一种香水柠檬果精油的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及香水柠檬果的应用领域，尤其是一种香水柠檬果精油的制备方 法及其应用。

背景技术

柠檬学名Citrus limon(L.)Burm.F又名柠果、洋柠檬，属芸香科(Rutaceae) 柑橘属常绿小乔木。我国柠檬种植面积约100千公顷，产量约232万吨，是全 球第三大柠檬生产国，其中香水柠檬是主要种植品种。柠檬果含有有机酸、挥 发性油、各种维生素及叶绿素等组分。所以用途有多种，果皮用于制酱、提取 果胶和提取香精；果汁用于酿制柠檬果醋、碳酸饮料和啤酒等；果胚制作蜜饯 等一些初级食品加工的技术层面，也有制作一些高级食品的添加剂和保健品。

我国大面积的种植带来大产量，不仅满足了国内的柑橘橙类水果需求，也 满足了出口需求，但大产量的背后同时也带来大量的废弃资源。由于香水柠檬 一年四季花果不断，几乎周年不断收果，因此存在了大量夭折的和销售的弃果， 种植户在果园的堆积这些生产垃圾，不仅会浪费人力、财力、物力和空间资源， 还会对周围的环境造成一定的生态污染。目前市场上一些驱蚊产品是化学合成 的药物对人体有一定的积累性危害，而植物精油驱蚊产品只有单一的驱蚊效果。 缺少具备抗蚊、抗菌等多功能的防抗蚊产品。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种提取 方式简单、原材料方便易得、成本低的香水柠檬果精油的制备方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种香水柠檬果精油的制 备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选取香水柠檬果；(2)采用水蒸气 蒸馏法提取步骤(1)中选取的香水柠檬果；

其中，所述水蒸气蒸馏法，包括如下步骤：(a)香水柠檬果预处理；(b) 将步骤(a)中预处理后的香水柠檬果和水混合，进行蒸馏，得到提取液；(c) 将步骤(b)中的提取液分液处理，并加入干燥剂，经过微孔滤膜过滤后，得到 所述香水柠檬果精油。

本发明步骤(1)中选取的香水柠檬果来自于香水柠檬种植园，本申请发明 人与香水柠檬种植园的农户合作，收取种植过程中产生的大量的废弃植物资源， 本申请所用主要香水柠檬为夭折和销售不出去的弃果。本申请发明人通过水蒸 气蒸馏法提取香水柠檬果精油，提取方法简单快捷，便于后续对香水柠檬果精 油应用的研究。

优选地，所述步骤(b)中，香水柠檬果和水的质量体积比为：香水柠檬果： 水＝1g:(0.5～5)mL，蒸馏的温度为94～114℃，蒸馏的时间为0.5～3.0h；进一 步优选地，所述步骤(b)中，香水柠檬果和水的质量体积比为：香水柠檬果： 水＝1g:1mL，蒸馏的温度为103-104℃，蒸馏的时间为1.5～2.0h。

优选地，所述步骤(c)中，干燥剂为无水硫酸镁，微孔滤膜的孔径为0.1～0.45 μm。进一步优选地，微孔滤膜的孔径为0.25μm。

此外，本发明还提供了采用上述的制备方法制备得到的香水柠檬果精油。

优选地，所述的香水柠檬果精油，包含以下成分：右旋萜二烯、(E)-3,7-二 甲基-2,6-辛二烯醛和(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛。

优选地，所述的香水柠檬果精油，还包含以下成分：3,7-二甲基-1,6-辛二烯 -3-醇、(-)-异蒲勒醇、3,7-二甲基-6-辛烯醇、(1R,2R,5S)-5-Methyl-2-(prop-1-en-2- yl)cyclohexanol、2-(4-甲基-3-环己烯基)-2-丙醇和3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇。

