具有高细胞粘附性的聚合物细胞培养表面

技术领域

本技术通常涉及粗糙的或可选地亲水的塑料衬底(在本披露中有时称为接触表面)的表面或表面处理，或涉及使表面粗糙化且可选地具有亲水性并增强细胞对表面的粘附性的方法。更具体地，本技术涉及塑料衬底，例如医疗器械或实验室器具用品，具有经处理的接触表面，由于其增强的细胞粘附性而用作细胞培养和细胞生长的衬底。这样的医疗器械包括但不限于细胞培养容器和滚瓶。

本发明还涉及经等离子体处理的细胞生长和细胞培养容器以及塑料实验室器具。本发明进一步涉及例如通过等离子体处理提供的粗糙且可选地亲水的表面。本发明进一步涉及产生粗糙且可选地亲水的表面，其具有增强的细胞粘附性并由此改善细胞培养和细胞生长。

背景技术

尽管比如造血细胞系和转化细胞等一些细胞是在悬浮液(例如3D球形培养悬浮液)中生长的，但大多数其他细胞的生长倾向于高表面结合(例如单层生长)；也就是说，它们必须粘附在衬底上才能扩散。

表面亲水性有利于细胞粘附。传统上，玻璃器具存在亲水性表面，并且因此被使用并继续用于细胞培养和细胞生长。然而，玻璃器具容易破碎，非常昂贵，易于出现颗粒问题，由于玻璃的成分而产生重金属可提取物，并且能够对细胞生长和/或蛋白质及其他生物制剂的聚集造成不利影响。

通过用注塑模制塑料器具代替玻璃器具可以解决这些问题中的一些问题。在多种多样的应用中使用滚瓶作为细胞培养容器。滚瓶通常由聚苯乙烯(PS)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制成。这些材料存在优异的光学透明度、高稳定性、破裂减少以及许多其他优点。塑料器具解决了玻璃器具的一些问题，但塑料器具也会产生某些问题。

如上所述，认为高细胞粘附促进细胞生长。因此，在细胞生长容器中，期望的是增强细胞对与生物物质一起使用的塑料制品的粘附性。高接触表面积和亲水性有利于细胞粘附。常用的由聚合塑料制成的实验室器具组件的表面是光滑且疏水性的，通常不具有良好的细胞粘附性。这些问题限制了塑料器具用于细胞培养容器和滚瓶的用途。

因此，期望使用于细胞培养/细胞生长塑料容器的表面具有高接触表面积和亲水性并由此改善细胞粘附。

为了扩大接触表面，一些滚瓶被设计为在主体上具有周向肋状物、轴向肋状物或其他肋状物，这样可以增加生长表面。粗糙化是增加接触表面积的有效方法。当接触表面粗糙时，更多的接触表面积可用于细胞粘附。

为了产生有益于细胞生长的亲水性表面，使用了一些亲水性涂层，包括聚乙二醇(PEG)和两性离子聚合物涂层，它们提供了良好的细胞粘附性。这些聚合物涂层中的许多涂层都具有移动(溶解、分散)到流体有效负载中的可能性，从而导致干扰细胞生长或测试，限制了其实用性。

发明内容

因此，需要比如细胞培养容器或滚瓶等塑料实验室器具存在具有高表面积并且是亲水性的接触表面，这样将会增强细胞对塑料表面的粘附性。同样，需要这样的比如细胞培养容器和滚瓶等塑料实验室器具，其具有的稳定接触表面，这将会防止经处理的接触表面的材料运动，由此防止不期望的微粒干扰和塑料表面暴露。

当前发明通过提供一种具有接触表面的等离子体处理的塑料衬底来解决上述问题，该接触表面是粗糙的，具有较高氧含量且是亲水的，并且由此具有增强的细胞粘附性和细胞回收率。

本发明的一个方面是一种聚合物衬底，基本上由接触表面和内部部分组成，其中所述接触表面的粗糙度是通过以下四个参数中的至少一个进行量化的：

·表面积差A，大于0.055％，可选地从0.06％至2％，可选地从0.1％至1.5％，可选地从0.5％至1.2％，可选地从0.9％至1.1％；

·均方根表面斜率Sdq，大于1.9°，可选地从2°至20°，可选地从4°至15°，可选地从6°至12°，可选地从7°至10°，可选地从7°至9°；

·峰顶密度Sds，大于44.4/μm

·平均峰顶曲率Ssc，大于3.62/μm，可选地从4/μm至50/μm，可选地从6/μm至45/μm，可选地从8/μm至40/μm，可选地从10/μm至35/μm，可选地从12/μm至30/μm，可选地从14/μm至30/μm，可选地从16/μm至30/μm，可选地从18/μm至30/μm，可选地从20x/μm至25/μm；

其中，所述参数A、Sdq、Sds和Ssc是通过对所述接触表面上的5μm x 5μm的图像区域进行测量来确定的。

附图说明

在附图中，

图1是可用于对接触表面进行等离子体处理的等离子体处理装置的示意图。

图2是类似于图1的视图，示出了用于同时处理三个容器的等离子体处理装置。

图3是图1的装置的示意性剖视图，示出了该装置的内部细节以及用于对被处理容器的内部和外部压力进行平衡的附加特征。

图4示出了

图5示出了类似于图4的商业滚瓶的照片视图，该滚瓶在其壁的内部和外部具有多个周向肋状物，扩大了细胞附着的表面积。

图6示出了如在本说明书的示例2中提及的图5的CELLTREAT

图7A和图7B示出了可以用于封闭本发明的容器的无菌帽的两个示例。图7A示出了

图8是示例4中所述的样品A的俯视图20μm x 20μm x 70nm AFM图像。

图9是示例4中所述的样品B的俯视图20μm x 20μm x 70nm AFM图像。

图10是示例4中所述的样品A的立体(3D)视图20μm x 20μm x 70nm AFM图像。

图11是示例4中所述的样品B的立体(3D)视图20μm x 20μm x 70nm AFM图像。

图12是示例4中所述的样品A的俯视图2μm x 0.5μm x 20nm AFM图像。

图13是示例4中所述的样品B的俯视图2μm x 0.5μm x 20nm AFM图像。

图14是示例4中所述的样品A的立体(3D)视图2μm x 0.5μm x 20nm AFM图像。

图15是示例4中所述的样品B的立体(3D)视图2μm x 0.5μm x 20nm AFM图像。

图16是示例5中所述的样品A的俯视图5μm x 5μm x 20nm AFM图像。

图17是示例5中所述的样品B的俯视图5μm x 5μm x 20nm AFM图像。

图18是示例5中所述的样品A的立体(3D)视图5μm x 5μm x 20nm AFM图像。

图19是示例5中所述的样品A的立体(3D)视图5μm x 5μm x 20nm AFM图像。

在图中使用了以下参考字符：

相同的参考字符表示相对应的部分。

具体实施方式

术语“接触表面”表示处于与样品或其他材料接触的位置，并具有决定其与该样品或与其接触的其他材料的相互作用的表面特性的表面。接触表面的一些示例是容器的(例如，界定容器内腔的)表面或容器、片、块或其他物体的外部表面的一部分或全部。可选地，在用等离子体处理接触表面之前，接触表面由与内部部分相同的材料制成。

术语“内部部分”表示本体物品或涂层的一部分，该部分不是接触表面，而是形成该本体物品或涂层的内部的一部分。

如在任一实施例中提及的“等离子体”具有其在四种基本物质状态之一的物理学中的常规含义，其特征在于其组成颗粒的广泛离子化(通常为气态形式)和白炽(即它产生辉光放电，意味着它发光)。对于“直接”等离子体(与远程等离子体相反)，等离子体的大量离子和电子与经处理的物品表面直接接触。

对于所有实施例，经处理的接触表面被定义为已经如本说明书中所描述的进行了等离子体处理并且由于这种处理而表现出增强的细胞生长的接触表面。

贯穿本说明书使用的术语“容器”可以是适于容纳或输送液体、气体、固体或以上材料中的任何两种或更多种的任何类型的物品。容器的一个示例是具有至少一个开口(例如，根据应用是一个、两个或更多个开口)以及包括内部接触表面的壁的物品。

