岩藻黄质规模化生产方法

技术领域

本发明涉及微藻生物技术，尤其是一种使用密闭光生物反应器规模化培养富含岩藻黄质和二十碳链以上不饱和脂肪酸微藻的岩藻黄质规模化生产方法。

背景技术

岩藻黄质（Fucoxanthin）亦称褐藻素，为褐藻、硅藻、金藻及黄绿藻等所含有的光合色素，参与光系统Ⅱ（PhotosystemⅡ）合成。经过提取分离后可能得到红褐色的结晶，它是叶黄质的一种，是使褐藻类呈现出褐色的物质，可以说是褐藻类所特有的色素，有时也出现在硅藻类及其他藻类中。岩藻黄质有很明确的药用功效：①抗癌作用强；②具有强抗氧化性，是理想的饮食补充剂；③减肥效果明显，无任何毒副作用。

IUPAC命名：3'-(Acetyloxy)-6',7'-didehydro-5,6-epoxy-5,5',6,6',7,8-hexahydro-3,5'-dihydroxy-8-oxo-beta,beta-carotene

岩藻黄质分子结构为：

分子量：658.91

CAS号：3351-86-8。

目前，岩藻黄质规模化制备方法主要是从可食用褐藻，如裙带菜（翅藻科，

藻类不仅富含蛋白质、脂肪和碳水化合物这三大类人类所必需的物质，而且还含有各种氨基酸、维生素、抗生素、高级不饱和脂肪酸以及类胡萝卜素、叶黄素等其它多种生物活性物质，是人类向海洋索取食品、药品、生化试剂、精细化工产品、燃料以及其它材料的一种重要途径。近年来，利用海洋微藻制备岩藻黄质的技术受到广泛关注和研究，日本水产株式会社公开了一种岩藻黄质的制备方法以及用于制备岩藻黄质的微藻（WO2009130895A1，CN200980113805.4）；帝人株式会社也公开了一种利用褐指藻属、海链藻属和等鞭藻属的硅藻制备岩藻黄质的方法及从上述微藻中提取岩藻黄质的方法（JP2010233517）；此外，Sang Min Kim等人报道了利用三角褐指藻制备和提取高纯度岩藻黄质的方法（Appl. Biochem. Biotechnol. 2012, 166:1843–1855）。上述三篇文献所报道的藻种都具有一定的应用前景，但所报道的方法只适用于实验室内小规模培养，均未公开具体工业化生产岩藻黄质的方法和工艺。

近年来，随着人类对微藻认识的不断加深，开发和研制新型高效光生物反应器及其在微藻的高密度培养方面的应用研究已成为微藻生物技术的一个重要组成部分。光合自养微藻的大规模培养多采用开放池、封闭池或密闭光生物反应器。但是在开放式池和封闭式池中成功进行商业化培养的只有一些生长在极端环境中，如高盐、高碱和高营养条件等，不易被其它杂菌污染的藻种，如杜氏藻（

发明内容

本发明所要解决的就是目前适合开放式培养的微藻有限，产量低，不适合大规模培养的问题，提供一种使用密闭光生物反应器规模化培养富含岩藻黄质和二十碳链以上不饱和脂肪酸微藻的岩藻黄质规模化生产方法。

本发明的岩藻黄质规模化生产方法，其特征在于该规模化生产方法是在三级梯度管道式密闭光生物反应装置中完成，具体生产过程如下：

（1）室内藻种筛选纯化，实现无菌培养，利用平板划线法或抗生素法制备无菌藻株，无菌处理后的藻种接入灭菌培养液中，进行培养，培养过程中，光照强度10~2500 μmol·m