进一步优选地，所述的香水柠檬果精油，包含以下质量分数的成分：右旋 萜二烯49.63％、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛17.02％、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯 醛11.39％、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇2.47％、(-)-异蒲勒醇4.24％、3,7-二甲基 -6-辛烯醇5.37％、(1R,2R,5S)-5-Methyl-2-(prop-1-en-2-yl)cyclohexanol 2.61％、 2-(4-甲基-3-环己烯基)-2-丙醇4.35％和3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇2.92％。

进一步地，本发明还提供了所述的香水柠檬果精油在驱蚊、抗菌产品中的 应用。

优选地，所述香水柠檬果精油的质量浓度为0.004～0.033g/mL(g)。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)对香水柠檬废弃果资源进行 了综合利用，实现了变废为宝，提升了废弃资源的附加值，助力生态农业建设， 帮助农业生产实现零污染、零排放。(2)以天然提取精油为原料，产品绿色、 无毒且具有抗蚊、抗菌的多功能性。

附图说明

图1为香水柠檬果精油对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的抑制效果图；

图2为香水柠檬果精油对表皮葡萄球菌(ATCC12228)的抑制效果图；

图3为香水柠檬果精油对白色葡萄球菌(ATCC29213)的抑制效果图；

图4为香水柠檬果精油对鼠伤寒沙门氏菌(CMCC50115)的抑制效果图；

图5为香水柠檬果精油对大肠杆菌(CMCC44102)的抑制效果图；

图6为右旋萜二烯和3,7-二甲基-6-辛烯醛对白纹伊蚊幼虫毒性拟合结果图； 图(a)为右旋萜二烯，图(b)为3,7-二甲基-6-辛烯醛；

图7为香水柠檬果精油的GC-MS谱图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实 施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本申请所述香水柠檬果精油的制备方法，包括如下步骤：(1)选取香水柠 檬果；(2)采用水蒸气蒸馏法提取步骤(1)中选取的香水柠檬果；

其中，所述水蒸气蒸馏法，包括如下步骤：(a)香水柠檬果预处理；(b) 将步骤(a)中预处理后的香水柠檬果和水混合，其中，香水柠檬果和水的质量 体积比为：香水柠檬果：水＝1:1，进行蒸馏，蒸馏的温度为103℃，蒸馏的时间 为2h，得到提取液；(c)将步骤(b)中的提取液分液处理，并加入干燥剂， 经过微孔滤膜过滤后，其中，微孔滤膜的孔径为0.25μm，得到所述香水柠檬果 精油。

实施例2

本申请所述香水柠檬果精油的制备方法，包括如下步骤：(1)选取香水柠 檬果；(2)采用水蒸气蒸馏法提取步骤(1)中选取的香水柠檬果；

其中，所述水蒸气蒸馏法，包括如下步骤：(a)香水柠檬果预处理；(b) 将步骤(a)中预处理后的香水柠檬果和水混合，其中，香水柠檬果和水的质量 体积比为：香水柠檬果：水＝1:0.5，进行蒸馏，蒸馏的温度为114℃，蒸馏的时 间为0.5h，得到提取液；(c)将步骤(b)中的提取液分液处理，并加入干燥剂， 经过微孔滤膜过滤后，其中，微孔滤膜的孔径为0.45μm，得到所述香水柠檬果 精油。

实施例3

本申请所述香水柠檬果精油的制备方法，包括如下步骤：(1)选取香水柠 檬果；(2)采用水蒸气蒸馏法提取步骤(1)中选取的香水柠檬果；

其中，所述水蒸气蒸馏法，包括如下步骤：(a)香水柠檬果预处理；(b) 将步骤(a)中预处理后的香水柠檬果和水混合，其中，香水柠檬果和水的质量 体积比为：香水柠檬果：水＝1:5，进行蒸馏，蒸馏的温度为94℃，蒸馏的时间 为3h，得到提取液；(c)将步骤(b)中的提取液分液处理，并加入干燥剂， 经过微孔滤膜过滤后，其中，微孔滤膜的孔径为0.1μm，得到所述香水柠檬果 精油。

本发明采用实施例1所述制备方法制备得到的香水柠檬果纯精油，进行效 果验证，具体如下所示，实施例2-3所述制备方法制备得到的香水柠檬果纯精油， 效果验证与实施例1相似，在此不一一赘述：

