黑暗时间12h/12h，标准颗粒饲料。适应性喂养一周后，将小鼠随机分成生理盐水组(Control)、Ang II组(Ang II)、紫丹参甲素低剂量组(Ang II+紫丹参甲素10mg/kg)、紫丹参甲素高剂量组(Ang II+紫丹参甲素20mg/kg)、阳性对照组(缬沙坦10mg/kg)，每组10只。

向上述各组小鼠实验模型通过渗透压泵持续输注药物，组别和注射药物如表1所示，构建小鼠高血压病心肌肥厚模型。4周后对上述小鼠进行心脏超声检测心脏结构，结果如图1显示。

表1各组小鼠注射药物种类表

由图1可以看出，Ang II组的收缩末期左室后壁厚度(图1A)和舒张末期左室后壁厚度(图1B)均显著升高，不同剂量的紫丹参及缬沙坦(阳性对照)可以显著降低左室后壁厚度。心脏体重比(图1C)也显示相同的趋势，模型组的心脏体重比显著升高，不同剂量的紫丹参及缬沙坦可以显著降低心脏体重比。说明紫丹参甲素能够有效抑制Ang II诱导的心肌肥大症状。

实施例2

紫丹参甲素降低AngII诱导的雄性小鼠血压升高实验

取50只小鼠(六周龄)，体重在22.5±2.5g之间，饲养条件为温度25±2℃，空气流通，自由饮水，光照/黑暗时间12h/12h，标准颗粒饲料。适应性喂养一周后，将小鼠随机分成生理盐水组(Control)、Ang II组(Ang II)、紫丹参甲素低剂量组(Ang II+紫丹参甲素10mg/kg)、紫丹参甲素高剂量组(Ang II+紫丹参甲素20mg/kg)、阳性对照组(缬沙坦10mg/kg)，每组10只。

向上述各组小鼠实验模型通过渗透压泵持续输注药物，组别和注射药物如表1所示，构建小鼠高血压病高血压模型。4周后对上述小鼠进行无创血压检测小鼠血压，结果如图2显示。

由图看出，AngII组小鼠的血压显著升高，与对照组比较差异有统计学意义，不同剂量的紫丹参甲素和缬沙坦(阳性对照)能降低AngII诱导的雄性小鼠高血压的血压升高，说明紫丹参甲素能够有效降低Ang II诱导引起的的高血压症状。

实施例3

紫丹参甲素激活Ang II诱导人脐静脉内皮细胞p-AMPKα、AMPKα表达实验

分别取1μM、2μM、4μM紫丹参甲素预处理体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)2h后，加入10μM AngII共同刺激HUVECs10h，结果如图3显示。

由图看出，AngII显著降低人脐静脉内皮细胞p-AMPKα、AMPKα的表达，不同剂量的紫丹参甲素能激活AngII诱导的p-AMPKα表达降低。

实施例4

分子对接和分子动力学模拟探索AMPK-紫丹参甲素的相互作用实验

采用AutodockVina软件进行分子对接分析，采用YASARA软件进行分子动力学分析。我们首先采用分子对接技术进行分析，结果表明AMPK和紫丹参甲素之间的结合能为-7.8kcal/mol。AMPK-紫丹参甲素络合物的三维晶体结构如图4所示。接着通过分子动力学模拟，进一步研究了AMPK-紫丹参甲素复合物的稳定性。AMPK-紫丹参甲素复合物在0ns和100ns处的表面可视化模型如图5A所示。由结果可见，紫丹参甲素稳定地呈现在AMPK结合位点的中心，直到模拟结束。图5B显示了重原子均方根偏差(RMSD)的演变。AMPK的全部原子RMSD轨迹波动在

实施例5

等离子共振成像技术验证紫丹参甲素结合AMPK能力实验

采用表面等离子体共振成像(SPRi)验证AMPK与紫丹参甲素之间的结合能力。通过预先配制好的AMPK重组蛋白(购自promega公司，0.58μg/ml)在3D葡聚糖芯片进行点样后，将芯片插入传感器表面，并通过泵注入不同浓度(2.5、5、10和20μM)的紫丹参甲素药物溶液流动相。使用10mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.0)作为再生缓冲液。所有测量值均在22℃下以120μl/min的流速记录。

使用BIA评估软件(GE医疗3.0版)获得动力学曲线并计算平衡解离常数(KD)。图6是AMPK与紫丹参甲素之间的结合解离曲线，其动力学参数KD＝1×10

由上述实验可知，紫丹参甲素能浓度依赖性地促进AMPK的激活，与AMPK有着较强的结合能力，具有稳定的结合性，可能是一种天然的新型AMPK激动剂；并且紫丹参甲素具有降低血压、防治肺动脉高压并抑制心肌肥大的作用，激活Ang II诱导人脐静脉内皮细胞p-AMPKα、AMPKα表达；为今后开发紫丹参甲素的功能性食品用于预防高血压病、肺动脉高压、心肌肥厚等疾病提供了依据。

本发明还可以由其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。