具有降低广义酸的PKA的氨基酸取代的变体α-淀粉酶

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年7月31日提交的美国临时专利申请序列号62/712,446的优先权，将其以其全文通过引用特此结合。

技术领域

本发明公开了涉及变体α-淀粉酶的组合物和方法。所述变体α-淀粉酶可用于例如淀粉液化和糖化、清洁淀粉污渍、纺织品脱浆、烘焙、和酿造。

背景技术

淀粉由直链淀粉(15％-30％w/w)和支链淀粉(70％-85％w/w)的混合物组成。直链淀粉由具有分子量(MW)为从约60,000至约800,000的α-1,4-连接的葡萄糖单元的直链组成。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有α-1,6分支点的支链聚合物；其MW可高达一亿。

α-淀粉酶通过随机裂解内部的α-1,4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖。α-淀粉酶，特别是来自芽孢杆菌属(Bacilli)的α-淀粉酶已经用于各种不同的目的，包括淀粉液化和糖化、纺织品脱浆、纸和纸浆工业中的淀粉修饰、酿造、烘焙、用于食品工业的糖浆的生产、用于发酵过程的原料的生产、以及用于动物饲料中以增加可消化性。这些酶还可用于在餐具洗涤和衣物洗涤期间除去淀粉污垢和污渍。

许多α-淀粉酶是可商购的，并且对于许多应用而言，所述酶几乎变得不可或缺。酶制造商之间的竞争非常激烈，并且驱动无休止的竞争，从而开发不断改善的酶。对于开发使用随机诱变和高通量筛选之外的方式来改善α-淀粉酶的新方法存在需要。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及变体α-淀粉酶多肽、及其使用方法，以及用于设计变体α-淀粉酶的方法。本发明的组合物和方法的方面和实施例总结在以下分别编号的段落中：

1.在一方面，提供了亲本家族13α-淀粉酶的重组变体，所述变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少60％氨基酸序列同一性，并且在氨基酸残基中具有氨基酸突变，所述氨基酸残基排列在所述α-淀粉酶的核心β-桶结构的N-末端侧，所述氨基酸突变导致所述变体具有与亲本α-淀粉酶中的天然存在的氨基酸不同的氨基酸残基，并且导致广义酸的表观pK

2.在如段落1所述的变体α-淀粉酶的一些实施例中，所述变体在pH 8.5的活性与在pH 10.5的活性之比除以在其他方面相同但是缺乏氨基酸残基中的氨基酸突变的α-淀粉酶在pH 8.5的活性与在pH 10.5的活性之比大于1、大于2、大于3、或大于4，所述氨基酸残基排列在所述α-淀粉酶的核心β-桶结构的N-末端侧。

3.在一些实施例中，如段落1或2所述的变体α-淀粉酶在选自由以下组成的组的位置处包含氨基酸取代：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的T40、F263、S288和Y364。

4.在如段落3所述的变体α-淀粉酶的一些实施例中，所述变体包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的T40C、T40D、T40E、T40N、F263P、F263Y、S288D、S288K、Y364E、Y364L和Y364M。

5.在一些实施例中，如段落1-4中任一项所述的变体α-淀粉酶进一步包含：

(i)在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置181、182、183和/或184的一个或多个残基处的缺失或取代；

(ii)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置181、182、183和/或184的残基181和182或183和184的缺失；

(iii)先前在家族13α-淀粉酶中描述的任何单个、多个或组合突变；和/或

(iv)N-末端和/或C-末端截短。

6.在一些实施例中，如段落1-5中任一项所述的变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％氨基酸序列同一性；由与编码SEQID NO:1的多核苷酸具有至少60％、至少70％、至少80％或至少90％核酸序列同一性的多核苷酸编码；和/或由在严格条件下与编码SEQ ID NO:1的多核苷酸、或其互补序列杂交的多核苷酸编码。

7.在另一方面，提供了一种用于调节α-淀粉酶的活性的方法，所述方法包括向与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少60％氨基酸序列同一性的亲本家族13α-淀粉酶引入残基的突变，所述突变影响被定位用于催化的广义酸的静电环境，其中所述突变位于α-淀粉酶β-桶的N-末端侧，并且其中所述突变改变所得变体α-淀粉酶中的广义酸的静电环境。

8.在如段落7所述的方法的一些实施例中，所述变体α-淀粉酶在pH 8.5的活性与在pH 10.5的活性之比除以在其他方面相同但是缺乏氨基酸残基中的氨基酸突变的α-淀粉酶在pH 8.5的活性与在pH 10.5的活性之比大于1、大于2、大于3、或大于4，所述氨基酸残基排列在所述α-淀粉酶的核心β-桶结构的N-末端侧。

9.在如段落7或8所述的方法的一些实施例中，所述突变是在选自由以下组成的组的位置处的取代：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的T40、F263、S288和Y364。

10.在如段落9所述的方法的一些实施例中，所述取代选自由以下组成的组：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的T40C、T40D、T40E、T40N、F263P、F263Y、S288D、S288K、Y364E、Y364L和Y364M。

11.在如段落7-10中任一项所述的方法的一些实施例中，所述变体α-淀粉酶进一步包含：

(i)在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置181、182、183和/或184的一个或多个残基处的缺失或取代；

(ii)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置181、182、183和/或184的残基181和182或183和184的缺失；

(iii)先前在家族13α-淀粉酶中描述的任何单个、多个或组合突变；和/或

(iv)N-末端和/或C-末端截短。

12.在另一方面，提供了一种用于液化淀粉的组合物，所述组合物包含如段落1-6中任一项所述的变体α-淀粉酶。

13.在另一方面，提供了一种洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物包含如段落1-6中任一项所述的变体淀粉酶。

14.在另一方面，提供了一种用于将淀粉转化为寡糖的方法，所述方法包括使淀粉与有效量的如段落1-6中任一项所述的变体淀粉酶接触。

15.在另一方面，提供了一种用于从表面除去淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括使所述表面与有效量的如段落1-6中任一项所述的变体淀粉酶接触，并且允许所述多肽水解存在于所述淀粉污渍中的淀粉组分以产生溶解于水性组合物中的较小的衍生自淀粉的分子，从而从所述表面除去所述淀粉污渍。

