一种藻油的提纯方法

本申请是申请日为2018年07月26日、申请号为CN201810837473.5、发明名称为一种新的藻油提纯法的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种藻油的提纯方法。

背景技术

多不饱和脂肪酸(PUFA)，例如ω-3脂肪酸，对于人类健康有着非常的意义。ω-3脂肪酸，例如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，可以降低血液中甘油三酯的量。这些多不饱和脂肪酸也具有心血管保护功能，可以防治炎症、神经退行性疾病，促进认知功能等(Sugano,Michihiro,Balanced intake of polyunsaturated fatty acids for healthbenefits.J.Oleo Sci.2001,50(5):305-311)。更有研究表明，EPA，而非DHA，是发挥上述作用的主要成分(Martins JG.EPA but not DHA appears to be responsible for theefficacy of omega-3long chain polyunsaturated fatty acid supplementation indepression:evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials.J AmColl Nutr.2009Oct；28(5):525-42.；Eclov JA et al.,EPA,not DHA,prevents fibrosisin pressure overload-induced heart failure:potential role of free fatty acidreceptor 4.J Lipid Res.2015Dec；56(12):2297-308.doi:10.1194/jlr.M062034.Epub2015Oct 4)。

ω-3脂肪酸通常来源于海鱼。然而，随着鱼类资源的减少、环境造成的鱼体污染物富集等问题的出现，且越来越多的人奉行素食主义，对于植物来源ω-3脂肪酸的需求越来越大。在植物资源中，藻类多不饱和脂肪酸显示出巨大的潜力，不管是作为膳食补充剂还是作为药物使用。藻类的优势在于，藻类种植所占用的面积要小于一般陆地作物，并且可以广泛地运用海水或淡水资源。

但是使用乙醇从藻类提取的藻油，由于乙醇的低选择性，藻油含有大量的杂质，包括盐、碳水化合物、蛋白、和色素等。这些杂质的存在，加上藻油中的ω-3脂肪酸主要以甘油三酯、糖脂和磷脂三种形式存在，使得藻油十分粘稠，对后续的提纯和浓缩都造成极大的障碍，同时使得藻油的外观感受也变得很差。在大规模的工业化生产中，一般通过转酯化反应，将上述的甘油三酯、糖脂和磷脂转化为流动性更好的乙酯形式，再进行后续的纯化和浓缩。如果需要的话，纯化浓缩后的乙酯化ω-3脂肪酸经转酯反应再转化回甘油三酯等天然形式。

发明内容

本公开是有鉴于上述现有技术的状况而提出的，其目的在于提供一种能够提高所含的多不饱和脂肪酸的纯度的藻油的提纯方法。具体地，本发明提供一种藻油的提纯方法，包括：

1)使藻油在油脂吸附剂的存在下与醇-水溶液接触，其中，所述醇-水溶液中的醇与水的体积比为1:5至1:1以使所述藻油与所述醇-水溶液接触后成油滴状分布；

2)从醇-水溶液中分离油脂吸附剂；并且

3)从油脂吸附剂上分离藻油。

在本公开所涉及的提纯方法中，藻油在醇与水体积比为1:5至1:1的醇-水溶液中呈油滴状，工作流动性得以改善，并且能与醇-水溶液充分接触，通过吸附于油脂吸附剂而与醇-水溶液分离，能更好地除去水溶性杂质。经本提纯方法纯化后，藻油的流动性得到很大改善，且能够提高所含的多不饱和脂肪酸的纯度。

另外，在本公开所涉及的提纯方法中，可选地，所述藻油为用乙醇处理天然干藻提取出的粗藻油或乙醇提取后经低级醇转酯化所获得的酯化藻油。

另外，在本公开所涉及的提纯方法中，可选地，所述醇-水溶液中的醇与水的体积比为1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。在这种情况下，藻油与所述特定比例的醇-水溶液接触，呈油滴状分布，从而使得藻油与醇-水溶液接触的面积增加，由此，能够使藻油中所含的水溶性杂质更好地进入醇-水溶液。

