一种爵床挥发油的提取纯化和检测方法及其应用

技术领域

本发明属于医药产品研究开发技术领域，具体涉及一种爵床挥发油的提取纯化、检测方法及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

挥发油(volatile oils)，又称精油(essential oils)，是一类在常温下能挥发的、可随水蒸汽蒸馏的、与水不相混的油状液体的总称。大多数挥发油具有芳香气味。挥发油是一类重要的活性成分，临床上除直接应用主要含挥发油的生药外，还可应用从中精制的挥发油，如桉叶油、薄荷油等。挥发油具有发散解表、芳香开窍、理气止痛、祛风除湿、活血化瘀、祛寒温里、清热解毒、解暑祛秽、杀虫抗菌等作用，如薄荷油用驱风健胃，当归油镇痛，柴胡油退热，土荆芥油驱肠虫等，此外，挥发油还广泛应用于香料、食品与化妆品等的生产。

爵床(Justicia procumbens Linnaeus)，是爵床科枪刀药属植物，潮汕地区别名称为六角婴、狐狸尾、土夏枯草、假夏枯草、麦穗红。外地别名称为孩儿草。味微苦、辛、淡，性凉，无毒。内服解毒、清热、积散结。外用退肿拔毒。入肝经。民间水常用其治疗燥热喉痛、妇女乳痛，胸胁积伤、小儿疳积、肺出血、瘰疬痰结等。

目前，对于爵床的研究较少；还未有关于爵床挥发油提取与使用的报道。因此，随着天然产物精细化应用的逐步实施，以及为进一步的拓展爵床的应用领域，有必要对爵床挥发油的提取与使用开展研究。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种爵床挥发油的分离提取方法及爵床挥发油的应用，所述提取纯化方法工艺简单、成本低，获得的挥发油含水率低，具有良好的抑菌和抗氧化活性。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种爵床挥发油的提取纯化方法，包括：

将爵床粉碎、蒸馏，得到含挥发油水系；

将所述含挥发油水系采用有机溶剂萃取，收集油相，脱水，固液分离，收集有机相，即得爵床挥发油。

针对爵床所含挥发油成分绝大部分在水中溶解度极低的特点，本发明提供一种爵床挥发油的提取纯化方法，为了便于快速有效提取以及防止原料焦化的问题，进一步的，本发明在上述步骤(1)中所述洗净晾干后的爵床与蒸馏水的质量比控制为1：2～6，进一步优选为1:3.5；所述爵床粉粹粒径优选为60目；而且发明人在实验研究中发现，粉粹颗粒较大，会使水蒸汽从原料间隙流出，从而使得提取率降低，且浪费资源；而粉粹粒径过小，则使得水蒸汽无法均匀透过原料，导致蒸汽从冲开的原料中逸出，同样导致提取率不高。

针对爵床所含挥发油的主要成分特征，以及避免加热过程造成挥发油成分中热敏性、易分解、易氧化成分损失，进一步的，本发明所述水蒸汽蒸馏提取时间控制为3-6h；适宜的提取时间能够保证尽可能由爵床中提取出挥发油组分，同时也避免提取时间过长造成的资源浪费，避免造成挥发油活性损失和挥发油品质降低。

进一步的，针对爵床所含挥发油的主要活性成分获取和分离，为了更为有效的从水蒸气蒸馏的油水系中尽可能较全的分离纯化爵床挥发油主活性成分，避免成分损失，提高挥发油成分提取率(包括成分种类和活性成分含量)，本发明所述有机溶剂采用乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、正己烷、乙醚中的一种或几种，更为优选为乙醚；申请人发现，乙醚对爵床挥发油组分萃取效果最佳，相较于其他的有机溶剂具有更好的提取率，能够有效的将其七十多种组分尽皆提取出来。

本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法制备的爵床挥发油。

针对爵床挥发油的主要化学成分的有效提取，也便于更为有效的对爵床挥发油提取工艺进行过程质量控制，本发明的第三个方面，提供了一种爵床挥发油的检测方法，采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测。

本发明的第四个方面，提供了一种爵床的鉴别方法，包括：

提取待测物的挥发油；

采用气相色谱-质谱法(GC-MS)对待测物的挥发油分析检测，

将待测挥发油检测结果与爵床挥发油化学成分比对，判读待测物是否为爵床。

爵床挥发油的主要化学成分分析，其成分仅含量明显有异于其他物种，因此上述检测方法可以用于爵床挥发油的鉴别以及将上述分离方法结合检测方法用于爵床的鉴别。

本发明的第五个方面，提供了上述的爵床挥发油在制备抗菌、抗癌或抗氧化剂的食品、保健品或药物中的应用。

本发明研究了所述爵床挥发油的系列可能功用，公开了上述爵床挥发油的应用。

具体的，本发明公开了所述爵床挥发油作为抑菌剂应用于食品、药品、化妆品或保健品的用途；进一步的，所述爵床挥发油作为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的抑菌剂。