这些组合物和方法的这些和其他方面以及实施例将从本说明书和附图中显而易见。

附图说明

图1是BspAmy24、Amy707和AA560的氨基酸序列比对。

图2显示了BspAmy24(del-R181-G182)的结构模型，用于使用常规立体查看器进行查看。

图3从不同角度显示了BspAmy24(del-R181-G182)的结构模型。残基40、41、263、288和364的α碳位置以黑色显示。广义酸残基显示为灰色球体。

图4是BspAmy24-V1和BspAmy24-V1-T240N的速率常数的对数对比pH的图。

图5是BspAmy24-V1和BspAmy24-V1-F263Y的速率常数的对数对比pH的图。

图6是BspAmy24-V1和BspAmy24-V1-S288D的速率常数的对数对比pH的图。

图7是BspAmy24-V1和BspAmy24-V1-Y364L的速率常数的对数对比pH的图。

具体实施方式

描述了与变体α-淀粉酶有关的组合物和方法。变体淀粉酶的示例性应用是用于淀粉液化和糖化、用于清洁衣物中的淀粉污渍、餐具洗涤、和其他应用，用于纺织品加工(例如脱浆)、在动物饲料中用于改善消化率、以及用于烘焙和酿造。下文详细描述了所述组合物和方法的这些和其他方面。

在描述本发明的组合物和方法的各个方面和实施例之前，描述了以下定义和缩写。

1.定义和缩写

根据这一详细说明，以下缩写和定义适用。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有清楚地指示。因此，例如提及“酶”包括多个此类酶，并且提及“剂量”包括提及一个或多个剂量以及本领域普通技术人员已知的其等同物，等等。

将本文件组织成若干部分以便于阅读；然而，读者将领会的是，在一个部分中进行的陈述可能适用于其他部分。以这种方式，用于本公开的不同部分的标题不应被解释为限制。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。为了清楚起见，以下术语定义如下。

1.1.缩写和首字母缩略词

除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

DNA 脱氧核糖核酸

EC 酶学委员会

GA 葡糖淀粉酶

GH 总硬度

HDL 高密度液体洗涤剂

HDD 重垢粉末洗涤剂

HSG 高泡沫颗粒状洗涤剂

HFCS 高果糖玉米糖浆

IRS 不可溶残留淀粉

kDa 千道尔顿

MW 分子量

MWU 经修饰的Wohlgemuth单位；1.6x 10

NCBI 国家生物技术信息中心

PI 性能指数

ppm 百万分率，例如μg蛋白质/克干固体

RCF 相对离心/向心力(即x重力)

sp. 物种

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

wt％ 重量百分比

℃ 摄氏度

H

dH

dIH

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

μL和μl 微升

mL和ml 毫升

mm 毫米

μm 微米

M 摩尔

mM 毫摩尔

μM 微摩尔

U 单位

sec 秒

min(s) 分钟

hr 小时

ETOH 乙醇

N 正常

MWCO 分子量截止值

CAZy 碳水化合物活性酶数据库

WT 野生型

1.2.定义

术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指这样的酶：除其他事项之外，其能够催化淀粉的降解。α-淀粉酶是裂解淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，α-淀粉酶(EC3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为内切作用的酶，其以随机方式裂解淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷键，产生含有三个或更多个(1-4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖。相反地，外切作用的淀粉分解酶，例如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶(如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133))从底物的非还原端裂解多糖分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡萄糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)和产物特异性淀粉酶(如麦芽四糖苷酶(EC 3.2.1.60)和麦芽六糖苷酶(EC 3.2.1.98))可以生产特定长度的麦芽寡糖或富含糖浆的特定麦芽寡糖。

术语“淀粉”是指由植物的复合多糖碳水化物组成的任何材料，所述复合多糖碳水化物由具有式(C

如本文所使用的，术语“液化”或“使液化”是指淀粉转化为粘度更低和更短链糊精的过程。

关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参比”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包含人为核苷变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参考多肽的任何多核苷酸。

参考野生型多肽应理解为包括多肽的成熟形式。“成熟”多肽或其变体是其中不存在信号序列的多肽或变体，例如，在多肽表达期间或之后从未成熟形式的多肽切割。

关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然存在的或人为的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参考多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的特性将从上下文中显而易见。

在本发明α-淀粉酶的情况下，“活性”是指α-淀粉酶活性，其可以如本文所述测量。

表述“核心β-桶结构”是指形成平行β-折叠二级结构的中心区域的氨基酸残基，其自身弯曲成使得第一链氢与连续桶中的最后链键合。特别地，在BspAmy24中，形成桶的氨基酸是残基8-11、40-44、98-103、232-235、263-267、288-290、325-328、364-368。

表述“在核心β-桶结构的N-末端侧排列的氨基酸残基”是指在核心β-桶结构的端部的与活性位点相邻侧相对的氨基酸。包含桶的链平行定向，使得β链的N-末端位于桶的一侧，并且链的C-末端位于桶的另一侧，与活性位点相邻。更特别地，排列在核心β-桶的N-末端侧的氨基酸包括每个链的最N-末端残基(这些残基与相邻链进行氢键结合，如通过常见算法定义，从而分配二级结构，例如在PyMol和MOE中)，以及如果参与与相邻链进行主链氢键合，紧邻那些残基之前或之后的残基。特别地，在BspAmy24中排列在核心β-桶结构的N-末端侧的残基包括位置8、9、40、41、97、98、230、232、263、288、325、326、364。