另外，在本公开所涉及的提纯方法中，可选地，所述油脂吸附剂选自纸巾或活性炭。

另外，在本公开所涉及的提纯方法中，可选地，藻油与纸巾的重量比为1:1-10:1。

另外，在本公开所涉及的提纯方法中，步骤2)可以通过过滤或者离心来收集油脂吸附剂而实现。

另外，在本公开所涉及的提纯方法中，可以在收集所述油脂吸附剂之后，用水洗涤所述油脂吸附剂以去除水溶性杂质。

另外，在本公开所涉及的提纯方法中，可选地，在步骤1)之前，室温下使所述藻油与稀酸接触，加入碳酸钙、氢氧化钙或氢氧化钠中和酸，沉淀物通过过滤或者离心除去。在这种情况下，通过使某些类别的杂质与藻油中的有效成分如脂肪酸分开，从而能够更好地去除杂质。

另外，在本公开所涉及的提纯方法中，可选地，所述藻油与所述稀酸在低级醇的存在下接触。

此外，在本公开所涉及的提纯方法中，可选地，所述醇-水溶液选自甲醇-水溶液、乙醇-水溶液、丙醇-水溶液、或其组合。

根据本公开所涉及的提纯方法，通过将藻油置于特定比例的醇-水溶液中，使藻油成油滴状分布，增加藻油的工作流动性，并增加其与醇-水溶液的接触面积，使水溶性杂质更好地溶于醇-水溶液中；而后通过使藻油吸附于油脂吸附剂，并经过滤或离心等方式使油脂吸附剂与醇-水溶液分离，达到充分去除藻油中水溶性杂质的效果。这种方法不仅适用于多不饱和脂肪酸以甘油三酯、糖脂和磷脂形式存在的天然藻油，也适用于经甲醇或乙醇等低级醇转酯化反应得到的酯化藻油。经本发明的方法处理后，藻油中总的脂肪酸，特别是有用的多不饱和脂肪酸如EPA的含量提高，且藻油的流动性得到很大的改善。

具体实施方式

经乙醇从微藻类中提取的藻油中含有大量的杂质，包括盐、碳水化合物、蛋白、和色素等，且藻油中的脂肪酸主要以甘油三酯、糖脂和磷脂三种形式存在。上述两个因素的叠加，使得藻油呈现粘稠的近固体状，对后续的纯化和浓缩等造成一定的困难。

本发明的发明人发现，当将藻油置于醇与水的体积比为1:1以下的醇-水溶液中时，近固体状的藻油将呈现为油滴状，使操作中的流动性得到改善，且藻油与醇-水溶液的接触面积增大，可以使藻油中的水溶性杂质更好地溶于醇-水溶液。这使得不经过转酯化而直接高效地纯化藻油成为可能，大大减少了纯化工艺的流程和成本。

通过在醇-水溶液中加入油脂吸附剂，例如纤维素制品如纸巾、或活性炭等，藻油中的EPA等脂肪酸会吸附于油脂吸附剂。经过滤或离心收集油脂吸附剂，则实现藻油有效成分如多不饱和脂肪酸与醇-水溶液以及醇-水溶液中所含的水溶性杂质的分离。在除去大量的杂质后，藻油的流动性得以改善，且多不饱和脂肪酸的纯度提高。较好的流动性意味着藻油中油脂的纯度高，且给藻油产品带来较好的外观感受。

本发明的方法同样适用于经甲醇或乙醇等低级醇转酯化处理后的酯化藻油。酯化的藻油在醇水体积比为1:1以下的醇-水溶液中也呈现油滴状，可以进一步增加藻油的工作流动性，并增加藻油与醇-水溶液的接触面，更好地除去水溶性杂质。

用乙醇处理干藻，可以提取出藻油，本领域技术人员可以根据需要调整提取参数。在一个实施方式中，将含水量5wt％以下的干藻置于无水乙醇中，水浴80℃，转速为20rpm，处理2小时，其中干藻与无水乙醇的比可以为1:20g/mL。