试验例1香水柠檬果精油抑菌圈测定

试验过程：试验过程选用实施例1制备得到的香水柠檬果纯精油和以DMSO 为溶剂配制香水柠檬果精油样品溶液浓度为512mg/mL，并设立DMSO为空白 对照，加替沙星药物为阳性对照，通过滤纸片－琼脂扩散法测定。实验时往涂 布好细菌的培养基上铺上6mm的灭菌滤纸片，再往滤纸片上滴加5μL的样品 溶液，空白组滴加5μL的DMSO溶剂。培养基放置在恒温培养箱内，37℃培 养24h后观察结果。

试验结果：如表1所示

表1香水柠檬果精油抑菌圈活性结果

注：DMSO空白对照组无抑菌圈出现，表明DMSO无抑菌效果，即以DMSO 为溶剂配制样品不会影响实验结果的准确性。

由表1可知，香水柠檬果精油对常见的细菌有抑制作用，表明香水柠檬果 精油具有抑菌活性。

试验例2最小抑菌浓度MIC和最小杀菌浓度MBC测试

试验过程：DMSO配制香水柠檬果精油，使实验终浓度为512、256、128、 64、32、16、8mg/mL，并以DMSO为空白对照和阴性对照、加替沙星为药物 阳性对照，用96孔板测定。样品组的每个微孔加5μL样品液和195μL菌悬液， 空白组加5μL DMSO和195μL液体培养基。微孔板放置恒温培养箱内，37℃ 培养16～24h后观察结果；从测定MIC的微孔中选取无细菌生长的微孔，取50 μL涂布于平板培养基上，放置37℃恒温培养箱内，培养24h后观察结果，无 细菌生长的香水柠檬果精油浓度为对应的MBC值。

试验结果：如表2所示

表2香水柠檬果精油MIC、MBC活性结果

结果如表2所示，进一步表明香水柠檬果精油对实验所选的5种细菌具有 明显的生长抑制活性。

试验例3香水柠檬果精油抑菌动力学测定

试验过程：根据所测定的最小抑菌浓度MIC值，设定0.5倍MIC,1倍MIC 以及2倍MIC浓度，以DMSO为空白对照和阴性对照、加替沙星为药物阳性对 照，用96孔板测定，放37℃恒温培养箱中培养24h，并利用多功能酶标仪每隔 1个小时测定OD值以跟踪细菌的生长情况，连续监测24h。

试验结果：如图1-5所示，结果表明香水柠檬果精油对实验所选的5种细菌 具有明显的生长抑制活性，但对细菌的抑制活性也受时间影响和显著的剂量依 赖性，这主要与精油的挥发性有关，抑菌动力学活性测试研究了香水柠檬果精 油在不同浓度的情况下抑菌作用随着时间的变化情况，结果显示高浓度情况下 抑菌作用明显，低浓度情况下抑菌作用有所波动，表现为前期抑菌作用明显， 后期抑菌作用不足，精油的挥发性对实验存在一定的影响。

试验例4白纹伊蚊幼虫毒杀测试

试验过程：以丙酮为溶剂配制香水柠檬果精油样品溶液，设置柠檬果精油 浓度为150,200,250,300,350,400,450,500,550ppm的测试组，以丙酮为空白 对照和溴氰菊酯作为以阳性药物，采用24孔板高通量法测定。测试温度26.5- 28.0℃，湿度60％-80％，利用Origin8.5软件进行非线性拟合，得出回归方程， 评估其急性毒性。

实验方法：取出一盆幼虫，使用5mL的塑料吸管来吸取幼虫，打开新的24 孔板，吸取5条三龄末至四龄初的白纹伊蚊幼虫，放置在24孔板的测试孔中， 用吸管尽量吸干净幼虫带进去的水体。吸取985uL的纯水，转移至24孔板的测 试孔，吸取13mg/mL的饲料溶液5uL，滴加入测试孔，吸取10uL的各浓度梯度 的柠檬果精油溶液，滴加入各测试孔中，使柠檬果精油测试终浓度介于150～550 ppm之间(1ppm＝1mg/L)。每个浓度梯度设置3个平行组和阴性对照组(以丙 酮对对照)，滴加后盖上24孔板的盖子，轻轻摇晃24孔板，使溶液混合均匀， 记录实验开始的时间。