广义酸的表观pK

术语“性能益处”是指分子的期望特性上的改善。示例性的性能益处包括但不限于：淀粉底物水解增加，谷物、谷类或其他淀粉底物的液化性能增强，清洁性能增强，热稳定性增强，洗涤剂稳定性增强，储存稳定性增强，溶解度增加，pH曲线改变，钙依赖性降低，比活性增加，底物特异性经修饰，底物结合经修饰，pH依赖性活性经修饰，pH依赖性稳定性经修饰，氧化稳定性增加、和表达增加。在一些情况下，性能益处是在相对较低的温度下实现的。在一些情况下，性能益处是在相对较高的温度下实现的。

术语“组合变体”是包括两个或更多个突变，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个取代、缺失、和/或插入的变体。

术语“重组”当用于提及主题细胞、核酸、蛋白质或载体时，表明受试者已经从其天然状态被修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或以不同于自然界发现的水平或在不同于自然界发现的条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列不同在于一个或多个核苷酸，和/或有效地连接到异源序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白质与天然序列的不同可在于一个或多个氨基酸，和/或与异源序列融合。包含编码淀粉酶的核酸的载体是重组载体。

术语“回收的”、“分离的”和“单独的”是指从如天然存在的与其天然相关的至少一种其他材料或组分中除去的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸、或者其他指定材料或组分。其“分离的”多肽包括但不限于含有在异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养液。

术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)，例如，至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、或甚至至少约99％纯。

术语“富集的”是指处于约50％纯、至少约60％纯、至少约70％纯、或甚至至少约70％纯的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)。

关于酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于升高的温度后保持活性的能力。酶(如淀粉酶)的热稳定性通过以分钟、小时或天给出的其半衰期(t

关于酶的“pH范围”是指在其下酶显示催化活性的pH值的范围。

关于酶的术语“pH稳定”和“pH稳定性”涉及在一个宽范围内的pH值下，酶保持预定时间段(例如，15min.、30min.、1小时)的活性的能力。

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换地使用。当此类氨基酸序列显示出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基端-至-羧基端取向(即N→C)表示氨基酸序列。

术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以含有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码具体的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，核酸序列以5′-至-3′取向呈现。

“杂交”是指如在印迹杂交技术和PCR技术期间发生的，一条核酸链与互补链形成双链体(即碱基对)的过程。严格杂交条件通过在以下条件下杂交来例证：65℃和0.1X SSC(其中1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。杂交的双链核酸的特征在于熔融温度(Tm)，其中一半杂交的核酸与互补链不配对。

“合成的”分子通过体外化学或酶促合成而不是通过生物体产生。

关于细胞使用的术语“转化”，“稳定转化”和“转基因”意指细胞包含整合到其基因组中或作为通过多代维系的附加体的非天然(例如异源)核酸序列。

在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸的生物。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或发酵糖的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指不是天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译两者。

术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂可转化为产物的底物的摩尔数。比活性通常表示为单元(U)/mg蛋白质。

如本文所使用的，“水硬度”是水中存在的矿物质(例如钙和镁)的量度。

“样本”是一块材料，例如在其上涂有污渍的织物。所述材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。样本还可以是纸，例如滤纸或硝酸纤维素，或一块硬质材料，例如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但可包括血液、奶、墨水、草、茶、红酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、黏土、颜料、油、或这些化合物的混合物。

“更小的样本”或“微样本”是已经使用单孔打孔装置或者是已经使用定制的多孔打孔装置切割的样本的一部分，其中多孔打孔机的图案与标准多孔微量滴定板匹配，或者所述部分已经从样本中另外除去。样本可以是纺织品、纸、金属或其他适合的材料。更小的样本可以在将其置于24孔、48孔或96孔微量滴定板的孔中之前或之后具有附着的污渍。更小的样本也可以通过在一小块材料上涂上污渍来制作。例如，更小的样本可以是直径为5/8”或0.25”或5.5mm的污染的织物片。定制的打孔器以这样一种方式设计，使得其能够同时向96孔板的所有孔中递送96个样本。通过简单地多次装载相同的96孔板，所述装置允许每孔递送多于一个样本。可以想到多孔打孔装置同时将多个样本递送到任何规格的板，包括但不限于24孔、48孔、和96孔板。在另一种可想到的方法中，污染的测试平台可以是涂覆污垢底物的由金属、塑料、玻璃、陶瓷或其他适合材料制成的珠子。然后将一个或多个涂覆的珠子置于96孔、48孔或24孔板或更大规格板的孔中，所述孔含有适合的缓冲液和酶。在其他设想的方法中，通过将酶溶液点样到织物上，通过润湿附着在保持装置上的样本、或将样本浸入含有酶的更大溶液中，使污染的织物暴露于酶。

“包含淀粉酶的经培养的细胞材料”或类似语言是指包含淀粉酶作为组分的细胞裂解物或上清液(包括介质)。细胞材料可以来自异源宿主，其在培养物中生长，目的是产生淀粉酶。

“序列同一性百分比”是指当使用具有默认参数的CLUSTAL W算法比对时，具体序列具有与指定参考序列中的氨基酸残基相同的至少一定百分比的氨基酸残基。参见Thompson等人，(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

空位开放罚分： 10.0

空位延伸罚分： 0.05

蛋白质权重矩阵： BLOSUM系列

DNA权重矩阵： IUB

延迟发散序列％： 40

空位分隔距离： 8

DNA转换权重： 0.50

列表亲水残基： GPSNDQEKR

使用负性矩阵： 关

切换特殊残基罚分： 开

切换亲水罚分： 开

切换结束空位分隔罚分 关

也可以使用MUSCLE(Edgar，RC(2004)Nuc.Acids Res.[核酸研究]32:1792-97和Edgar，R.C.(2004)Bioinformatics[生物信息学]5:113)确定多个序列的百分比同一性。在所有情况下，与参比序列相比，缺失被视为不同一的残基。