乙醇提取的藻油可以通过以下方法步骤进行纯化：

1)任选地，使藻油与稀酸接触，并加入碳酸钙等来中和酸，沉淀物通过过滤或离心等方法除去；

2)使藻油在油脂吸附剂的存在下与醇-水溶液接触；

3)从醇-水溶液中分离油脂吸附剂；

4)任选地，用水洗涤油脂吸附剂；以及

5)从油脂吸附剂上分离藻油。

在乙醇提取的藻油中，存在有盐、碳水化合物、蛋白、和色素等杂质。向藻油加入低浓度的酸，可以使某些类别的杂质与藻油中的有效成分如脂肪酸分开，从而可以更好地去除杂质。低浓度的酸可以是稀硫酸、稀盐酸和稀硝酸等。盐酸和硝酸具有挥发性，盐酸的酸性太弱，而硝酸的残留会使得终产品中含有氮化合物。因此，稀硫酸为最佳的选择。为了使用足量的硫酸而同时避免过高浓度的出现，藻油可以在低级醇如乙醇存在下与硫酸接触，硫酸的工作浓度可以在0.01-0.1mol/L的范围内，例如在0.036-0.048mol/L的范围内。由于硫酸浓度低，加上温度的控制，即使有醇的存在，也不会发生多不饱和脂肪酸与低级醇的转酯化反应。加入的稀硫酸的原浓度也不宜过低，这样带入的水较多，为后续步骤中醇-水溶液的比例制定造成困难。在一个实施方式中，向含约100g藻油的4.5L乙醇液中加入45ml浓度为3.6mol/L的稀硫酸，常温，转速20rpm，处理2小时。在稀酸处理后，加入过量的碳酸钙、氢氧化钙等，来中和稀酸，中止酸的作用。不溶物可以通过过滤或离心除去。

在稀酸处理后，将藻油在油脂吸附剂的存在下与醇-水溶液接触，醇-水溶液中醇与水的体积比可以为1:1以下。当将藻油置于该醇-水体积比的醇-水溶液中时，藻油呈油滴状分布，从而使得藻油与醇-水溶液接触的面积增加，使藻油中所含的水溶性杂质更好地进入醇-水溶液，并且油滴逐渐吸附在油脂吸附剂中，之后通过物理方法使吸附剂与醇-水溶液分离，实现去除藻油中所含的水溶性杂质的效果。

步骤2)的藻油与醇-水溶液接触，可以在搅拌情况下进行例如2小时。醇-水溶液可以选自甲醇-水溶液和乙醇-水溶液。在醇-水溶液中，醇与水的体积比为1:1以下。在一些实施方式中，醇-水溶液中醇与水的体积比可以为1:1以下、2:3以下、或1:2以下，且为1:5以上、1:4以上、或1:3以上。在一些实施方式中，醇-水溶液中醇与水的体积比为1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。醇-水溶液中醇与水的体积比不宜过低，否则不利于乙醇的回收使用。因此，在实际操作中，可以将醇与水的体积比设在1:1-1:2的范围内。

藻油与醇-水溶液的比例应当在适当的范围内。当此比例过高时，可能会造成醇-水溶液不足以溶解所有的水溶性杂质；而当此比例过低时，会造成醇和水的用量过大，增加成本。以乙醇提取的粗藻油计，步骤2)中藻油与醇的重量体积比可以在0.2-0.4g/mL的范围内，例如0.225-0.354g/mL。由于藻油由乙醇提取，如果提取步骤不经乙醇去除而直接进入本发明的纯化步骤，则可能存在藻油与醇-水溶液的比例过低的问题，那么可以通过蒸馏等方法压缩乙醇的体积，然后根据压缩后乙醇的量来加入水。

油脂吸附剂可以为纤维素制品、或活性炭等，其种类和用量可以由本领域技术人员根据实际需要决定。在本发明中，纤维素制品可以为撕碎的纸巾，例如任何普通的家用纸巾。纤维素制品如纸巾中含有大量的纤维素，纤维素可吸附油脂而不溶于水及一般的有机溶剂，有利于藻油与醇-水溶液的分离。在一个实施方式中，藻油与纸巾的重量比可以在1：1-10：1的范围内的范围内。