本披露涉及一种衬底，该衬底由聚合物制成并具有接触表面和内部部分。接触表面的粗糙度是通过以下四个参数中的至少一个进行量化的：

·表面积差A，大于0.055％，可选地从0.06％至2％，可选地从0.1％至1.5％，可选地从0.5％至1.2％，可选地从0.9％至1.1％；

·均方根表面斜率Sdq，大于1.9°，可选地从2°至20°，可选地从4°至15°，可选地从6°至12°，可选地从7°至10°，可选地从7°至9°；

·峰顶密度Sds，大于44.4/μm

·平均峰顶曲率Ssc，大于3.62/μm，可选地从4/μm至50/μm，可选地从6/μm至45/μm，可选地从8/μm至40/μm，可选地从10/μm至35/μm，可选地从12/μm至30/μm，可选地从14/μm至30/μm，可选地从16/μm至30/μm，可选地从18/μm至30/μm，可选地从20x/μm至25/μm；

其中，所述参数A、Sdq、Sds和Ssc是通过对所述接触表面上的5μm x 5μm的图像区域进行测量来确定的。

可选地通过上述四个值中的任何两个、或者上述四个值中的任何三个、或者所有上述四个值来对接触表面的粗糙度进行量化。

除接触表面之外，聚合物衬底还包括与接触相邻的内部部分。接触表面是在初始表面处理之后形成的。初始表面是在处理之前的表面。

可选地，在处理之后，内部部分的XPS原子组成比接触表面的XPS原子组成包含更少的氧和更多的碳。换句话说，在处理之后，接触表面比内部部分包含更多的氧。可选地，接触表面的XPS原子组成包含的氧比所述内部部分的XPS原子组成高从0.1原子％至30原子％、可选地从2原子％至30原子％、可选地从5原子％至20原子％、可选地从10原子％至20原子％、可选地从13原子％至16原子％。可选地，氧原子被接枝到接触表面中。可选地，接触表面的XPS原子组成包含从0.1原子％至20原子％、可选地从5原子％至15原子％、可选地从9原子％至12原子％的接枝有氧的碳原子。

可选地，该处理是使用RF作为功率的等离子体处理。可选地，至少在部分处理时间期间，将入口插入到衬底的内腔中。

可选地，接触表面的厚度是从0至20nm，可选地从0.1nm至10nm，可选地从0.2nm至1nm，可选地从0.2nm至0.7nm，可选地约0.6nm；并且其中接触表面是亲水的，并且与未处理的在其他方面相同的表面或生物涂层涂覆的表面或微波等离子体处理表面相比具有更高的细胞粘附性；并且内部部分基本上包含碳和氢原子。

可选地，接触表面的厚度小于0.6nm，并且内部部分的在0.6nm深度处的XPS原子组成包含从1％至10％的氧。

可选地，在处理之后，接触表面是亲水的并且接触角比未处理的接触表面的接触角更低。可选地，接触表面的接触角是从38°到62°，可选地是从50°到70°、可选地是从55°到65°、可选地是从60°到64°、可选地是从30°到50°、可选地是从30至40°、可选地是从35°到45°、可选地是从37°到41°。

可选地，衬底包括容器，该容器具有壁，该壁具有围成内腔的内表面、外表面、以及至少在内表面与外表面之间并与其间隔开的内部部分。可选地，容器可以是例如滚瓶、有棱纹的滚瓶、板、盘、烧瓶、瓶或管。可选地，衬底用于细胞生长。

可选地，衬底由包括以下材料的热塑性材料制成：烃聚合物，例如烯烃聚合物、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚甲基戊烯、聚苯乙烯、氢化聚苯乙烯、聚环己基乙烯(PCHE)或以上各项中的两种或更多种的组合；或杂原子取代的烃聚合物，例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚偏二氯乙烯(PVdC)、聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酯、聚乳酸、环氧树脂、尼龙、聚氨酯聚丙烯腈、聚丙烯腈(PAN)、离聚物树脂或以上各项中的任何两种或更多种的任何组合、复合物、共混物或层合物；可选地，聚苯乙烯。

可选地，衬底是用由RF产生的等离子体来处理的。可选地，接触表面是采用包括以下步骤的方法来处理的：使接触表面与工艺气体接触；然后在接触表面附近的工艺气体中引入射频(RF)电功率，以在与接触表面相邻的位置产生等离子体，由此形成具有经处理的接触表面的经处理的聚合物衬底。可选地，相对于初始接触表面，该处理有效地提高了经处理的接触表面的细胞回收率。可选地，细胞是鸡胚细胞培养物。该方法可选地提高了经处理的接触表面的鸡胚细胞培养物的细胞回收率，相对于初始接触表面，可选地导致经处理的接触表面的细胞回收率达至少132％，可选地从132％至300％，可选地从140％至250％，可选地从140％至230％。鸡胚细胞培养物的细胞回收率是通过以下过程确定的：将细胞培养物与含有小牛血清的DMEM培养基接触，将10mL所述细胞培养物和培养基放到1L滚瓶中或将20mL所述细胞培养物和培养基放到2L滚瓶中，在空气中具有5％的CO2下、在39℃下、在加湿腔室中以0.25rpm滚动该瓶48小时，使用胰蛋白酶与0.18mM EDTA来收集细胞，并且通过将所述样品与0.4％的台盼蓝混合并将其装载到BioRad细胞计数器中并进行记录来确定回收率。

可选地，等离子体是直接等离子体(与远程等离子体相反)。对于直接等离子体而言，等离子体的大量离子和电子与经处理的物品表面直接接触。可选地，工艺气体基本上不含水。可选地，在等离子体处理期间，通过将工艺气体输送穿过进气导管而使表面与工艺气体接触，该进气导管具有与初始接触表面相邻的出口。可选地，通过插入到容器中的进气口将气体引入容器中(如图1-3所示)。

工艺气体可选地可以是氮气、氧气或含有氮原子、氧原子或氮原子和氧原子的组合以及其他种类原子的非均相气体，例如惰性气体。合适的工艺气体的非限制性示例包括氧气、氮气、一氧化二氮气体、或这些气体中的任何两种或更多种的组合。

可选地，射频电功率被引入初始接触表面附近的工艺气体中，以在初始接触表面附近产生等离子体。结果，形成了具有经处理的接触表面的经处理的聚合物衬底。

可选地，相对于初始未处理表面的表面积差A2值，在处理之后，接触表面的表面积差A1值更高。可选地A1>2x A2，可选地A1>5x A2，可选地A1>10x A2，可选地A1>15x A2，可选地A1>20x A2，可选地A1>25x A2，可选地A1>30x A2，可选地A1>2x A2，可选地A1>35A2，可选地A1>40x A2，可选地A1>50x A2，可选地A1>60x A2，可选地A1>70x A2，可选地A1>80x A2，可选地A1>90x A2，可选地A1>100x A2，可选地A1>110x A2。

可选地，相对于2L的

可选地，相对于所述初始接触表面，在处理之后，接触表面提供的以与所述经处理的接触表面接触的方式生长并收获的鸡胚细胞培养物的回收率是至少132％，可选地是从132％至300％，可选地是从140％至250％，可选地是从140％至230％。

可选地，相对于所述初始接触表面，在处理之后，接触表面提供的以与所述经处理的接触表面接触的方式生长并收获的鸡胚细胞培养物的存活率是至少88％，可选地是从88％至99％，可选地是从88％至97％，可选地是从94％至96％。

令人惊讶的发现是，通过根据当前发明的等离子体处理所产生的接触表面的表面粗糙度、较高的氧原子组成和亲水性相结合以有效地增加细胞粘附性、细胞生长和细胞回收率。表面粗糙度的特征在于小颗粒状结构的高密度，其由以下粗糙度参数中的至少一个来进行量化：表面积差(A)、均方根表面斜率(Sdq)、峰顶密度(Sds)和平均峰顶曲率(Ssc)。

原子力显微镜(AFM)用于评估表面粗糙度。可以通过比如表面积差、均方根表面斜率(S

对于相同的衬底而言，这些参数可能会根据所获取的图像的大小而变化。为了比较两个表面的粗糙度，从每个样品获取的图像应具有相同的大小。

当前发明的衬底，在处理之后，其接触表面具有更高的表面积差值(A1)、更高的均方根表面斜率(Sdq)、更高的峰顶密度(Sds)或更高的平均峰顶曲率。本发明人还观察到，至少在某些情况下，与未处理的接触表面相比，经处理的接触表面具有更高的小颗粒状结构密度。尽管不希望受到该理论的准确性的束缚，但本发明人得出的理论是，与