“融合”多肽序列通过两个受试多肽序列之间的肽键连接，即有效地连接。

术语“丝状真菌”是指所有丝状形式的真菌亚门(Eumycotina)，特别是子囊菌亚门(Pezizomycotina)物种。

术语“干固体含量”(ds)是指基于干重百分比的、浆料的总固体。术语“浆料”指含有不可溶固体的水性混合物。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指生物化学品的生产过程，其中在同一工艺步骤中存在微生物，例如产乙醇微生物和至少一种酶，例如淀粉酶。SSF包括在相同的反应容器中同时将淀粉底物(颗粒状、液化的或溶解的)水解为糖类(包括葡萄糖)和将糖类发酵为醇类或其他的生物化学品或生物材料。

“产乙醇微生物”是指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。

术语“发酵饮料”是指通过包括发酵工艺(例如微生物发酵，如细菌和/或真菌发酵)的方法生产的任何饮料。“啤酒”是这种发酵饮料的一个实例，并且所述术语“啤酒”意指包括通过发酵/酿造含淀粉的植物材料生产的任何发酵的麦芽汁。通常，啤酒仅生产自麦芽或辅料、或麦芽与辅料的任何组合。

术语“麦芽”是指任何发芽的谷类谷粒，如发芽的大麦或小麦。

术语“辅料”是指不是麦芽，例如大麦的或小麦的麦芽的任何含有淀粉和/或糖的植物材料。辅料的实例包括，普通玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用研磨酵母、稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙谷物、谷物片、黑麦、燕麦、马铃薯、树薯、木薯和糖浆，例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等。

术语“醪液”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅料或其组合的含水浆料，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。

术语“麦芽汁”是指糖化醪制备期间，对谷粉进行提取后，未发酵的液体流出物(run-off)。

术语“约”是指参考值的±15％。

2.本发明的组合物和方法的方面和实施例

以下段落详细描述了本发明的组合物和方法的各个方面和实施例。

2.1.α-淀粉酶变体，它们具有其广义酸的降低的pKa

用来增加α-淀粉酶的活性的一种方式是降低其广义酸的pK

log(k

尽管已经确定，降低广义酸的pK

如本文所述，令人意外地发现，排列在α-淀粉酶中的核心β-桶的N-末端侧的一组残基显著影响了测量的酶的pK

在不限于理论的情况下，假设这些残基的突变可以影响广义酸的静电环境，因为它们的相互作用锚定了其中将广义酸定位用于催化的桶。桶的N-末端侧处的替代性堆积布置可以用于使桶变紧或变松，并且由此改变广义酸的静电环境。

用于举例说明本发明的组合物和方法的模型α-淀粉酶是来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的α-淀粉酶，在本文中称为“BspAmy24”。BspAmy24α-淀粉酶的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:1所示：

BspAmy24类似于称为“Amy707”α-淀粉酶的来自芽孢杆菌属物种707的α-淀粉酶。Amy707α-淀粉酶的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:2所示：

BspAmy24也类似于具有如以下SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的称为AA560α-淀粉酶的来自另一种芽孢杆菌属物种的α-淀粉酶：

BspAmy24、Amy707和AA560的氨基酸序列比对显示在图1中。使用MUSCLE的氨基酸序列同一性矩阵显示在表1中。

表1.BspAmy24、Amy707和AA560的氨基酸序列同一性矩阵

在一些实施例中，所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:1、2和/或3(排除野生型BspAmy24、Amy707和AA560及其已知变体)具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性。

已知许多细菌(和其他)α-淀粉酶共享相同的折叠，并且通常受益于相同的突变。在本案中，可以容易地使用具有默认参数的Clustal W，使用BspAmy24、Amy707和AA560，通过氨基酸序列比对鉴定其他α-淀粉酶中的相应氨基酸位置。其中前述突变可能产生性能益处的α-淀粉酶、包括与熟知的芽孢杆菌属淀粉酶(例如来自地衣芽孢杆菌(B.lichenifomis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquifaciens)、芽孢杆菌属物种SP722、噬细胞菌属物种(Cytophaga sp.)等)、碳水化合物-活性酶数据库(CAZy)家族13淀粉酶、或迄今为止由描述性术语“Termamyl-样”引用的任何淀粉酶中的任一项具有类似折叠和/或具有60％或更大氨基酸序列同一性的那些α-淀粉酶。读者将理解，当α淀粉酶天然具有上文列出的突变时(即，其中野生型α淀粉酶已经包含被鉴定为突变的残基)，那么特定突变不适用于该α-淀粉酶。然而，其他描述的突变可以与在该位置处的天然存在的残基组合起作用。由于它们的接近的序列同一性，在BspAmy24中产生有益作用的突变(包括取代、插入和缺失)尤其可能在Amy707和AA560α-淀粉酶中产生类似的作用，反之亦然。

2.2另外的突变

在一些实施例中，除上述一个或多个突变(例如，在第2.1部分中)，本发明的淀粉酶进一步包括提供进一步的性能或稳定性益处的一个或多个突变。示例性的性能益处包括但不限于：淀粉底物水解增加，谷物、谷类或其他淀粉底物的液化性能增强，清洁性能增强，热稳定性增强，储存稳定性增强，溶解度增加，pH曲线改变，钙依赖性降低，比活性增加，底物特异性经修饰，底物结合经修饰，pH依赖性活性经修饰，pH依赖性稳定性经修饰，氧化稳定性增加、和表达增加。在一些情况下，性能益处是在相对较低的温度下实现的。在一些情况下，性能益处是在相对较高的温度下实现的。

在一些实施例中，基于Suzuki等人，(1989)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，264:18933-938的工作，本发明的α-淀粉酶变体在钙结合环中另外具有至少一个突变。示例性突变包括在对应于SEQ ID NO:1-3中的位置181、182、183和/或184的一个或多个残基处的缺失或取代。在特定实施例中，所述突变对应于181和182或183和184的缺失(使用SEQ ID NO:1-3中的任一项进行编号)。其他淀粉酶中的同源残基可以通过结构比对、或通过一级结构比对来确定。