吸附有藻油的油脂吸附剂可以通过过滤如减压过滤或离心从醇-水溶液中分离出。油脂吸附剂可以用水洗涤，进一步除去水溶性杂质。油脂吸附剂中所吸附的油脂可以溶解在无水乙醇中，通过过滤或离心等去除吸附剂，再通过蒸馏等方法去除无水乙醇，即可得到纯化的藻油。

如上所述，本发明的方法同样适用于经甲醇或乙醇等低级醇转酯化处理后的酯化藻油。经乙醇处理干藻而提取出的藻油，可以与低级醇在浓硫酸催化下于70℃进行转酯化反应。转酯化的条件可以由本领域技术人员根据实际情况设定。低级醇可以为甲醇、乙醇等，一般为乙醇。可以通过加入过量的碳酸钙等中和硫酸，中止酯化反应。

转酯化的藻油可以通过以下方法步骤进行纯化：

1)使转酯化的藻油在油脂吸附剂的存在下与醇-水溶液接触；

2)从醇-水溶液中分离油脂吸附剂；

3)任选地，用水洗涤油脂吸附剂；以及

4)使油脂从油脂吸附剂上分离。

在步骤1)中，将转酯化藻油在油脂吸附剂的存在下与醇-水溶液接触，醇-水溶液中醇与水的体积比可以为1:1以下。当将转酯化藻油置于该醇-水体积比的醇-水溶液中时，转酯化藻油呈油滴状分布，从而使得藻油与醇-水溶液接触的面积增加，使藻油中所含的水溶性杂质更好地进入醇-水溶液，并且油滴逐渐吸附在油脂吸附剂中，之后通过物理方法使吸附剂与醇-水溶液分离，实现去除转酯化藻油中所含的水溶性杂质的效果。该步骤可以在搅拌情况下进行例如2小时。醇-水溶液可以选自低级醇如甲醇或乙醇等的水溶液。在醇-水溶液中，醇与水的体积比为1:1以下。在一些实施方式中，醇-水溶液中醇与水的体积比可以为1:1以下、2:3以下、或1:2以下，且为1:5以上、1:4以上、或1:3以上。在一些实施方式中，醇-水溶液中醇与水的体积比为1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。考虑到乙醇的回收利用，醇与水的体积比可以设在1:1-1:2的范围内。

转酯化藻油与醇-水溶液的比例应当在适当的范围内。当此比例过高时，可能会造成醇-水溶液不足以溶解所有的水溶性杂质；而当此比例过低时，会造成醇和水的用量过大，增加成本。以乙醇提取的粗藻油计，步骤2)中藻油与醇的重量体积比可以在0.2-0.4g/mL的范围内，例如0.225-0.354g/mL。由于藻油由乙醇提取，如果提取步骤不经乙醇去除直接进入本发明的纯化步骤，则可能存在藻油与醇-水溶液的比例过低的问题，那么可以通过蒸馏等方法压缩乙醇的体积，然后根据压缩后乙醇的量来加入水。

油脂吸附剂可以为纤维素制品如纸巾、或活性炭等，其种类和用量可以由本领域技术人员根据实际需要决定。在一个实施方式中，油脂吸附剂为纤维素制品，例如纸巾，藻油与纸巾的重量比可以在1:1-10:1的范围内。

在步骤2)中，吸附有转酯化藻油的油脂吸附剂可以通过过滤如减压过滤或离心从醇-水溶液中分离出。

在步骤3)中，油脂吸附剂可以用水洗涤，进一步除去水溶性杂质。

在步骤4)中，油脂吸附剂中所吸附的转酯化藻油可以溶解在无水乙醇中，通过过滤或离心等去除吸附剂，再通过蒸馏等方法去除无水乙醇，即可得到纯化的转酯化藻油。

微拟球藻(Nannochloropsis salina)在开放池的人工海水中生长7天，人工海水含22g/L NaCl、2.44g/L MgSO

取1吨藻液，加入6M NaOH溶液，将pH调节至10.5，在此pH值下藻开始沉降。三小时后，弃上水层，将剩余物经孔径25μm的Miracloth滤布过滤，得到约1kg的藻泥，含水量为约80wt％。使用ZPG-G喷雾干燥机处理藻泥2小时，得到146g含水量5wt％以下的干藻。

