一种油脂脱酸方法

技术领域

本发明属于油脂加工领域，具体涉及一种油脂脱酸方法。

背景技术

动植物油在其制造加工、收集、运输和储藏过程中受外界环境、自身水分和脂肪酶的影响，会水解生成大量的游离脂肪酸(Free fatty acid，FFA)，成为高酸值动植物毛油，反过来给其储存加工等过程带来更大挑战，质量也会深受影响。

因此，高效、环保脱酸是动植物油脂精炼的关键环节。现有的脱酸方法主要有碱炼脱酸(FFA与碱类物质中和反应)、物理脱酸(真空蒸馏)和酶法脱酸。

碱炼脱酸和物理脱酸是大宗油脂加工工艺中常用的方法。在碱炼脱酸中，碱(如氢氧化钠)被加入到动植物油脂中，从而使FFA沉淀为皂基，通过离心或水洗将其除去，但该方法会造成中性油的损失，并且在这种过程中产生的废水难以处理。物理脱酸是在高温高真空的条件下进行，温度一般在240℃以上，能耗大，容易造成油脂中功能性小分子的氧化分解，故上述两种方法均有其局限性。

酶法脱酸被认为是一种更绿色环保的工艺，与其它脱酸方法相比，其突出优点在于反应条件温和(反应温度一般低于70℃)、能耗低、中性油及功能性脂质小分子保留率高、反应过程易操控、适用范围广，现越来越受到行业和科研工作者的关注。

现有的酶法脱酸一般是利用脂肪酶催化FFA与特定的酰基受体结合达到脱酸的作用。一方面，脂肪酶的存在导致中性油脂的水解损失(油脂中甘油三酯的水解)，并产生更多的FFA，影响产品质量，且酰基化反应得到的甲酯等副产物也较难从油脂中分离；另一方面，研究发现，天然动植物油脂中除了甘油三酯、FFA，还含有一定量的甘油二酯、甾醇等营养成分，这些物质在油脂加工过程中需要尽可能地被保留下来，而脂肪酶对甘油二酯等均有催化作用，会造成这些营养成分的大量损失。因此，开发高酸油脂高效脱酸专用酶制剂，建立一种真正可行的高酸油脂工业脱酸工艺具有重要意义。

发明内容

为克服酶法脱酸过程中脂肪酶造成的产品质量不高、应用成本高昂的问题，本发明首次提出利用一种来源于微藻的新型光脱羧酶(Chlorella variabilis fatty acidphotodecarboxylase，CvFAP)加工油脂进行酶法脱酸的方法。CvFAP是一种新型光驱动酶，无需添加昂贵的辅因子，即可利用蓝光催化FFA转化生成烷(烯)烃，代表着全新的应用领域。

在本发明中，首次利用CvFAP的脱羧特性，无需昂贵的辅酶因子，无需引入酰基受体等其它杂质和副反应，即可选择性地对油脂中的FFA进行催化脱羧，除去油脂中的FFA。该方法脱酸效率高，且工艺简单、产物易分离、中性油脂回收率高、反应条件温和，具有良好的产业化应用前景。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种油脂脱酸方法，包括以下步骤：

(1)将质粒pET28a-CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞，培养至OD

所述的将质粒pET28a-CvFAP导入大肠杆菌感受态细胞，优选使用现有技术的热激转化法；

所述的大肠杆菌感受态细胞优选大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；

所述的培养是37℃下在含50μg/mL卡那霉素的超级肉汤(Terrific Broth，TB)中培养；

所述的洗涤并重悬是使用Tris-HCl缓冲液；

所述的蛋白酶抑制剂为苯甲基黄酰氟，添加量为终浓度1mM；

(2)在蓝光照射下，将CvFAP@E.coli细胞制剂与油脂混合，20-37℃下反应4h以上，反应以CvFAP@E.coli细胞为催化剂，以油脂中的FFA为底物，进行脱羧反应，除去油脂中FFA；反应结束后，取反应混合物离心，所得上层澄清油样即为脱除FFA的油脂；