（2）将室内培养后进入指数生长期的微藻细胞接种于一级光生物反应器中，进行初级细胞扩繁，扩繁过程中，光照强度10~2500 μmol·m

（3）一级光生物反应器中的微藻细胞进入指数生长后期时，将其接种于二级光生物反应器中，进行室外细胞二级扩繁，扩繁过程中，光照强度10~2500 μmol·m

（4）经过二级扩繁后的微藻细胞进入指数生长后期时，将其接种于三级光生物反应器中，进行三级扩繁，扩繁过程中，光照强度为50-1800μmol·m

（5）完成一个批次微藻培养后，使用CIP清洗系统对培养系统的光生物反应器，供水、供气、接种、收获管路进行完全消毒，再经过清水漂洗后，进行下一批次培养。

所述的生物反应器包括三个光生物反应器、收获罐、消毒罐、接种管路和收获管路，三个光生物反应器顺序设置，分为一级光生物反应器、二级光生物反应器和三级光生物反应器，三个光生物反应器之间通过接种管路顺序连接，三级光生物反应器与收获罐之间通过收获管路连接，消毒罐与接种管路连接，为接种管路和光生物反应器进行CIP清洗消毒。

所述的光生物反应器上还设置有气体交换罐，在培养过程中，藻液在气体交换罐进行CO

所述的培养基采用F/2培养基。

所述的密闭光生物反应器培养的富含岩藻黄质微藻包括：鞭藻纲的等鞭藻属

所述的步骤（4）中，微藻中岩藻黄质含量的检测方法为：准确称取0.5 g经冷冻干燥的藻粉在室温条件下，用HPLC级的乙腈和UTTD分散机提取6分钟，再将分散处理好的乙腈提取液在超声条件下提取5分钟，在50 mL容量瓶中定容，取上述溶液10 mL置于离心管中，3500转离心5分钟，上清液用0.22 μm滤膜过滤，所得滤液用HPLC进行岩藻黄质含量的分析检测，色谱柱：Inertsil ODS-3（4μm, 150 x 4.6 mm I.D.），流动相：乙腈:水= 75:25（v/v），流速：1mL/min，UV检测波长：445 nm，柱温：30 °C。

所述的步骤（5）中，密闭管道式光生物反应器CIP清洗过程为：藻液完成收获后，从清洗消毒加液口向气体交换罐中加入消毒剂溶液，打开反应器CIP清洗控制阀，通过反应器传输泵对光生物反应器管路和气体交换罐进行循环消毒，消毒完成后用清洗漂洗。通过CIP消毒罐、CIP循环泵、接种管、收获管和收获罐形成封闭清洗循环回路，在接种前对反应器管路系统进行完全消毒灭菌。

由于微藻的生长特性，在生长初始阶段细胞浓度过低容易受到自然光胁迫而停止生长，在室外培养工程中为保证细胞的正常增殖通常需要增加藻细胞接种密度或增加光生物反应器的光通径。但光通径过大将导致指数增长末期细胞数和细胞干重较低，故普通一级培养工艺只适用于中试规模低密度培养微藻。通过三级梯度培养工艺技术，室外一级、二级反应器的接入细胞浓度设置为细胞生长曲线中指数增长期的初始浓度。通过优化配置各级光生物反应器，使一级、二级光生物反应器达到最大细胞密度，保证微藻细胞生长阶段达到最大产能。通过调整优化三级反应器的光通径和细胞密度，使之具备最佳的岩藻黄质积累条件。上述工艺同时实现了微藻细胞的快速增殖和岩藻黄质的高效积累，使产能大幅提高。

平板划线法是把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞，用接种环在平板表面上作多次由点到线的划线稀释而获得较多独立分布的单个细胞，并让其成长为单菌落的方法；可以通过反复划线分离，可获得微生物的纯种。而抗生素具有抑菌作用，采用抗生素纯化微藻，通常须考虑抗生素对微藻形态或生理、生化特性的可能影响，因此选用合适的抗生素是关键；理想的抗生素应具备两个特点，即抑菌活性强和差异毒力大；差异毒力愈大，愈有利于除去杂菌。