含水量的测定方法如下：将藻泥或藻粉放在80℃烘箱中烘烤2小时以上，直至达到恒重；将放入烤箱前的重量和最后的恒重比较，算出含水量，含水量＝(烘烤前重量-恒重)/烘烤前重量*100％。

取实施例1制备的干藻250g(含有6.86wt％二十碳五烯酸(EPA)和18.50％总脂肪酸(TFA))，置于2.5L的94％乙醇中，在80℃水浴中处理2h，磁力搅拌器设置转速20rpm。之后，使用与抽吸泵连接的布式漏斗，用滤纸(孔径15-20μm，新星，定性滤纸)在减压(-0.1MPA)下进行过滤。滤出的藻体加入到2.5L的94％乙醇中，重复上述步骤。将两次的滤液合并，总体积为约4.5L，含有约106.2g粗藻油。

取上述滤液中的1.5L，置于旋转蒸发仪中70℃处理，直至冷凝器无液体出现。得到35.4g粗藻油，几乎没有流动性，含14.74wt％EPA和33.63wt％TFA。

取实施例2的滤液1.5L，加入15mL 3.6mol/L的稀硫酸，磁力搅拌器设置转速20rpm，室温下搅拌2h。加入10g CaCO

与未经纯化的藻油相比，本实施例中藻油的流动性大大提高，且多不饱和脂肪酸的纯度提高。

取实施例2的滤液1.5L，70℃旋转蒸发除去乙醇，得到35.4g粗藻油。向粗藻油加入70mL 100％乙醇和5mL 98％浓硫酸。磁力搅拌器设置转速20rpm，70℃转酯反应2h。向反应物加入20g CaCO

向反应液中加入乙醇，至总体积达到500mL，以方便后续的过滤。用滤纸(孔径15-20μm，新星，定性滤纸)过滤，得到约500mL的滤液。将滤液经旋转蒸发(70℃，-0.1MPA)浓缩至100mL。向得到的混悬液中加入5g纸巾(维达，各纸巾条大致长为2cm且宽1cm)。在磁力搅拌器20rpm的搅拌下，加入300mL水，搅拌持续2h。用滤纸(同上)在减压(-0.1MPA)下进行过滤，收集纸巾，用200mL水冲洗纸巾，除去水溶性成分。将冲洗后的纸巾置于200mL 100％乙醇中，用滤纸(同上)在减压(-0.1MPA)下进行过滤，得到滤液。将滤出的纸巾用100mL的100％乙醇冲洗，再次过滤。将两次的滤液合并，70℃旋转蒸发，得到12.5g纯化的脂肪酸乙酯，流动性较好，含38.65wt％乙酯化EPA和83.45wt％的乙酯化TFA。

与未经纯化的藻油相比，本实施例中藻油的多不饱和脂肪酸的纯度提高。

按照实施例1所述培养微拟球藻，并制备干藻。

由于光照等生长条件的变动，造成微藻的品质存在较大差异。具体而言，制备得到的干藻中含有的EPA和TFA量如表1所示。

表1.干藻中所含的EPA和TFA的量

取实施例5制备的干藻1-3各250g，分别加入5L无水乙醇，在80℃水浴中处理2h，磁力搅拌器设置转速20rpm。之后，使用与抽吸泵连接的布式漏斗，用滤纸(孔径15-20μm，新星，定性滤纸)在减压(-0.1MPA)下进行过滤，得到滤液各约4.5L，分别含有98.9g、78g和67.6g粗藻油，其所含的EPA和TFA如表2所示。

表2.未纯化的粗藻油中所含的EPA和TFA的量

取实施例6所得的4.5L滤液，藻1两份，藻2和藻3各一份。在各滤液中分别加入60mL、60mL、45mL和45mL3.6 mol/L的稀硫酸，磁力搅拌器设置转速20rpm，室温下搅拌2h。分别加入30g CaCO

表3.纯化藻油中所含的EPA和TFA的量

与未经纯化的藻油相比，本实施例中藻油的流动性大大提高，且多不饱和脂肪酸的纯度提高。

取实施例6所得的4.5L滤液，藻1两份，藻2和藻3各一份，70℃旋转蒸发，浓缩至500mL，加入14mL 98％浓硫酸，磁力搅拌器设置转速20rpm，70℃转酯反应3h。向反应物加入40g CaCO