所述的油脂可以是来源于植物或动物的油脂，比如大豆油、棕榈油或米糠油；

所述的细胞制剂中，CvFAP@E.coli细胞的浓度优选0.06-0.20g/mL；

步骤(2)中的反应温度优选30℃；

步骤(2)中，以湿重计，CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:(100-500)μL，优选0.25g:300μL。

所述的蓝光，功率10W，电压220V，波长400-520nm。

所述的离心，优选在10000rpm下离心3min。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明针对现有的酶法脱酸过程中脂肪酶催化副反应多、产品质量不高、应用成本高昂的缺点，首次将CvFAP应用于高酸值油脂的脱酸工艺中，仅利用蓝光，无需添加额外辅因子和酰基受体，即可实现油脂的高效脱酸。

(2)本发明采用常用水相体系，反应体系简单，反应条件温和，脱酸效果好；产物为简单的烷烯烃混合物，与甘油三脂成分的熔沸点差异较大，容易利用蒸馏技术分离，且中性油脂不参与反应，CvFAP对FFA具有专一性催化反应特点，不会对中性的油脂发生作用，回收率高，为油脂的酶法脱酸工艺提供了一个崭新的思路，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1是含有空质粒pET28a载体的大肠杆菌细胞对不同油脂的脱酸效果。

图2是大豆油经CvFAP@E.coli脱酸处理前后游离脂肪酸含量的变化曲线。

图3是棕榈油经CvFAP@E.coli脱酸处理前后游离脂肪酸含量的变化曲线。

图4是米糠油经CvFAP@E.coli脱酸处理前后游离脂肪酸含量的变化曲线。

图5是细胞加量和温度影响下大豆油中游离脂肪酸含量的变化曲线；A-细胞加量影响下的变化曲线；B-温度影响下的变化曲线。

图6是CvFAP@E.coli对不同比例大豆油油脂的脱酸效果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

材料与试剂：质粒pET28a-CvFAP和空载质粒pET28a均为本实验室保存。质粒pET28a-CvFAP的构建方法见文献(Sorigué D.,Légeret B.,Cuiné S.,et al.An algalphotoenzyme converts fatty acids to hydrocarbons[J].Science,2017,357(6354):903-907)；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自唯地生物科技有限公司；质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

本发明中，油类基本品质特性检测方法如下：

脱酸产物分析：采用了高效液相色谱仪(HPLC，Waters，1525)，该色谱仪配备Phenomex Luna二氧化硅液相色谱柱(250mm×4.6mm×5μm，Phenomex公司，托伦斯，加利福尼亚，美国)和显差率检测器(Waters，2414)。流动相为正己烷、异丙醇和甲酸(18:1:0.003，v:v:v)的混合物，流速为1ml/min。温度30℃。甘油三酯(triglyceride，TAG)、FFA、1,3-甘油二酯(1,3-diglyceride，DAG)和1,2-甘油二酯(1,2-diglyceride)的保留时间分别为3.66min、4.04min、4.75min和6.05min。应用Waters 2695集成软件计算峰面积百分比；

酸价测定：按GB 5009.229-2016标准进行油脂酸值测定。准确称取3g大豆油(1g米糠油或棕榈油)于100ml清洁圆锥烧瓶中，加入10ml二乙醚-异丙醇混合溶剂和3-4滴酚酞指示剂。样品溶解后，用0.1mol/L KOH(米糠油的碱性蓝6B指示剂)滴定。当碱性6B指示剂溶液呈现红色(蓝色消失)时停止滴定，根据消耗的氢氧化钠溶液计算油的酸值。实验重复三次。