在一些实施例中，本发明的α-淀粉酶变体另外具有已知在其他微生物α-淀粉酶中产生性能、稳定性或溶解性益处的至少一个突变，所述微生物α-淀粉酶包括但不限于与SEQID NO:1-3、碳水化合物-活性酶数据库(CAZy)家族13淀粉酶、或迄今为止由描述性术语“Termamyl-样”引用的任何淀粉酶中的任一项具有类似折叠和/或具有60％或更大氨基酸序列同一性的那些α-淀粉酶。可以使用具有默认参数的Clustal W确定氨基酸序列同一性。

本发明的淀粉酶可包括任何数量的保守氨基酸取代。示例性保守氨基酸取代列于表2中。

表2.保守氨基酸取代

应当理解的是，一些前述保守突变可以通过遗传操作产生，而其他通过用遗传或其他方式将合成的氨基酸引入多肽中产生。

本发明的淀粉酶还可以衍生自通过在氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸(例如小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3或甚至小于2个取代、缺失或添加)的任何上述淀粉酶变体。此类变体应具有与其衍生的淀粉酶相同的活性。特定的缺失包括一个或几个氨基酸残基，例如1、2、3、4或5个氨基酸残基的N-末端和/或C-末端截短。

本发明的淀粉酶可以是“前体”、“未成熟”或“全长”的，在这种情况下，它们包含信号序列；或“成熟”的，在这种情况下，它们缺乏信号序列。成熟形式的多肽通常是最有用的。除非另有说明，本文使用的氨基酸残基编号是指相应淀粉酶多肽的成熟形式。只要所得的多肽保留淀粉酶活性，本发明的淀粉酶多肽也可被截短以除去N或C-末端。

本发明的淀粉酶可以是“嵌合”、“杂合”或“结构域交换(domain swap)”多肽，因为其包括第一淀粉酶多肽的至少一部分和第二淀粉酶多肽的至少一部分。本发明的淀粉酶可进一步包含异源信号序列，即允许跟踪或纯化等的表位。示例性异源信号序列来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(AmyE或AprE)、和链霉菌属(Streptomyces)CelA。

2.3.编码变体淀粉酶多肽的核苷酸

在另一方面，提供了编码变体淀粉酶多肽的核酸。所述核酸可以编码具体的淀粉酶多肽，或与具体淀粉酶具有指定程度的氨基酸序列同一性的淀粉酶。

在一些实施例中，所述核酸编码淀粉酶，所述淀粉酶与SEQ ID NO:1-3中的一个或多个具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸可以编码相同的多肽。

3.变体淀粉酶的生产

本发明的变体淀粉酶可以使用本领域熟知的方法，例如通过分泌或细胞内表达，在宿主细胞中产生。发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且可使用常规方法来制备浓缩的、含变体α-淀粉酶多肽的溶液。

对于生产规模的回收，可以如上一般情况下所述通过用聚合物絮凝除去细胞来富集或部分纯化变体α-淀粉酶多肽。可替代地，可以通过微滤富集或纯化酶，然后使用可用的膜和设备通过超滤进行浓缩。然而，对于一些应用，酶不需要富集或纯化，并且可以裂解和使用全培养液培养物而无需进一步处理。然后可以将酶加工成例如颗粒。

4.碳水化合物加工组合物和变体淀粉酶的用途

变体淀粉酶可用于本领域熟知的各种碳水化合物加工应用，因此本文不再赘述。这些用途包括燃料乙醇生产、糖浆生产以及其他有价值的生物化学品的生产。

4.1.淀粉底物的制备

用于制备用于本文公开的方法中的淀粉底物的方法是已知的。可以从例如块茎、根、茎、豆类、谷物或全谷类获得有用的淀粉底物。更具体地，可以从玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、蜀黍、西米、粟、木薯、树薯(tapioca)、高粱、稻、碗豆、菜豆、香蕉、或马铃薯中获得颗粒状淀粉。具体考虑的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是磨碎的或完整的，并且包括玉米固体，例如籽粒、麸皮和/或穗轴。淀粉也可以是高度精制的生淀粉或来自淀粉精制过程的原料。

4.2.淀粉的糊化和液化

糊化通常在淀粉底物与α-淀粉酶接触的同时进行或糊化之后淀粉底物与α-淀粉酶接触，尽管可以任选地添加另外的液化诱导酶。在一些实施例中，将如上文所述制备的淀粉底物用水制成浆料。液化也可以在液化温度下或低于液化温度的温度下进行，例如在“冷蒸煮”或“没有蒸煮的方法”中。

4.3.糖化

可以使用变体淀粉酶，任选地在另外一种或多种酶的存在下，将液化淀粉糖化成富含低DP(例如DP1+DP2)糖的糖浆。糖化的产物的确切组成取决于所使用的酶的组合以及所加工的颗粒状淀粉的类型。糖化和发酵可以同时进行或以重叠的方式进行(参见下文)。

4.4.异构化

可以将通过用淀粉酶处理生产的可溶性淀粉水解产物转化为基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。可以使用葡萄糖异构酶(特别是固定在固体支持物上的葡萄糖异构酶)来实现所述转化。

4.5.发酵

可溶性淀粉水解产物(特别是富含葡萄糖的糖浆)可以通过使淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵。EOF产品包括代谢产物，如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、衣康酸和其他羧酸、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸和其他氨基酸、ω3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1,3-丙二醇和其他生物材料。

产乙醇微生物包括表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和细菌(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas moblis))。产乙醇微生物的改善菌株是本领域已知的。酵母的商业来源包括ETHANOL

4.6.包含变体淀粉酶和另外的酶的组合物

变体淀粉酶可以与来自以下的葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)进行组合：例如，木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、踝节菌属(Talaromyces)、梭菌属(Clostridium)、镰刀菌属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、阿太菌属(Athelia)，腐质霉属(Humicola)、青霉属(Penicillium)、密瑚菌属(Artomyces)、褐褶菌属(Gloeophyllum)、密孔菌属(Pycnoporus)、齿耳菌属(Steccherinum)、栓菌属(Trametes)等。适合的商业葡糖淀粉酶，包括AMG 200L；AMG 300L；SAN