本发明的岩藻黄质规模化生产方法，使用密闭光生物反应器高密度规模化养殖富含岩藻黄质的微藻，实现微藻来源岩藻黄质的规模化生产，采用梯度放大培养工艺，通过逐级放大的方式大幅增加了密闭光生物反应器培养体积，有效提高细胞培养密度，并在三级反应器中优化了岩藻黄质的积累条件，所培养微藻中岩藻黄质含量可以达到细胞干重的2%或更高，培养条件稳定可控，光照面积与培养体积比高，光能和二氧化碳利用率高，实现微藻规模化无菌培养，生产高密度、高纯度的富含岩藻黄质的微藻。

附图说明

图1为三级梯度管道式密闭光生物反应装置结构示意图。

其中，消毒罐1，收获罐2，接种管路3，收获管路4，一级光生物反应器5，二级光生物反应器6，三级光生物反应器7。

具体实施方式

实施例1：一种岩藻黄质规模化生产方法，是在三级梯度管道式密闭光生物反应装置中完成，具体生产过程如下：

（1）室内藻种筛选纯化，实现无菌培养，利用平板划线法或抗生素法制备无菌藻株，无菌处理后的藻种接入灭菌培养液中，进行培养，培养过程中，光照强度10~2500 μmol·m

（2）将室内培养后进入指数生长期的微藻细胞接种于一级光生物反应器5中，进行初级细胞扩繁，扩繁过程中，光照强度10~2500 μmol·m

（3）一级光生物反应器中的微藻细胞进入指数生长后期时，将其接种于二级光生物反应器6中，进行室外细胞二级扩繁，扩繁过程中，光照强度10~2500 μmol·m

（4）经过二级扩繁后的微藻细胞进入指数生长后期时，将其接种于三级光生物反应器7中，进行三级扩繁，扩繁过程中，光照强度为50-1800μmol·m

（5）完成一个批次微藻培养后，使用CIP清洗系统对培养系统的光生物反应器，供水、供气、接种、收获管路4进行完全消毒，再经过清水漂洗后，进行下一批次培养；密闭管道式光生物反应器CIP清洗过程为：藻液完成收获后，从清洗消毒加液口向气体交换罐中加入消毒剂溶液，打开反应器CIP清洗控制阀，通过反应器传输泵对光生物反应器管路和气体交换罐进行循环消毒，消毒完成后用清洗漂洗。通过CIP消毒罐1、CIP循环泵、接种管、收获管和收获罐2形成封闭清洗循环回路，在接种前对反应器管路系统进行完全消毒灭菌。

生物反应器包括三个光生物反应器、收获罐2、消毒罐1、接种管路3和收获管路4，三个光生物反应器顺序设置，分为一级光生物反应器5、二级光生物反应器6和三级光生物反应器7，三个光生物反应器之间通过接种管路3顺序连接，三级光生物反应器7与收获罐2之间通过收获管路4连接，消毒罐1与接种管路3连接，为接种管路3和光生物反应器进行CIP清洗消毒。光生物反应器上还设置有气体交换罐，在培养过程中，藻液在气体交换罐进行CO

培养基采用F/2培养基。

密闭光生物反应器培养的富含岩藻黄质微藻包括：鞭藻纲的等鞭藻属

由于微藻的生长特性，在生长初始阶段细胞浓度过低容易受到自然光胁迫而停止生长，在室外培养工程中为保证细胞的正常增殖通常需要增加藻细胞接种密度或增加光生物反应器的光通径。但光通径过大将导致指数增长末期细胞数和细胞干重较低，故普通一级培养工艺只适用于中试规模低密度培养微藻。通过三级梯度培养工艺技术，室外一级、二级反应器的接入细胞浓度设置为细胞生长曲线中指数增长期的初始浓度。通过优化配置各级光生物反应器，使一级、二级光生物反应器6达到最大细胞密度，保证微藻细胞生长阶段达到最大产能。通过调整优化三级反应器的光通径和细胞密度，使之具备最佳的岩藻黄质积累条件。上述工艺同时实现了微藻细胞的快速增殖和岩藻黄质的高效积累，使产能大幅提高。