试验结果：结果如表3～4所示

表3香水柠檬果精油对白纹伊蚊幼虫急性毒性结果

表4香水柠檬果精油对白纹伊蚊幼蚊急性毒性结果

由表3～4可知，香水柠檬果精油可以杀死白纹伊蚊幼虫，且具有剂量依赖 性。结果表明，当香水柠檬果精油在含量达到248.6ppm、384.81ppm和595.64ppm 时可对白纹伊蚊幼虫的灭杀有20％、50％和80％的致死量。

丙酮空白对照组中白纹伊蚊幼虫无死亡情况，表明丙酮对白纹伊蚊幼虫无 灭杀效果，表明以丙酮为溶剂配制样品不会影响实验结果的准确性。

试验例5白纹伊蚊成蚊毒杀测试

试验过程：此实验采用采用Tarsal测试法测定样品对白纹伊蚊成蚊的毒杀 效果，依据为1cm

试验方法：吸取1000μL的各浓度梯度的柠檬果精油样品液滴加在底面积为 20cm

试验结果：结果如表5～6所示

表5香水柠檬果精油对白纹伊蚊成蚊灭杀结果

表6香水柠檬果精油对白纹伊蚊幼虫急性毒性结果

结果如表5～6所示，表明香水柠檬果精油可以杀死白纹伊蚊成蚊，且具有 剂量依赖性。结果表明，当香水柠檬果精油在含量达到95.180(μg/cm

丙酮空白对照组中白纹伊蚊成蚊无死亡情况，表明丙酮对白纹伊蚊成蚊无 灭杀效果，表明以丙酮为溶剂配制样品不会影响实验结果的准确性。

试验例6香水柠檬果精油成分分析

试验过程：通过气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对香水柠檬果精油进行定 性、定量分析。采用峰面积归一化法计算精油中各组分的峰面积相对质量分数， 然后选取相对质量分数大于0.1％的化学成分进行分析。与正构烷烃标准品对照 品C

试验结果：香水柠檬果精油成分分析的GC-MS谱图如图6所示，香水柠檬 果精油主要成分如表7所示

表7香水柠檬果精油主要成分

试验例7香水柠檬果精油主要成分毒杀白纹伊蚊幼虫、成蚊活性测定

采用与实验例4、例5相同的方法对香水柠檬果精油中的右旋萜二烯、3,7- 二甲基-6-辛烯醛两种主要成分，分别进行白纹伊蚊幼虫、成蚊活性毒杀测定。 由于右旋萜二烯单一成分具备强挥发性，测试以丙酮与苯基硅油的体积配比为 10:1的混合液作为溶剂配制不同浓度的右旋萜二烯样品溶液，且由空白组可确 定以丙酮和苯基硅油的混合液作为溶剂不会影响实验结果的准确性。由于单一 成分对成蚊活性较低，只进行测试不进行结果拟合。

试验结果：结果如表8～12所示

表8右旋萜二烯对白纹伊蚊幼虫灭杀结果

表9 3,7-二甲基-6-辛烯醛对白纹伊蚊幼虫灭杀结果

表10右旋萜二烯对白纹伊蚊成蚊灭杀结果

表11 3,7-二甲基-6-辛烯醛对白纹伊蚊成蚊灭杀结果

表12右旋萜二烯和3,7-二甲基-6-辛烯醛对白纹伊蚊幼虫急性毒性结果

由表8～12可知，右旋萜二烯、3,7-二甲基-6-辛烯醛单一成分可以杀死白纹 伊蚊幼虫且具有剂量依赖性。结果表明对于白纹伊蚊幼虫毒杀效果，LC

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。