A1

“成像面积”是假设完全平坦的研究区域的平面视图的面积。

“表面积”是成像区域的3维表面积，考虑到会增加表面积的与平面度的偏差。这是通过对整个图像中的3个相邻数据点形成的三角形的面积求和来计算的。

“表面积差”A是指表面积超过成像面积的量。它是以百分比表示并根据以下公式计算的：

表面积差＝100[(表面积/S

其中S1是扫描区域减去被阻带排除的任何区域的长度(和宽度)。

本披露还针对具有接触表面和内部部分的由聚合物制成的衬底。接触表面的粗糙度是通过以下四个参数中的至少一个进行量化的：

·表面积差A，可选地从1％至20％，可选地从5％至15％，可选地从10％至13％，可选地从11％至13％；

·均方根表面斜率(S

·峰顶密度(S

·平均峰顶曲率(Ssc)值，可选地从500/μm至800/μm，可选地从600/μm至800/μm，可选地从700/μm至800/μm；

其中，在表面上对2μm x 0.5μm的区域成像。

可选地通过上述四个值中的任何两个、或者上述四个值中的任何三个、或者所有上述四个值来对接触表面的粗糙度进行量化。

可选地，接触表面的表面积差A1大于未经处理的在其他方面相同的接触表面的表面积差A2，可选地A1>2x A2，可选地A1>5x A2，可选地A1>10x A2，可选地A1>15x A2，可选地A1>20x A2，可选地A1>25x A2，可选地A1>30x A2，可选地A1>2x A2，可选地A1>35A2，可选地A1>40x A2，可选地A1>50x A2，可选地A1>60x A2，可选地A1>70x A2，可选地A1>80x A2，可选地A1>90x A2，可选地A1>100x A2，可选地A1>110x A2。

Sdq

均方根表面斜率(Sdq)是对组成表面纹理的斜率的度量，在所有方向上进行评估。它包括幅度和间隔分量。

较低的Sdq值可能表示间距较宽的纹理分量。

可选地，在任一实施例中，接触表面的Sdq1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Sdq2，可选地Sdq1>2x Sdq2，可选地Sdq1>3x Sdq2(即Sdq1比Sdq2大三倍)，可选地Sdq1>4x Sdq2，可选地Sdq1>5x Sdq2，可选地Sdq1>6x Sdq2，可选地Sdq1>7x Sdq2，可选地Sdq1>8x Sdq2，可选地Sdq1>9x Sdq2，可选地Sdq1>10x Sdq2，可选地Sdq1>11x Sdq2。

峰顶密度(Sds)是每单位面积的峰顶数量。峰顶来自峰。在延伸跨过其所有8个最邻近点的连续点的直线阵列中，峰被定义为任何点。峰顶必须至少间隔开包括3D测量区域的最小“X”或“Y”尺寸的1％。另外，仅在高于平均平面最大高度5％的阈值之上发现峰顶。

可选地，在任一实施例中，接触表面的Sds1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Sds2，可选地Sds1>2x Sds2，可选地Sds1>3x Sds2，可选地Sds1>4x Sds2，可选地Sds1>5x Sds2，可选地Sds1>6x Sds2，可选地Sds1>7x Sds2，可选地Sds1>8x Sds2，可选地Sds1>9x Sds2，可选地Sds1>10x Sds2，可选地Sds1>11x Sds2，可选地Sds1>12x Sds2。

平均峰顶曲率(Ssc)是各种峰结构的平均峰顶曲率。针对每个峰顶评估Ssc，然后对该区域进行平均：

可选地，在任一实施例中，接触表面的Ssc1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Ssc2，可选地Ssc1>2x Ssc2，可选地Ssc1>3x Ssc2，可选地Ssc1>4x Ssc2，可选地Ssc1>5x Ssc2，可选地Ssc1>6x Ssc2，可选地Ssc1>7x Ssc2，可选地Ssc1>8x Ssc2，可选地Ssc1>9x Ssc2，可选地Ssc1>10x Ssc2，可选地Ssc1>11x Ssc2，可选地Ssc1>12x Ssc2。

Rq和Ra

RMS(Rq)是图像中的Z值(或RMS粗糙度)的标准差。它是根据以下公式计算的：

Rq＝√{Σ(Zi-Zavg)2/N}

Zavg是图像中的平均Z值；Zi是Z的当前值；N是图像中的点数。该值未针对图像平面中的倾斜进行校正；因此，对数据进行平面拟合或拉平将会更改这个值。

可选地，在任一实施例中，接触表面的Rq1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Rq2。

平均粗糙度(Ra)是表面相对于中心平面的平均值，并使用以下公式计算：

Ra＝[1/(LxLy)]∫0Ly∫0Lx{f(x,y)}dxdy

其中f(x,y)是相对于中心平面的表面，并且Lx和Ly是该表面的尺寸。

可选地，在任一实施例中，接触表面的Ra1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Ra2。

在处理之后，当前发明的衬底的接触表面具有高密度的小颗粒状结构，这导致更高的均方根表面斜率(S

氧种类

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101的内部部分103的XPS原子组成与经处理的接触表面102相比包含更少的氧和更多的碳。

可选地在任一实施例中，经处理的接触表面102的x射线光电子能谱法XPS原子组成是：

·从10％至25％的氧、从0％至5％的氮以及从70％至90％的碳；

·可选地，从15％至24％的氧、从0.1％至5％的氮以及从70％至80％的碳；

·可选地，从20％至24％的氧、从0.1％至1％的氮以及从70％至79％的碳。

由于XPS组成是通过一小段深度测量的，因此经处理的接触表面被处理为在衬底中具有轻微深度。为此目的，针对接触表面的相关XPS分析在5.8埃或约0.6nm的深度处测量其组成。可选地，在任一实施例中，内部部分和接触表面基本上由相同的聚合物组成，并且接触表面的XPS原子组成包含的氧比内部部分的XPS原子组成多从0.1原子％至30原子％、可选地从2原子％至30原子％、可选地从5原子％至20原子％、可选地从10原子％至20原子％、可选地从13原子％至16原子％。

可选地，在任一实施例中，接触表面组成是在深度从0至20nm、可选地从0.1nm至10nm，可选地从0.2nm至1nm，可选地从0.2nm至0.7nm，可选地约0.6nm处进行测量；并且可选地，接触表面是亲水的，并且与未处理的在其他方面相同的表面或生物涂层涂覆的表面相比具有更高的细胞粘附性。可选地，内部部分基本上包括碳和氢原子，如当其由烃制成时。作为另一选择，内部部分可包括相当比例的碳、氢和杂原子，例如氧、氮、硫、氯等。

可选地，在任一实施例中，接触表面的厚度小于0.6nm，并且经处理的聚合物衬底101的内部部分103在0.6nm深度处的XPS原子组成包含从1％至10％的氧。

可选地，在任一实施例中，接触表面的厚度小于1.2nm，并且经处理的聚合物衬底101的内部部分103在1.2nm深度处的XPS原子组成包含从0.5％至5％的氧。

可选地，在任一实施例中，接触表面的厚度小于1.7nm，并且经处理的聚合物衬底101的内部部分103在1.7nm深度处的XPS原子组成包含从0.3％至3％的氧。

可选地，在任一实施例中，接触表面的厚度小于2.3nm，并且所述经处理的聚合物衬底101的内部部分103在2.3nm深度处的XPS原子组成包含从0.1％至1％的氧。

可选地，在任一实施例中，接触表面的厚度小于2.9nm，并且经处理的聚合物衬底101的内部部分103在2.9nm深度处的XPS原子组成包含从0.1％至1％的氧。

可选地，在任一实施例中，接触表面的XPS原子组成包含接枝有氧的0.1至20原子％，可选地5至15原子％，可选地9至12原子％的碳原子。

可选地，在任一实施例中，接触表面包含从0.1原子％至20原子％、可选地从5原子％至15原子％、可选地从9原子％至12原子％的氢键受体基团。

可选地，在任一实施例中，如通过X射线光电子能谱法(XPS)测量的，接枝氧以选自C-O、CO

接触角

本发明中所述的处理增加了接触表面的亲水性。换句话说，该处理降低了接触表面与水的接触角。(除非另有说明，否则本说明书中提及的接触角均是相对于去离子水的。)据信较高的亲水性有益于细胞粘附和细胞生长。