可以与淀粉酶一起使用的其他适合的酶包括植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、酯酶、甘露聚糖酶、氧化还原酶、不同的α-淀粉酶或其组合。

包含本发明淀粉酶的组合物可以是水性或非水性配制品、颗粒、粉末、凝胶、浆料、糊剂等，其可进一步包含本文列出的另外的酶中的任何一种或多种，以及缓冲液、盐、防腐剂、水、共溶剂、表面活性剂等。此类组合物可与内源酶或已存在于浆料、水浴、洗衣机、食品或饮料产品等中的其他成分(例如，内源植物(包括藻类)酶，来自先前加工步骤的残留酶等)组合起作用。

5.用于烘焙和食物制备的组合物和方法

本发明还涉及“食物组合物”，包括但不限于食品、动物饲料和/或食物/饲料添加剂(包含淀粉酶)，和用于制备这种食物组合物的方法(所述方法包括将变体淀粉酶与一种或多种食物成分混合)，或其用途。此外，本发明涉及淀粉酶在制备食物组合物中的用途，其中在添加本发明的多肽后烘焙食物组合物。

6.酿造组合物

本发明的变体淀粉酶可以是在酿造过程(即制备发酵的麦芽饮料)中使用的酿造组合物的组分。非可发酵碳水化合物形成最终啤酒中的大部分溶解固体。这种残余物的存留是因为麦芽淀粉酶不能够水解淀粉的α-1,6-键。非可发酵碳水化合物贡献约50卡路里/12盎司啤酒。淀粉酶，其与葡糖淀粉酶和任选的支链淀粉酶和/或异淀粉酶组合，有助于将淀粉转化为糊精和可发酵糖，降低最终啤酒中残留的非可发酵碳水化合物。

7.纺织品脱浆组合物

还考虑了使用淀粉酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域中熟知的(参见例如，美国专利号6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的淀粉酶接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。

8.清洁组合物

本发明的组合物和方法的一个方面是包含淀粉酶作为组分的清洁组合物。淀粉酶多肽可以用作洗涤剂组合物中的组分，用于例如手洗、衣物洗涤、餐具洗涤、和其他硬表面清洁。此类组合物包括重垢液体(HDL)、重垢干(HDD)和手洗(手动)衣物洗涤剂组合物，包括单位剂量形式的衣物洗涤剂组合物，和自动餐具洗涤(ADW)和手洗(手动)餐具洗涤组合物，包括单位剂量形式的餐具洗涤组合物。

8.1.概述

淀粉酶多肽可以是洗涤剂组合物的组分，作为唯一的酶或与包括其他淀粉分解酶的其他酶一起。由此，它可以按无尘颗粒、稳定化液体、或受保护的酶的形式包含在洗涤剂组合物中。

洗涤剂组合物可以是任何有用的形式，例如粉末、颗粒、糊剂、条状、或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂。它也可以是仅含有约30％水的紧密凝胶类型的形式。洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，每种表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、或兼性离子的。所述洗涤剂组合物可以另外包含一种或多种其他酶，例如任何组合的蛋白酶、另一种淀粉分解酶、甘露聚糖酶、角质酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酸裂合酶、过水解酶、木聚糖酶、过氧化物酶、和/或漆酶。

用于包含本发明的α-淀粉酶的具体形式的洗涤剂组合物描述如下。这些组合物中的许多可以按单位剂量形式提供以便于使用。单位剂量配制品和包装描述于例如US20090209445 A1、US 20100081598 A1、US 7001878 B2、EP 1504994 B1、WO 2001085888A2、WO 2003089562 A1、WO 2009098659 A1、WO 2009098660 A1、WO 2009112992 A1、WO2009124160 A1、WO 2009152031 A1、WO 2010059483 A1、WO 2010088112 A1、WO2010090915 A1、WO 2010135238 A1、WO 2011094687 A1、WO 2011094690 A1、WO2011127102 A1、WO 2011163428 A1、WO 2008000567 A1、WO 2006045391 A1、WO2006007911 A1、WO 2012027404 A1、EP 1740690 B1、WO 2012059336A1、US 6730646 B1、WO2008087426 A1、WO 2010116139 A1、和WO 2012104613 A1中。

8.2.重垢液体(HDL)衣物洗涤剂组合物

示例性HDL衣物洗涤剂组合物包含去污表面活性剂(10％至40％wt/wt)，包括阴离子清洁表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)和任选地非离子表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)，其中阴离子清洁表面活性剂(具有从6.0至9的亲水指数(HIc))与非离子清洁表面活性剂的重量比大于1:1。适合的去污表面活性剂还包括阳离子去污表面活性剂(选自以下的组：烃基吡啶鎓化合物、烃基季铵化合物、烃基季鏻化合物、烃基叔锍化合物、和/或其混合物)；兼性离子和/或两性去污表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱的组)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物。

所述组合物可以任选地包括由两亲烷氧基化油脂清洁聚合物组成的表面活性增强聚合物，该两亲烷氧基化油脂清洁聚合物(选自以下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如烷氧基化聚亚烷基亚胺(在0.05wt％-10wt％范围内))和/或无规接枝聚合物(典型地包含含有选自下组的单体的亲水主链，该组由以下组成：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(例如甘油)及其混合物)；以及一个或多个疏水侧链，该疏水侧链选自下组，该组由以下组成：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C1-C6单羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯及其混合物)。

组合物可以包含另外的聚合物，例如污垢释放聚合物(包括阴离子封端的聚酯(例如SRP1)；包含至少一种单体单元的聚合物(处于无规或嵌段构型)，该单体单元选自糖、二羧酸、多元醇及其组合；基于乙二醇对苯二甲酸酯的聚合物及其处于无规或嵌段构型的共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6、Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325、Marloquest SL)；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％，包括羧酸酯聚合物，例如包含至少一种单体的聚合物，该单体选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或聚乙二醇，分子量范围为从500至100,000Da)；纤维素聚合物(包括那些选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的纤维素聚合物，它们的实例包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及其混合物)和聚合羧酸酯(如马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或者聚丙烯酸酯均聚物)。