用滤纸(孔径15-20μm，新星，定性滤纸)过滤，得到约500mL的滤液。将滤液经旋转蒸发(70℃，-0.1MPA)浓缩至300mL。向得到的混悬液中分别加入10g、15g、25g和15g纸巾(维达，各纸巾条大致长为2cm且宽1cm)。在磁力搅拌器20rpm的搅拌下，加入900mL、1500mL、1200mL和300mL的水。用滤纸(同上)在减压(-0.1MPA)下进行过滤，收集纸巾。用900mL的水冲洗纸巾，除去水溶性成分。将冲洗后的纸巾置于600mL的100％乙醇中，然后用滤纸(同上)在减压(-0.1MPA)下进行过滤，得到滤液。将滤出的纸巾用600mL的100％乙醇冲洗，再过滤。将两次的滤液合并，70℃旋转蒸发，得到37.5g、34.4g、50.4g和50.4g纯化的脂肪酸乙酯，流动性较好，其所含的EPA乙酯和TFA乙酯如表4所示。

表4.纯化的乙酯化藻油中所含的EPA乙酯和TFA乙酯的量

与未经纯化的藻油相比，本实施例中藻油的多不饱和脂肪酸的纯度提高。

取3000g实施例5制备的干藻4，加入24L无水乙醇，在80℃水浴中处理2h，磁力搅拌器设置转速20rpm。之后，使用与抽吸泵连接的布式漏斗，用滤纸(孔径15-20μm，新星，定性滤纸)在减压(-0.1MPA)下进行过滤，得到滤液约20L，含有930g粗藻油，其含有10.67wt％的EPA和60.37wt％的TFA。

取实施例9所得的20L滤液，在滤液中加入200mL3.6 mol/L的稀硫酸，磁力搅拌器设置转速20rpm，室温下搅拌2h。加入100g CaCO

与未经纯化的藻油相比，本实施例中藻油的流动性大大提高，且多不饱和脂肪酸的纯度提高。

称取0.100g实施例1或5中的干藻，置于50mL玻璃水解管(带盖)中，加入21mL氯仿甲醇混合液(2:1,v/v)，置于摇床200r/min震荡12h。将水解管从摇床取出，置于60℃水浴中，通入氮气吹干，然后加入10ml 5％硫酸甲醇溶液(95mL甲醇+5mL硫酸)，于100℃水浴1h。从水浴中取出水解管，冷却后，加入2mL正己烷，混合均匀，再加入适量去离子水，以将溶液分层。将上层有机相过0.22μm有机膜(尼龙，品牌：agilent)后装入进样瓶中，放入GC进样盘上，等待检测。

GC检测仪器为安捷伦7890B，FID检测器，色谱柱：安捷伦19091J-413HP-5 30m*0.32mm*0.25μm。进样体积：1μL，进样口温度：250℃，不分流。程序升温：60℃(0min)-270℃(31.25min)@8℃/min,保持5min，270℃(31.25min)-280℃(38.25min)@2℃/min,保持2min。检测器温度280℃,空气流量400mL/min，氢气燃气流量30mL/min，尾吹气流量31.5mL/min。

蒸馏去除可能存在的乙醇后，称取实施例2、3、6、7、9或10中的藻油0.05g，然后加入10mL 5％硫酸甲醇溶液，于100℃水浴1h。取出水解管，冷却后，加入5mL正己烷混合，再加入适量去离子水分层，将上层有机相过0.22μm有机膜后装入进样瓶中，放入GC进样盘上，等待检测。

使用上述相同仪器和参数进行成分测定。

蒸馏去除可能存在的乙醇后，称取实施例4或8中的藻油0.05g，然后用正己烷溶解，定容至10mL。过0.22μm有机膜后装入进样瓶中，放入GC进样盘上，等待检测。

使用上述相同仪器和参数进行成分测定。

本发明已经参照上述具体实施方式进行了描述，但是这些实施方式并不限制本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求限定。