可选地，在任一实施例中，接触表面的表面接触角是从38°到62°，可选地是从50°到70°，可选地是从55°到65°，可选地是从60°到64°，可选地是从30°到50°，可选地是从30至40°，可选地是从35°到45°，可选地是从37°到41°。

衬底

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101包括容器105，该容器具有壁106，该壁具有围成内腔108的内表面107、外表面109、以及在内表面107与外表面109之间并与其间隔开的内部部分103。除非本说明书中另有说明，否则内部部分103内的位置由它们距内表面107的距离来标识。可选地，内表面107是大致圆柱形的，并且可选地，经处理的接触表面102包括容器105的内表面107的至少一部分。

可选地在任一实施例中，容器105包括如图1、图2以及其他图所示的滚瓶。可选地，滚瓶包括限定了经处理的接触表面102的内表面107、接触表面102具有多个肋状物110。已经发现，在部分或全部接触表面102中(例如在滚瓶或其他容器105的细胞接触侧或端壁中)的肋状物或其他结构复杂性可用于增加接触表面102的表面积。可选地，在任一实施例中，容器105的体积容量是从1mL至100L，可选地是从100mL至5L，可选地是约1L，可选地是约2L。可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101可以包括板、盘、烧瓶、如图1和图3中的瓶、如图2中的管，或任何其他类型的实验室器具或生产设备。

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101包括可注塑模制的热塑性或热固性材料，例如热塑性材料，例如热塑性树脂，例如注塑模制的热塑性树脂。可选地，在任一实施例中，热塑性材料包括：烃聚合物，例如烯烃聚合物、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚甲基戊烯、聚苯乙烯、氢化聚苯乙烯、聚环己基乙烯(PCHE)、或以上各项中的两种或更多种的组合；或杂原子取代的烃聚合物，例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚偏二氯乙烯(PVdC)、聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酯、聚乳酸、环氧树脂、尼龙、聚氨酯聚丙烯腈、聚丙烯腈(PAN)、离聚物树脂、或以上各项中的任何两种或更多种的任何组合、复合物、共混物或层合物。可选地，在任一实施例中，热塑性树脂包括聚苯乙烯，其通常用于许多实验室器具应用，包括滚瓶、微孔板、培养皿等。

可选地，在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101包含聚苯乙烯。

处理过程

可选地，接触表面是采用包括以下步骤的方法来处理的：使接触表面与工艺气体接触；然后在接触表面附近的工艺气体中引入射频微波或其他电功率，以在与初始接触表面相邻的位置产生等离子体，由此形成具有经处理的接触表面的经处理的聚合物衬底。可选地，相对于初始接触表面，该方法是在有效改善鸡胚细胞培养物从经处理的接触表面获得的细胞回收的条件下进行的。

在任一实施例中，所述处理包括以下步骤：(a)提供具有接触表面的衬底，例如容器；(b)在接触表面附近抽真空；(c)在接触表面附近提供包含O2、可选地包含氮的气体；并且(d)从气体中产生等离子体，从而形成经处理的接触表面。所形成的接触表面是高度细胞结合表面。

可选地，如果衬底是滚瓶或其他容器，则在步骤(c)中，则可选地通过插入容器中的进气口将气体引入容器中(如图XX所示)。可选地，在本实施例中，RF用于产生等离子体。

令人惊讶的是，已经发现，将RF功率与使用进气口将气体混合物引入容器中相结合，在增强细胞生长实验的结果方面提供了很大的优势。结果优于未涂覆的在其他方面相同的表面，并且还优于康宁CellBIND

相对于微波源，使用RF功率存在几个优点：由于RF在更低的功率下运行，所以衬底/容器的加热更少。因为本发明的焦点是塑料衬底的等离子体表面处理，因此期望更低的加工温度，以防止衬底的熔化/变形。更高频率的微波还可能引起塑料衬底中的挥发性物质(像残留水、低聚物以及其他材料)的放气。这种放气可能干扰处理。

参照图1-3，通常可以通过以下方式来实施本方法：提供包括初始接触表面102的聚合物衬底101，使初始接触表面102与工艺气体104(在图1中示为气体源，以及图1和图3中的容器中的气体))接触，并且在工艺气体104中引入射频、微波或其他产生等离子体的电功率，从而形成经处理的接触表面102，该接触表面与未处理的接触表面102相比具有提高的回收率。

可选地在任一实施例中，除了初始接触表面102之外，聚合物衬底101还包括与初始接触表面102相邻的内部部分103。

可选地在任一实施例中，工艺气体104可以是氮气、氧气、或含有氮原子、氧原子或氮原子与氧原子的组合以及其他种类原子的非均相气体。合适的工艺气体104的非限制性示例包括氧气、氮气、一氧化二氮气体、或这些气体中的任何两种或更多种的组合。可选地，工艺气体104可以包括载气，例如惰性气体，例如氦气、氖气、氩气、氪气或氙气或这些气体中的任何两种或更多种的混合物。

可选地，在任一实施例中，在初始接触表面102附近的工艺气体104中引入射频或微波电功率，以在初始接触表面102附近形成等离子体。结果，形成了具有经处理的接触表面102的经处理的聚合物衬底101。

可选地在任一实施例中，工艺气体104包含氧原子、氮原子、或氧原子和氮原子两者，并且优选地包含氧、氮、一氧化二氮、或其中的任何两种或更多种的组合。可选地在任一实施例中，工艺气体104基本上不含水。

可选地在任一实施例中，本方法通过使接触表面102与工艺气体104接触来实施。这可以通过例如将工艺气体104输送通过进气导管111来完成，该进气导管具有与初始接触表面102相邻的出口112。

可选地，在使用射频能量的任一实施例中，用于产生等离子体的RF电功率的频率可以是从1Mhz至50Mhz，可选地是13.56MHz。可选地在任一实施例中，用于激发所述等离子体的电功率是从1瓦特到1000瓦特，可选地是从100瓦特到900瓦特、可选地是从50瓦特到600瓦特、可选地是从200瓦特到700瓦特、可选地是从400瓦特到600瓦特、可选地是从100瓦特到500瓦特、可选地是从500瓦特到700瓦特、可选地是从1瓦特到100瓦特、可选地是从1瓦特到30瓦特、可选地是从1瓦特到10瓦特、可选地是从1瓦特到5瓦特。

可选地，在使用射频功率的任一实施例中，射频电功率可以至少部分地由通常包围初始接触表面102的外部施加器113引入。可选地在任一实施例中，射频电功率至少部分地由至少部分地位于内腔108内的内部施加器114引入。可选地在任一实施例中，至少部分地位于内腔108内的内部施加器114进一步包括进气导管111，用于使初始接触表面102与工艺气体104接触。

可选地在任一实施例中，如图1所展示的装置可以用于对容器105的初始接触表面102进行处理。图1和图3示出了容器105的示例，该容器被配置为滚瓶。在图4-6中示出了典型的1L或2L容量的滚瓶的更好的视图。

本说明书中提及的滚瓶或其他容器的容量并不一定表示将其完全充满所需的流体的量。这种容器的指定容量通常允许当容器被填充到其容量时有顶部空间。例如，在滚瓶中，当细胞在容器中生长时，该瓶被侧放并通过机械装置滚动，使得附着于接触表面102的细胞交替地穿过该瓶的顶部空间和比如生长培养基等液体内容物，从而促进生长。

滚瓶或其他容器105具有壁106，该壁具有围成内腔108的内表面107以及外表面109。容器壁106具有在内表面107与外表面109之间并与其间隔开的内部部分103。至少一部分和可选地全部内表面107限定了接触表面102，该接触表面或者被称为当前处理之前的初始接触表面，或者被称为当前处理之后的经处理的接触表面。接触表面102是根据本披露处理的内表面107的任何部分。