所述组合物可以进一步包含饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0wt％至10wt％)；沉积助剂(其实例包括多糖；优选纤维素聚合物；聚联丙烯二甲基卤化铵(DADMAC))；和DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物及其混合物的共聚物(处于无规或嵌段构型)；阳离子瓜耳胶；阳离子纤维素，例如阳离子羟乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺，及其混合物。

所述组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)、次氮基三乙酸(NTA)、4,5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)、及其衍生物。

所述组合物优选地包含选自以下的酶(通常约0.01wt％活性酶至0.03wt％活性酶)：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其任何混合物。组合物可以包含酶稳定剂(其实例包括多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可逆蛋白酶抑制剂；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸)。

所述组合物任选地包含硅树脂或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％至5wt％，选自由以下组成的组：甘油二酸酯和甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物)。

组合物可以是任何液体形式，例如液体或凝胶形式，或其任何组合。所述组合物可以处于任何单位剂量形式，例如小袋。

8.3.重垢干/固体(HDD)衣物洗涤剂组合物

示例性HDD衣物洗涤剂组合物包含去污表面活性剂，其包括阴离子去污表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)；非离子去污表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧基化物和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)；阳离子去污表面活性剂(例如，烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物，烷基三元锍化合物及其混合物)；兼性离子和/或两性去污表面活性剂(例如，链烷醇胺磺基甜菜碱)、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂；及其混合物；助洗剂，包括无磷酸盐助洗剂(例如沸石助洗剂，其实例包括在0wt％至小于10wt％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)，磷酸盐助洗剂(例如在0wt％至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠)，柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸，硅酸盐(例如，在0wt％至小于10wt％的范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠，或层状硅酸盐(SKS-6)))；碳酸盐(例如，在0wt％至小于80wt％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂，包括光漂白剂(例如磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物)；疏水或亲水性漂白活化剂(例如十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐(nitrile quats)及其混合物)；过氧化氢源(例如，无机过氧水合物盐，其实例包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；预成型的亲水和/或疏水过酸(例如过羧酸和盐、过碳酸和盐、过碘酸和盐，过氧单硫酸和盐、及其混合物)；和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白增效剂(其实例包括亚胺阳离子和聚离子))；亚胺兼性离子、改性胺、改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮及其混合物)；以及含金属的漂白催化剂(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(例如锌或铝)和螯合剂(例如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)、及其水溶性盐))。

组合物优选地包含酶，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其任何混合物。

所述组合物可以任选地包含另外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、调色剂、另外的聚合物(包括织物完整性和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物柔顺剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化聚胺、织物沉积助剂和/或环糊精。

8.4.自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物

示例性ADW洗涤剂组合物包含非离子表面活性剂，包括乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇或胺氧化物表面活性剂，它们以0％至10％(按重量计)的量存在；在5％-60％范围内的助洗剂，所述助洗剂包括：磷酸盐助洗剂(例如单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐、其他低聚磷酸盐、三聚磷酸钠-STPP)，和无磷酸盐助洗剂(例如基于氨基酸的化合物，包括甲基-甘氨酸-二乙酸(MGDA)及其盐和衍生物、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其盐和衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐)，多元羧酸及其部分或完全中和盐的均聚物和共聚物，单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐，它们在0.5％至50％(按重量计)的范围内；在约0.1％至约50％(按重量计)的范围内的磺化/羧化聚合物以提供尺寸稳定性；在约0.1％至约10％(按重量计)范围内的干燥助剂(例如，聚酯，尤其是阴离子聚酯(任选地与具有利于缩聚的3至6个官能团-通常是酸、醇或酯官能团的另外的单体一起)，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其前体化合物，特别是反应性环状碳酸酯和尿素类型)；在约1％至约20％(按重量计)的范围内的硅酸盐(包括硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；无机漂白剂(例如，过氧水合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸、和二过氧十六烷二酸)；漂白活化剂(即有机过酸前体，其在约0.1％至约10％(按重量计)的范围内)；漂白催化剂(例如锰三氮杂环壬烷及相关络合物、Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物、以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；在约0.1％至5％(按重量计)的范围内的金属护理剂(例如苯并三氮唑、金属盐和络合物、和/或硅酸盐)；每克自动餐具洗涤剂组合物的从约0.01mg至5.0mg活性酶范围内的酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其混合物)；以及酶稳定剂组分(例如寡糖、多糖、和无机二价金属盐)。

8.5.另外的酶

本文描述的清洁组合物中的任何一个均可以包含任何数量的另外的酶。通常，所述一种或多种酶应与所选择的洗涤剂相容(例如，在pH最佳、与其他酶和非酶成分的相容性等方面)，并且所述一种或多种酶应以有效量存在。提供以下酶作为实例。

适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体，连同天然加工的蛋白质。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。示例性蛋白酶包括但不限于WO 95/23221、WO 92/21760、WO 2008010925、WO20100566356、WO 2011072099、WO 201113022、WO 2011140364、WO 2012151534、WO2015038792、WO 2015089441、WO 2015089447、WO 2015143360、WO 2016001449、WO2016001450、WO 2016061438、WO 2016069544、WO 2016069548、WO 2016069552、WO2016069557、WO 2016069563、WO 2016069569、WO 2016087617、WO 2016087619、WO2016145428、WO 2016174234、WO 2016183509、WO 2016202835、WO 2016205755、US20080090747、US 5,801,039、US 5,340,735、US 5,500,364、US 5,855,625、RE 34,606、US5,955,340、US 5,700,676、US 6,312,936、US 6,482,628、US 8530219，美国临时申请号62/331282、62/343618、62/351649、62/437171、62/437174、和62/437509，和PCT申请号PCT/CN2017/076749中描述的那些；以及WO 2007/044993、WO 2009/058303、WO 2009/058661、WO2014/071410、WO 2014/194032、WO 2014/194034、WO 2014/194054和WO 2014/194117中描述的金属蛋白酶。