实施例1：CvFAP@E.coli的制备

将质粒pET28a-CvFAP利用热激转化法转入导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃下在含50μg/mL卡那霉素的超级肉汤(Terrific Broth，TB)中培养，当600nm处的菌液光密度达到0.7～0.8时，加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，并将细胞在17℃下孵育20h。将发酵液在4000rpm，4℃下离心30min，弃去培养基，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.0，含100mM NaCl)洗涤菌体2次，离心去除洗涤液后，按照(w/v:1/2)重新加入50mMTris-HCl缓冲液(pH值8.0，含100mM NaCl)，另加1mM PMSF(苯甲基黄酰氟，蛋白酶抑制剂)进行重悬浮得到CvFAP@E.coli细胞，贮存在-80℃，待用。为了验证CvFAP的催化脱酸作用，按照同样的方法制备了含有质粒pET28a的大肠杆菌细胞(记作empty WC)。

实施例2：CvFAP@E.coli催化大豆油中游离脂肪酸的光酶脱羧反应

(1)CvFAP@E.coli催化大豆油中游离脂肪酸的光酶脱羧验证实验：将500μL湿重质量浓度为0.5g/mL的CvFAP@E.coli和500μL大豆油加入到一个5mL透明反应瓶中，总反应体积为1ml；然后将其置于光催化反应装置中，在500rpm，30℃，蓝光(10W，220V)照射下反应；

反应结束后，取反应混合物于2mL EP管中，在10000rpm下离心3min，取上层澄清油样30μL溶于970μL液相色谱流动相(正己烷:异丙醇:甲酸＝18:1:0.003，v:v:v)中，置于2mL色谱瓶利用HPLC分析游离脂肪酸含量；将CvFAP@E.coli换成empty WC，其它条件不变，催化油脂中的FFA脱羧。

图1为empty WC催化油脂脱酸的效果对比图(依步骤1做法反应6h)，可以看到，empty WC在油脂脱酸前后FFA含量基本不变，说明该反应是由CvFAP起到催化作用的。

图1中，Premium Quality，PQ；Superior Quality，SQ；Standard Quality I，STQI；Standard Quality II，STQ II；不同型号油脂主要是游离脂肪酸含量不同。

(2)CvFAP@E.coli催化植物油中游离脂肪酸的光酶脱羧反应条件优化

选用不同油脂底物(大豆油、棕榈油和米糠油)进行光酶催化脱酸，步骤如实施例2步骤(1)所示，结果如图2-4所示(图2-4中，各峰分别为：1.甘油三脂；2.FFA；3.甘油二酯；4.甘油单酯)，经过CvFAP@E.coli光酶催化反应，各类油脂中所含FFA基本去除(脱羧反应后，基本没有相应峰出现，对应于峰2)，而其它成分基本不受影响(油脂的主要成分甘油脂的含量在脱酸前后基本无变化，对应于峰1、3和4)。

对反应细胞浓度做优化：本发明选择5个细胞浓度对CvFAP@E.coli脱酸过程进行优化(0.02、0.04、0.06、0.12和0.20g/mL)，为更直观地观察细胞浓度变化对CvFAP@E.coli催化脱酸过程的影响，反应时间按优化时间进行，反应温度按优化温度进行，步骤如实施例2步骤(1)所示，其他条件和处理方式不变；结果如图5A所示，在细胞浓度为0.06g/mL以上时，反应在4h左右即可达到平衡，且游离脂肪酸含量降至0.01％以下，脱酸效果良好。

对反应温度进行优化：本发明选择3个反应温度(20、30和37℃)对CvFAP@E.coli脱酸过程进行优化，步骤如实施例2步骤(1)所示，其他条件和处理方式不变；结果如图5B所示，反应的最佳温度为30℃。

对反应底物加量进行优化：本发明选择大豆油作为标准底物进行底物加量优化(100、300、500、700、900和1000μL)，反应时间、温度和酶加量均按上述优化步骤中最佳值进行，步骤如实施例2步骤(1)所示，其他条件不变；结果如图6所示，在使用500μL湿重质量浓度为0.5g/mL的CvFAP@E.coli的情况下，对300μL大豆油的脱酸效果最好，以湿重计，CvFAP@E.coli细胞与大豆油的比例为0.25g:300μL。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。