图1、图2或图3所示的装置适用于根据任一实施例对容器105进行处理，尽管还可以使用其他装置。此装置可以包括图1和图2所示的圆柱形陶瓷腔室115，具有铝制底部116和铝制盖子117(其在使用过程中是关闭的，但在图x中显示为打开的，因为它可以在装载或卸载时打开)。腔室115的直径可以是大约12英寸(30cm)，并且深度可以是大约8英寸(20cm)，但是还可以使用任何其他合适的尺寸替代。

可选地通过阀121控制的将真空导管119递送至真空泵120的腔室115的泵送口118可以位于铝制底部116处，并且直径可以是大约4英寸(10cm)，其中直径为1/2英寸(12mm)的进气导管111同心地通过泵送口118伸到加工区域122中。等离子体屏幕(未示出)可以安装在泵送口118的上方，并且可以由铜网和钢丝棉构成。工艺气体104可以经由腔室115下方的气体系统123递送到进气导管111。质量流量控制器如124可以用于压缩工艺气体104。

陶瓷腔室115可以具有铜制外部施加器113，其可以同心地缠绕在腔室115外部，并且可以是大约7英寸(18cm)高。外部施加器113可以连接到

图2中所示的用于处理容器105的装置可以与图1中的装置相同，但是如图所展示的具有多于一个的进气导管111，以在单个处理循环中容纳多于一个的容器105。

图1或图2所示的装置可选地包括如图3所示的真空旁路管线128。

可选地在任一实施例中，被配置为烧瓶、瓶或管的实验室器具可以在类似于图1-3的装置中进行加工。

可选地在任一实施例中，被配置为板、微孔板、盘或其他具有相对平坦的待处理的外部表面的物体的实验室器具可以在类似于图1-3但适于处理更平坦的工件的装置中进行加工。可选地，在任一实施例中，如在此展示的陶瓷腔室115的内部可以如WO 2016/176561的图6所示进行调整，以在如本说明书所述的处理过程中支撑多个微孔板或其他相对平坦的物体。可选地在任一实施例中，微孔板或其他平坦物体可以被定向成使得待处理的表面面向陶瓷腔室115的中心，从而便于将等离子体激励气体直接施加到所呈现的用于处理的表面。

在任一实施例中，等离子体是直接等离子体。不限于该假设，由于离子与表面的直接相互作用，直接等离子体在使表面粗糙化方面比远程等离子体更有效。

与康宁相比

可选地，相对于2L的

可选地，在根据当前发明的处理之后，接触表面的表面积差A大于0.055％，可选地从0.06％至2％，可选地从0.1％至1.5％，可选地从0.5％至1.2％，可选地从0.9％至1.1％；其中，A是通过测量接触表面上的5μm x 5μm的图像区域来确定的。

可选地，在处理之后，接触表面的Sdq1大于相同尺寸的Cellbind滚瓶的接触表面的Sdq2，可选地Sdq1>2x Sdq2，可选地Sdq1>3x Sdq2，可选地Sdq1>4x Sdq2。

可选地，在处理之后，接触表面的Sds1大于相同尺寸的Cellbind滚瓶的接触表面的Sds2，可选地Sds1>2x Sds2，可选地Sds1>3x Sds2，可选地Sds1>4x Sds2。

可选地，在处理之后，接触表面的Ssc1大于相同尺寸的Cellbind滚瓶的接触表面的Ssc2，可选地Ssc1>2x Ssc2，可选地Ssc1>3x Ssc2，可选地Ssc1>4x Ssc2，可选地Ssc1>5xSsc2，可选地Ssc1>6x Ssc2，可选Ssc1>7x Ssc2。

细胞粘附和细胞生长

可选地，本发明的衬底用于细胞生长，并且这些细胞在生长过程完成后被收获或回收。

可选地，衬底是使用RF等离子体根据一个实施例进行处理的。在处理期间，通过插入衬底或与处理表面邻近的入口引入工艺气体。这种处理产生高密度的小颗粒状结构特征，其增加了高表面积和高粗糙度，这些特征是通过高均方根表面斜率(Sdq)、峰顶密度(Sds)和平均峰顶曲率(Sdc)中的至少一个来量化的。细胞粘附是通过细胞与接触表面之间的相互作用而发生的，高接触表面积有利于细胞粘附。

许多聚合物表面(例如聚苯乙烯表面)是疏水的，其不利于细胞粘附。可选地，根据任一实施例的处理将更多的氧原子结合到接触表面中，这增加了表面的亲水性。亲水性和表面上的高氧含量是认为会增强细胞粘附力的特性。

令人惊讶的发现是，接触表面的表面粗糙度、更高的氧原子组成和亲水性(其中每一项可以可选地通过本说明书中所述的等离子体处理产生)可以结合以有效地增加细胞粘附性、细胞生长和细胞回收率。表面粗糙度的特征在于小颗粒状结构的高密度，其由以下粗糙度参数中的至少一个来进行量化：表面积差(A)、均方根表面斜率(Sdq)、峰顶密度(Sds)和平均峰顶曲率(Ssc)。

可选地，对于经生物涂层处理的衬底，回收率高于在其他方面相同的衬底。可选地，回收率高于康宁(Corning)

可选地，如果衬底被实施为容器，则该容器进一步包括封闭件。封闭件可以是任何类型的。例如，封闭件可以是任何塞子、帽、盖子、顶部、软木塞或它们的任意组合。例如，可以将塑料或弹性体塞子插入帽中以形成封闭件。

细胞生长需要无菌环境。经常打开和关闭细胞培养/生长容器的帽是污染源之一。可选地，细胞培养/生长容器(例如滚瓶)可以用无菌转移帽封闭，以防止在培养基进料、接种、样品添加/收集、转移等过程中由于打开和关闭帽而造成的污染。可选地，封闭件适用于无菌过程，可选地在高温、低温、高压灭菌、辐射或任何其他不寻常条件下。例如，该封闭件可以是具有其他附件的无菌转移帽，以消除在细胞培养/生长过程中打开帽的需要。可选地，封闭件可以是

可选地在任一实施例中，相对于初始接触表面102，以与经处理的接触表面102接触的方式生长并收获的鸡胚细胞培养物的存活率是至少88％，可选地是从88％至99％、可选地是从88％至97％、可选地是从94％至96％。根据细胞培养、细胞收获和回收方案以及示例1进行细胞培养测试。

可选地，在任一实施例中，相对于初始接触表面102，以与经处理的接触表面102接触的方式生长并收获的鸡胚细胞培养物的回收率可以是至少132％，可选地是从132％至300％、可选地是从140％至250％、可选地是从140％至230％。根据细胞培养、细胞收获和回收方案以及示例1进行细胞培养测试。

相对于初始接触表面102，该方法可选地提高了鸡胚细胞培养物的从经处理的接触表面102获得的细胞回收率，导致从经处理的接触表面102获得的细胞回收率至少是在细胞回收测试开始时提供给经处理的接触表面102的细胞的140％。根据细胞培养、细胞收获和回收方案以及示例1进行细胞培养测试。

细胞还可以在微载体表面上生长，这是也使接触表面积增加的另一种类型的衬底。微载体是允许粘附细胞生长的支撑基质。微载体通常是125-250微米的球(珠)，并且其密度允许它们在轻柔搅拌下保持悬浮在培养基中。微载体或珠可以由许多不同的材料制成，包括DEAE葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、胶原以及藻酸盐。这些微载体或珠的材料与不同的表面化学性质一起可以影响细胞行为，包括形态和增殖。使用微屏障(或珠)技术有许多优点，例如需要更少的培养基和更少的实验室器具。

虽然增强细胞粘附性和细胞生长很重要，但在生长过程完成后收获细胞并保持细胞质量通常也很重要。可选地，当使用微载体时，可以认为细胞收获是包括两个步骤：首先，将细胞从微载体分离，以产生细胞-微载体悬浮液；并且其次，进一步的分离步骤将细胞留在悬浮液中而不存在微载体。

典型地，第一步骤、即使细胞从微载体上脱离是通过酶消化来完成的。可以基于微载体的类型、细胞的类型等而使用不同的酶。这些酶可以例如是胰蛋白酶、促胰酶(accutase)、胶原酶或胰蛋白酶-促胰酶混合物。在第二步骤中，使用过滤器或离心机从微载体上分离细胞。