示例性商业蛋白酶包括但不限于MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、

适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的、蛋白水解修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质酶属(Humicola)(同义词噬热真菌属)的脂肪酶，例如来自绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如EP 258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如WO 96/13580)；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；参见例如EP 218 272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331 376)；施氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB1,372,034)；萤光假单胞菌(P.fluorescens)；假单胞菌属物种菌株SD 705(参见例如WO95/06720和WO 96/27002)；威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(参见例如WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶(例如，来自枯草芽孢杆菌；参见例如，Dartois等人，Biochemicaet Biophysica Acta[生物化学与生物物理学报],1131:253-360(1993))；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(参见例如JP 64/744992)；或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422)。考虑用于配制品中的另外的脂肪酶变体包括例如WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。

示例性商业脂肪酶包括但不限于M1 LIPASE、LUMA FAST和LIPOMAX(杰能科公司(Genencor))；

聚酯酶：适合的聚酯酶可以包括在组合物中，例如描述于例如WO 01/34899、WO01/14629、和US 6933140中的那些。

本发明的组合物可以与其他淀粉酶组合，包括其他α-淀粉酶。当不同的α-淀粉酶表现出不同的性能特征并且多种不同的α-淀粉酶的组合导致提供不同α-淀粉酶的益处的组合物时，这种组合是特别令人希望的。其他淀粉酶包括可商购的淀粉酶，例如但不限于

适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属(Fusarium)、梭孢壳属、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如，在例如美国专利号4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757；和WO 89/09259中公开的从特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。考虑使用的示例性纤维素酶是对纺织品具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是描述于例如EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、和WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，例如WO 94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK 98/00299；EP 531315；美国专利号5,457,046；5,686,593；和5,763,254中描述的那些。示例性纤维素酶包括WO 2005054475、WO2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US 4,435,307、EP 0495257、和美国临时申请号62/296,678和62/435340中描述的那些。示例性商业纤维素酶包括但不限于

示例性甘露聚糖酶包括但不限于：细菌或真菌来源的那些，例如像WO2016007929；USPN 6,566,114、6,602,842、和6,440,991，以及国际申请号PCT/US 2016/060850和PCT/US 2016/060844中所述的。示例性甘露聚糖酶包括但不限于：细菌或真菌来源的那些，例如像WO 2016007929；USPN 6566114、6,602,842、和6,440,991，以及国际申请号PCT/US 2016/060850和PCT/US 2016/060844中所述的。

考虑用于组合物中的适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶、及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中所述的那些。可商购的过氧化物酶包括例如GUARDZYME

洗涤剂组合物还可以包含2,6-β-D-果聚糖水解酶，其对于除去/清洁存在于家用和/或工业纺织品/衣物上的生物膜是有效的。

通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂，可以将一种或多种洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆料等。示例性洗涤剂添加剂配制品包括但不限于颗粒(特别是无尘颗粒)、液体(特别是稳定的液体)或浆料。

洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如条状、片剂、粉末、颗粒、糊剂、或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂。还考虑了含有约30％或更少水的紧密洗涤剂凝胶。

WO 2013063460中描述了许多示例性洗涤剂配制品，其中可以向这些配制品中添加本发明的淀粉酶(或在一些情况下所述淀粉酶被鉴定为这些配制品的组分)。这些包括可商购的单位剂量洗涤剂配制品/包装，例如

8.6.评估洗涤剂组合物中淀粉酶活性的方法

本领域已知许多α-淀粉酶清洁测定，包括样本和微样本测定。所附实例仅描述了少数此类测定。

为了进一步说明组合物和方法及其优点，给出以下具体实例，应理解它们是说明性的而不是限制性的。

出于所有目的，本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文并入本文。为了进一步说明组合物和方法及其优点，给出以下具体实例，应理解它们是说明性的而不是限制性的。

实例

实例1：方法

BspAmy24的结构建模

如下构建BspAmy24的同源模型。将BspAmy24的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)用作MOE(化学计算集团公司(Chemical Computing Group)，蒙特利尔，加拿大)中的查询来检索公共结构数据库。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶(1BLI)是最高公共命中。使用具有所有默认参数的“同源模型”功能来创建模型。还确定了BspAmy24变体的X射线衍射晶体结构；此实验结构与同源模型非常匹配，并且支持用同源模型进行的分析。

细胞生长和蛋白定量

在遵循标准克隆程序以引入适当的DNA序列后，在地衣芽孢杆菌细胞中表达BspAmy24-V1(具有残基R181和G182的缺失)和BspAmy24-V1的变体。细胞在适于地衣芽孢杆菌分泌蛋白表达的表达培养基中生长68小时。通过离心收获分泌蛋白，随后通过0.45μm膜(EMD密理博公司(EMD Millipore))过滤。在一些情况下，使用苯基琼脂糖6快速流动树脂(通用电气医疗公司(GE Healthcare))进行离子交换色谱法，进行另外的纯化。通过高效液相色谱法(HPLC)和在280nm处的吸光度确定蛋白质浓度。

酶性能测定和pK

使用微样本测定测量在不同pH值下的α-淀粉酶的活性。在含有两个微样本的96孔微量滴定板中(棉布上，CS28淀粉污渍与染料，测试材料中心(Center forTestmaterials)，弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰)，将稀释的酶添加到具有2mM CaCl

实例2：使用α-淀粉酶变体获得的结果

测量四个变体的pK

对于四个变体(即T40N、F261Y、S286D和Y362L)，测量了若干个pH值下的α-淀粉酶活性，并且用于确定来自曲线拟合的表观pK

表3.四个变体的pK

七个另外的变体的活性比

对于另外七个变体，在pH 8.5和pH 10.5测量了活性，并且根据下式，确定了在pH8.5的活性与在pH 10.5的活性之比(在此上下文中的“WT”是del-R181-G182分子)：

表4中的数据显示，相对于野生型酶，这些另外的突变具有增加的活性比。

表4.七个另外的变体的活性比