本发明还可选地涉及微载体(例如珠)表面的等离子体涂覆或处理，以提供高亲水性表面来增强细胞粘附和细胞生长。涂覆或处理对细胞粘附、细胞生长和细胞回收过程中的细胞完整性没有负面影响。细胞培养、细胞收获和回收方案

设想将以下材料、设备和方法用于本披露。材料：

当周五收到时，对所选择细胞进行计数并将其分成T-182烧瓶(3/33)x 15。周一将细胞的15x T-182烧瓶合并。将10mL细胞加入到1L滚瓶中，并将20mL细胞加入到2L滚瓶中。使滚瓶在含有5％CO2的空气中、在39℃下、在加湿腔室中以0.25rpm旋转。48小时后收获细胞。

对于1L滚瓶按以下方式进行细胞收获。倒出培养基。用25mL的1x PBS冲洗细胞。然后加入10mL的1x胰蛋白酶及0.18mM的EDTA并孵育10分钟。最后加入40mL完全培养基。收集1mL样品并进行细胞计数。

对于2L滚瓶，如下进行细胞收获。倒出培养基。用50mL的1x PBS冲洗细胞。然后加入20mL的1x胰蛋白酶及0.18mM的EDTA并孵育10分钟。加入80mL完全培养基。收集1mL样品并进行细胞计数。

将每个样品稀释10倍以帮助分离细胞。将细胞样品再次稀释10倍，但另外用0.4％台盼蓝以1:1的比率稀释。将10μL细胞/台盼蓝样品装入计数载玻片中，将其装入Bio-Rad细胞计数器并记录。

对所比较的活细胞回收率进行分析，其计算如下：

活细胞回收率％＝收获的活细胞总数/初始活细胞总数

进行该实验以检查由于将当前的表面处理应用于由聚苯乙烯制成的1L的CellTreat滚瓶而导致的细胞回收率(即细胞生长)提高和接触角。该实验还针对细胞生长将当前发明的处理与比如康宁组织培养处理(TCT)滚瓶和康宁

还测定了水接触角，如表5所报告。

表1a：处理参数

表2：细胞回收率结果(第1轮)

表3：细胞回收率结果(第2轮)

表4：细胞回收率结果(第3轮)

表5：水接触角

示例2.本发明的经处理的滚瓶和未处理的滚瓶的XPS表面分析

实施本示例以确定未处理的由聚苯乙烯制成的1L CELLTREAT

表6：原子浓度(单位为原子％)

结果表明，当前发明的处理在经处理的表面上产生的氧比在相同的未处理表面上多三倍。

在表7中示出了化学键合信息。

表7：碳和硅的化学状态(单位为原子％)

所检测元素的化学状态由高分辨率光谱确定。对于元素C和Si，将光谱曲线拟合以估计在不同氧化态下的每种元素的相对量。曲线拟合结果在各个光谱上示出并在表7中总结。

示例3.本发明的经处理的滚瓶和未处理的滚瓶的XPS沿深度的分析

本示例用于确定本发明的经处理的滚瓶B的接触表面的沿深度的化学组成。

获取经处理的滚瓶B的接触表面的测量光谱。使用1kV Ar+获取深度剖面。在表8中示出结果。选择这束电压以使氧原子的优先溅射最小化。虽然这样使优先溅射最小化，但并没有完全消除这种伪影。因此，预期的是氧浓度在深度剖面过程中将会高于测量值。需要注意，本研究中的深度尺度假设样品溅射的速率与

表8.原子浓度

示例4.本发明的经处理的滚瓶以及未经处理的滚瓶的原子力显微镜(AFM)分析

该示例是将当前发明的经处理的滚瓶的内表面的粗糙度与未经处理的在其他方面相同的滚瓶的内表面的粗糙度进行比较。

使用原子力显微镜(AFM)来评估粗糙度。使用Dimension Icon AFM仪器(美国加利福尼亚州，圣巴巴拉市，布鲁克公司(Bruker，Santa Barbara，California))收集AFM图像。针对NIST可追踪标准来校准仪器。

对于经处理的滚瓶，样品被标识为A，对于未经处理的滚瓶，样品被标识为B。通过用刀片切割，在每个瓶的侧面大约一半的位置处制备样品。在内侧表面上对一个20μm x 20μm的区域进行成像。这些区域的俯视图与粗糙度测量结果一起在图8和图9中示出。这些图像的形貌差异以灰度图像显示，其中较低的特征以较深的阴影显示，并且较高的特征以较浅的阴影或白色显示。将z范围标注在图像右侧的垂直比例尺上。这些表面的立体(3-D)视图也以垂直放大形式标注在标题栏中(图10和图11)。还以较高的横向分辨率对每个样品上的一个2μm x 0.5μm的区域进行成像(图12-15)。在表9中示出仪器条件。

表9.仪器条件

进行粗糙度分析，并且表示为高度、空间和混合参数。在表10和表11中对结果进行总结。

表10.粗糙度结果——高度参数

表11.粗糙度结果——空间参数和混合参数

表10-11中的结果和图8-9的图像清晰地示出了两个表面之间的纹理差异。当前发明的经处理的瓶的内部表面表现出高密度的小颗粒状结构，其在未经处理的瓶的表面上不存在。这也可以通过粗糙度参数来量化，当前发明的经处理的滚瓶具有较高的Sdq值，这表明间距较窄的纹理分量，与高密度的小颗粒状结构一致。据信与较少的、较大的，间距较宽的凸块结构相比，小颗粒状结构更有效地增加接触表面积。特别地，经处理的表面A1的表面积差极大地大于未经处理的表面A2的表面积差。在处理之后，比如Rq、Ra、Rmax、Sdq、Sds和Ssc等其他粗糙度参数也会增加。

在较小尺度(即2μm x 0.5μm)上，这种趋势更加明显。在尺寸较小的图像中，两个表面之间的纹理差异也更明显；在经处理的瓶上观察到高密度的小颗粒状结构，其在未经处理的瓶上则不存在(图12至15)。

不受理论的限制，据信通过在上述示例中所述的处理之后的较大的表面积差值和其他较高的粗糙度参数来量化的增加的接触表面积至少是细胞粘附性增强的原因之一；并且认为更高的细胞粘附性可以增强表面上的更高的细胞生长。

所提供的粗糙度值的估计不确定度在±5-10％以内(使用k＝2的涵盖因数，在接近95％的置信水平下)。除非在此范围内执行单独的z高度校准，否则将2nm以下的粗糙度数据视为“半定量”数据。因为测量精度约为±10％，“半定量”数据仍然允许在样品之间进行比较。(然而，绝对粗糙度值的不确定性是不确定的。)请注意，所提供的不确定性估算假设不同采样位置之间的粗糙度没有变化。

与粗糙度有关的参数的以下描述应用于整个披露内容。

获取Bruker尺寸图标AFM/SPM并以数字格式存储各表面的3维表示。可以按不同方式分析这些表面。

Nanoscope软件可以对任何AFM或SPM图像执行粗糙度分析。该分析的结果是在俯视图中重现所选图像的单色页面。图像的右上方是“图像统计学”框，其列出了整个图像减去被阻带(X穿其而过的框)排除的任何区域的计算特征。可以针对图像的所选部分来计算类似的附加统计资料，并且将其列于页面右下方部分内的“框统计资料”中。以下是对这些统计资料的描述和解释。

Z范围(R

均值：成像区域中的所有Z值的平均值。该值未针对图像平面中的倾斜进行校正；因此，对数据进行平面拟合或拉平将会更改这个值。

RMS(Rq)：这是图像中的Z值(或RMS粗糙度)的标准差。它是根据以下公式计算的：

Rq＝√{Σ(Zi-Zavg)2/N}

Zavg是图像中的平均Z值；Zi是Z的当前值；N是图像中的点数。该值未针对图像平面中的倾斜进行校正；因此，对数据进行平面拟合或拉平将会更改此值。

平均粗糙度(Ra)：这是相对于中心平面的表面的平均值，并使用以下公式计算：

Ra＝[1/(LxLy)]∫0Ly∫0Lx{f(x,y)}dxdy

其中f(x,y)是相对于中心平面的表面，并且Lx和Ly是该表面的尺寸。

最大高度(Rmax)：这是表面的最高点与最低点之间相对于平均平面的高度差。

表面积：这是成像区域的3维表面的面积。这是通过对整个图像中的3个相邻数据点形成的三角形的面积求和来计算的。

表面积差：这是表面积超过成像面积的量。它是以百分比表示并根据以下公式计算的：

表面积差值＝100[(表面积/S12)-1]

其中S1是扫描区域减去被阻带排除的任何区域的长度(和宽度)。

中心平面：与平均平面平行的平面。在中心平面上方和下方由图像表面围成的体积相等。

平均平面：图像数据具有关于该平面的最小方差。它是由对Z数据进行一阶最小二乘法拟合得出的。

最快衰减自相关函数(Sal)：这个可选空间参数被定义为是在任何方向上自相关函数的20％的最快衰减的长度。Sal的高值表示该表面由低频分量主导。

表面的纹理方向(Std)：该可选的空间参数是表面的主导铺层相对于Y轴的角度。该参数由角功率谱密度函数确定。

纹理长宽比(Str)：这个可选空间参数被定义为是自相关函数的20％相关性的最快衰减与最慢衰减的比率。对于具有较强铺层的表面，Str将会更接近于0；对于具有均匀纹理的表面，Str将会更接近1。

均方根表面斜率(Sdq)：是对组成表面纹理的斜率的度量，在所有方向上进行评估。它包括幅度和间隔分量。较低的Sdq值可能表示间距较宽的纹理分量：

峰顶密度(Sds)：每单位面积的峰顶数量。峰顶来自峰。峰被定义为是所有8个最近邻近点上的任何点。峰顶必须至少间隔开包括3D测量区域的最小“X”或“Y”尺寸的1％。此外，仅在高于平均平面Sz的5％的阈值之上发现峰顶。

平均峰顶曲率(Ssc)：各种峰结构的平均峰顶曲率。针对每个峰顶评估Ssc，然后对该区域进行平均：

示例5.本发明的经处理的滚瓶以及未经处理的滚瓶的原子力显微镜(AFM)分析

该示例是将当前发明的经处理的滚瓶的内部表面(即接触表面)的粗糙度与相同尺寸的

使用原子力显微镜(AFM)来评估粗糙度。使用Dimension Icon AFM仪器(美国加利福尼亚州，圣巴巴拉市，布鲁克公司(Bruker，Santa Barbara，California))收集AFM图像。针对NIST可追踪标准来校准仪器。

对于当前发明的经处理的滚瓶，样品被识别为A，对于康宁

进行粗糙度分析，并且表示为高度、空间和混合参数。在表12和表13中对结果进行总结。

表12.粗糙度结果——高度参数

表13.粗糙度结果——空间参数和混合参数

结果和图像清晰地示出了两个表面之间的纹理差异。当前发明的经处理的滚瓶的内部表面表现出高密度的小颗粒状结构，其在康宁

所提供的粗糙度值的估计不确定度在±5-10％以内(使用k＝2的涵盖因数，在接近95％的置信水平下)。除非在此范围内执行单独的z高度校准，否则将2nm以下的粗糙度数据视为“半定量”数据。因为测量精度约为±10％，“半定量”数据仍然允许在样品之间进行比较。(然而，绝对粗糙度值的不确定性是不确定的。)请注意，所提供的不确定性估算假设不同采样位置之间的粗糙度没有变化。

尽管已经详细地并且参照其具体示例和实施例描述了本技术，但是对本领域技术人员来说，将明显的是在不背离其精神和范围的情况下可以对其进行各种改变和修改。在权利要求中提供了附加披露内容，这些权利要求被认为是本说明书的一部分，每个权利要求限定了可选项和可选实施例。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种聚合物衬底，包括容器，所述容器具有壁，所述壁具有围成内腔的内表面、外表面、以及在所述内表面与所述外表面之间的内部部分，以及

经处理的接触表面，其中，所述接触表面包括所述容器的内表面的至少一部分，其中所述接触表面的粗糙度是通过以下四个参数中的至少一个进行量化的：

·表面积差A，大于0.055％，可选地从0.06％至2％，可选地从0.1％至1.5％，可选地从0.5％至1.2％，可选地从0.9％至1.1％；

·均方根表面斜率Sdq，大于1.9°，可选地从2°至20°，可选地从4°至15°，可选地从6°至12°，可选地从7°至10°，可选地从7°至9°；

·峰顶密度Sds，大于44.4/μm

·平均峰顶曲率Ssc，大于3.62/μm，可选地从4/μm至50/μm，可选地从6/μm至45/μm，可选地从8/μm至40/μm，可选地从10/μm至35/μm，可选地从12/μm至30/μm，可选地从14/μm至30/μm，可选地从16/μm至30/μm，可选地从18/μm至30/μm，可选地从20x/μm至25/μm；

其中，所述参数A、Sdq、Sds和Ssc各自是通过对所述接触表面上的5μm x 5μm的图像区域进行测量来确定的；并且

其中与所述接触表面的XPS原子组成相比，所述聚合物衬底的内部部分的XPS原子组成包含更小比例的氧气和更大比例的碳，其中，确定所述接触表面的XPS原子组成为深度5.8埃。

2.如权利要求1所述的聚合物衬底，其中所述接触表面的粗糙度是通过表面积差来量化的，所述表面积差大于0.055％，可选地从0.06％至2％，可选地从0.1％至1.5％，可选地从0.5％至1.2％，可选地从0.9％至1.1％。

3.如任一前述权利要求所述的聚合物衬底，其中所述接触表面的粗糙度是通过均方根表面斜率Sdq来量化的，所述均方根表面斜率大于1.9°至20°，可选地从2°至20°，可选地从4°至15°，可选地从6°至12°，可选地从7°到10°，可选地从7°到9°。

4.如任一前述权利要求所述的聚合物衬底，其中所述接触表面的粗糙度是通过峰顶密度Sds来量化的，所述峰顶密度大于44.4/μm

5.如任一前述权利要求所述的聚合物衬底，其中所述接触表面的粗糙度是通过平均峰顶曲率Ssc来量化的，所述平均峰顶曲率大于3.62/μm，

可选地从4/μm至50/μm，可选地从6/μm至45/μm，可选地从8/μm至40/μm，可选地从10/μm至35/μm，可选地从12/μm至30/μm，可选地从14/μm至30/μm，可选地从16/μm至30/μm，可选地从18/μm至30/μm，可选地从20x/μm至25/μm。

6.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述内部部分和所述接触表面基本上由相同的聚合物组成，并且所述接触表面的XPS原子组成包含的氧比所述内部部分的XPS原子组成多从0.1原子％至30原子％、可选地从2原子％至30原子％、可选地从5原子％至20原子％、可选地从10原子％至20原子％、可选地从13原子％至16原子％。

7.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述接触表面的XPS原子组成包含从0.1原子％至20原子％、可选地从5原子％至15原子％、可选地从9原子％至12原子％的接枝有氧的碳原子。

8.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述接触表面包含从0.1原子％至20原子％、可选地从5原子％至15原子％、可选地从9原子％至12原子％的氢键受体基团。

9.如权利要求7所述的衬底，其中如通过X射线光电子能谱法(XPS)测量的，所述接枝氧以选自C-O、CO

10.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述接触表面的厚度是从0至20nm，可选地从0.1nm至10nm，可选地从0.2nm至1nm，可选地从0.2nm至0.7nm，可选地约0.6nm；并且其中所述接触表面是亲水的，并且与未处理的在其他方面相同的表面或生物涂层涂覆的表面相比具有更高的细胞粘附性；并且所述内部部分基本上由碳和氢原子组成。

11.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述接触表面的厚度小于0.6nm，并且所述内部部分的在0.6nm深度处的XPS原子组成包含从1％至10％的氧；或者

其中所述接触表面的厚度小于1.2nm，并且所述经处理的聚合物衬底的内部部分的在1.2nm深度处的XPS原子组成包含从0.5％至5％的氧；或者

其中所述接触表面的厚度小于1.7nm，并且所述经处理的聚合物衬底的内部部分的在1.7nm深度处的XPS原子组成包含从0.3％至3％的氧；或者

其中所述接触表面的厚度小于2.3nm，并且所述经处理的聚合物衬底的内部部分的在2.3nm深度处的XPS原子组成包含从0.1％至1％的氧；或者

其中所述接触表面的厚度小于2.3nm，并且所述经处理的聚合物衬底的内部部分的在2.3nm深度处的XPS原子组成包含从0.1％至1％的氧；或者

其中所述经处理的聚合物衬底的内部部分的在2.9nm深度处的XPS原子组成包含从0.1％至1％的氧。

12.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述接触表面的表面接触角是从38°到62°，可选地是从50°到70°，可选地是从55°到65°，可选地是从60°到64°，可选地是从30°到50°，可选地是从30至40°，可选地是从35°到45°，可选地是从37°到41°。

13.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述容器还包括封闭件，可选地是塞子、帽、盖子、顶部、软木塞或其任何组合。

14.如权利要求13所述的衬底，其中所述封闭件是通过将塑料或弹性体塞子插入帽中来形成的。

15.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述内表面是大致圆柱形的。

16.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述容器包括滚瓶。

17.如权利要求16所述的衬底，其中限定了所述经处理的接触表面的内表面具有多个肋状物。

18.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述容器的体积容量是从1mL至100L，可选地从100mL至5L，可选地是1L，可选地是2L。

19.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述经处理的聚合物衬底包括烧瓶、瓶或管。

20.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述经处理的聚合物衬底包括热塑性材料，例如热塑性树脂，例如注塑模制的热塑性树脂；并且其中所述热塑性树脂可选地包含聚苯乙烯。

21.如权利要求20所述的衬底，其中所述热塑性材料包括：烃聚合物，例如烯烃聚合物、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚甲基戊烯、聚苯乙烯、氢化聚苯乙烯、聚环己基乙烯(PCHE)或以上各项中的两种或更多种的组合；或杂原子取代的烃聚合物，例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚偏二氯乙烯(PVdC)、聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酯、聚乳酸、环氧树脂、尼龙、聚氨酯聚丙烯腈、聚丙烯腈(PAN)、离聚物树脂或以上各项中的任何两种或更多种的任何组合、复合物、共混物或层合物。

22.如任一前述权利要求所述的衬底，其中在相对于所述初始接触表面有效地改善鸡胚细胞培养物从所述经处理的接触表面获得的细胞回收的条件下对所述接触表面进行处理；

所述处理包括使所述接触表面与工艺气体接触；并且在所述初始接触表面附近的处理气体中引入射频电功率，以在所述初始接触表面附近产生等离子体，由此形成具有经处理的接触表面的经处理的聚合物衬底；并且

其中，鸡胚细胞培养物的细胞回收率是通过以下过程确定的：将细胞培养物与含有小牛血清的DMEM培养基接触，将10mL所述细胞培养物和培养基放到1L滚瓶中或将20mL所述细胞培养物和培养基放到2L滚瓶中，在空气中具有5％的CO2下、在39℃下、在加湿腔室中以0.25rpm滚动所述瓶48小时，使用胰蛋白酶与0.18mM EDTA来收集细胞，并且通过将所述样品与0.4％的台盼蓝混合并将其装载到BioRad细胞计数器中并进行记录来确定回收率。

23.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述等离子体是由射频产生的。

24.如权利要求22至23中任一项所述的衬底，所述工艺气体包含氧原子、氮原子、或氧原子和氮原子两者，并且优选地包含氧、氮、一氧化二氮、或其中任何两种或更多种的组合。

25.如权利要求22至24中任一项所述的衬底，其中所述工艺气体基本上不含水。

26.如权利要求22至25中任一项所述的衬底，其中通过将工艺气体输送穿过进气导管而使所述接触表面与所述工艺气体接触，所述进气导管具有与所述初始接触表面相邻的出口。

27.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述接触表面的Sdq1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Sdq2，可选地Sdq1>2x Sdq2，可选地Sdq1>3x Sdq2，可选地Sdq1>4xSdq2，可选地Sdq1>5x Sdq2，可选地Sdq1>6x Sdq2，可选地Sdq1>7x Sdq2，可选地Sdq1>8xSdq2，可选地Sdq1>9x Sdq2，可选地Sdq1>10x Sdq2，可选地Sdq1>11x Sdq2；

其中所述接触表面的Sds1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Sds2，可选地Sds1>2x Sds2，可选地Sds1>3x Sds2，可选地Sds1>4x Sds2，可选地Sds1>5x Sds2，可选地Sds1>6x Sds2，可选地Sds1>7x Sds2，可选地Sds1>8x Sds2，可选地Sds1>9x Sds2，可选地Sds1>10x Sds2，可选地Sds1>11x Sds2，可选地Sds1>12x Sds2；

其中所述接触表面的Ssc1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Ssc2，可选地Ssc1>2x Ssc2，可选地Ssc1>3x Ssc2，可选地Ssc1>4x Ssc2，可选地Ssc1>5x Ssc2，可选地Ssc1>6x Ssc2，可选地Ssc1>7x Ssc2，可选地Ssc1>8x Ssc2，可选地Ssc1>9x Ssc2，可选地Ssc1>10x Ssc2，可选地Ssc1>11x Ssc2，可选地Ssc1>12x Ssc2；

其中所述接触表面的Rq1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Rq2；

其中所述接触表面的Ra1大于未处理的在其他方面相同的接触表面的Ra2；

其中所述接触表面的表面积差A1大于未经处理的在其他方面相同的接触表面的表面积差A2，可选地A1>2x A2，可选地A1>5x A2，可选地A1>10x A2，可选地A1>15x A2，可选地A1>20x A2，可选地A1>25x A2，可选地A1>30x A2，可选地A1>2x A2，可选地A1>35A2，可选地A1>40x A2，可选地A1>50x A2，可选地A1>60x A2，可选地A1>70x A2，可选地A1>80x A2，可选地A1>90x A2，可选地A1>100x A2，可选地A1>110x A2；

或其任何组合。

28.如任一前述权利要求所述的衬底，其中所述接触表面的表面积差A1大于相同尺寸的Cellbind滚瓶的接触表面的表面积差A2，可选地A1>2x A2，可选地A1>5x A2，可选地A1>10x A2，可选地A1>15x A2，可选地A1>20x A2，可选地A1>25x A2，可选地A1>30x A2；

其中所述接触表面的Sdq1大于相同尺寸的Cellbind滚瓶的接触表面的Sdq2，可选地Sdq1>2x Sdq2，可选地Sdq1>3x Sdq2，可选地Sdq1>4x Sdq2；

其中所述接触表面的Sds1大于相同尺寸的Cellbind滚瓶的接触表面的Sds2，可选地Sds1>2x Sds2，可选地Sds1>3x Sds2，可选地Sds1>4x Sds2；

其中所述接触表面的Ssc1大于相同尺寸的Cellbind滚瓶的接触表面的Ssc2，可选地Ssc1>2x Ssc2，可选地Ssc1>3x Ssc2，可选地Ssc1>4x Ssc2，可选地Ssc1>5x Ssc2，可选地Ssc1>6x Ssc2，可选地Ssc1>7x Ssc2；

或其任何组合。

29.如任一前述权利要求所述的衬底，其中相对于所述初始接触表面，以与所述经处理的接触表面接触的方式生长并收获的鸡胚细胞培养物的存活率是至少88％，可选地是从88％至99％，可选地是从88％至97％，可选地是从94％至96％；

相对于所述初始接触表面，以与所述经处理的接触表面接触的方式生长并收获的鸡胚细胞培养物的回收率是至少132％，可选地是从132％至300％，可选地是从140％至250％，可选地是从140％至230％；

或两者；

其中，鸡胚细胞培养物的细胞回收率是通过以下过程确定的：将细胞培养物与含有小牛血清的DMEM培养基接触，将10mL所述细胞培养物和培养基放到1L滚瓶中或将20mL所述细胞培养物和培养基放到2L滚瓶中，在空气中具有5％的CO2下、在39℃下、在加湿腔室中以0.25rpm滚动所述瓶48小时，使用胰蛋白酶与0.18mM EDTA来收集细胞，并且通过将所述样品与0.4％的台盼蓝混合并将其装载到BioRad细胞计数器中并进行记录来确定回收率。