进一步的，本发明公开了上述爵床挥发油的应用，所述爵床挥发油作为抗氧化制剂应用于食品、药品或保健品。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次采用水蒸气蒸馏和有机萃取技术提取纯化得到爵床挥发油，所述提取工艺针对爵床挥发油成分特点，可以有效防止原料焦化、避免加热过程造成挥发油成分中热敏性、易分解、易氧化成分损失、避免造成挥发油活性损失和挥发油品质降低，提高挥发油成分(包括成分种类和活性成分含量)的提取率；并且提取纯化方法工艺简单，成本低，制备工艺中的蒸馏水和有机溶剂能够重复利用，经本发明制备工艺获得的挥发油含水率低，挥发油主活性成分较全面保留。

(2)本发明首次建立了爵床挥发油的组成及量化分析，通过爵床挥发油的特点其他物种挥发油活性成分的不同，分别建立了爵床挥发油提取工艺的质量控制检测方法和爵床挥发油的鉴别以及于爵床的鉴别方法。

(3)本发明得到的爵床挥发油，经试验验证同时具有良好的抑菌和抗氧化活性，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有良好的抑菌作用，并表现出一定抗氧化效果，适合工业化生产应用。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语解释

本发明中，“BHT”是指：2,6-二叔丁基对甲基苯酚。

“ABTS”是指：2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。

“DPPH”是指：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼。

本申请的一种典型的实施方式中，提供一种爵床挥发油的提取纯化方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜爵床洗净晾干后粉粹至粒径为50-100目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂即得到干燥纯净的挥发油。

爵床属的植物现有已发现的化合物结构主要为木脂素类、苯丙素类、黄酮类、香豆精类、有机酸类、醇类、烃类、皂苷类、氨基酸及多糖、挥发油等，而发明人发现：爵床挥发油有自己的特点和化合物种类(如表2所示)，发明人前期研究爵床挥发油的特点，采用多种方式尝试提取爵床挥发油，并通过GC-MS检测，发现爵床所含挥发油成分绝大部分化合物在水中溶解度极低，相对更适宜通过水蒸气蒸馏法进行提取，因此，提出本方案，其相较于其他挥发油提取方式而言，挥发油提取效率以及挥发油种类比例提取更高。

其中，水蒸气蒸馏法提取爵床挥发油过程中，极易产生原料焦化的问题，发明人实验发现，控制爵床干粉的粒径是一个至关重要的因素，将粒径限制在50目以上，焦化现象明显消失，在此基础上，发明人进一步的采用合适的爵床与蒸馏水的比例，减缓原料焦化问题和辅助提取。

具体的实施方案中，本发明所述洗净晾干后的爵床与蒸馏水的质量比为1：2～6，进一步优选为1:3.5；所述爵床粉粹粒径优选为60目；发明人在实验研究中发现，粉粹颗粒较大，会使水蒸汽从原料间隙流出，从而使得提取率降低，且浪费资源；而粉粹粒径过小，则使得水蒸汽无法均匀透过原料，导致蒸汽从冲开的原料中逸出，同样导致提取率不高。

此外，由于爵床的提取工艺是新建立的，在本发明期间，发明人参考了其他植物挥发油的提取工艺，然而与之不同的是，本发明所述挥发油含有较多易氧化成分(以烯类居多)，为避免加热过程造成挥发油成分中热敏性、易分解、易氧化成分损失，本发明所述水蒸汽蒸馏提取时间限制在3-6h；适宜的提取时间能够保证尽可能由爵床中提取出挥发油组分，同时也避免提取时间过长造成的资源浪费。

所述有机溶剂选自乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、正己烷、乙醚中的一种或几种，优选为乙醚；申请人对于水蒸气蒸馏-有机溶剂萃取法进行单因素实验发现，乙醚对爵床挥发油组分萃取效果最佳，相较于其他的有机溶剂具有更好的提取率。

所述脱水干燥剂选自无水硫酸钠或无水硫酸钙，优选为无水硫酸钠。

本发明的优选的一个实施方式中，爵床挥发油的提取纯化方法，包括：

(1)取新鲜爵床洗净晾干后粉粹至粒径为60目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为5h，得含挥发油水系；其中，所述洗净晾干后的爵床与蒸馏水的质量比为1：3.5；

(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。

本发明的一个实施方式中，提供一种由上述提取纯化方法制备得到的爵床挥发油。

所述爵床挥发油的主要化学成分包括香蛇麻烯,六氢法尼基丙酮,1-辛烯-3-醇,1,8-桉树脑,4-乙烯基愈创木酚和里哪醇。

更为全面的，本发明所述爵床挥发油的主要化学成分包括：1-辛烯-3-醇、1,8-桉树脑、里哪醇、顺-3-壬烯-1-醇、4-乙基苯甲醛、藏红花醛、2-甲基-2-烯-4-壬酮、β-环柠檬醛、3-羟基-2-亚甲基丁酸甲酯、4-乙烯基愈创木酚、(E,E)-3-己烯基-2-甲基-2-丁烯酸酯、δ-榄香烯、1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘、1,1,4,5-四甲基茚、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、β-榄香烯、β-石竹烯、香叶基丙酮、α-石竹烯、2,4,6-三甲氧基甲苯、马兜铃烯、大牛儿烯D、β-紫罗兰酮、2-十三烷酮、2-十三烷酮、(+)-喇叭烯、(E)-β-法呢烯、2,6-二叔丁基对甲酚、δ-杜松烯、反-橙花叔醇、环氧石竹烯、环氧化蛇麻烯II、β-桉油醇、2-十四碳烯醛、顺-4-氧代-菖蒲烯、2-十五烷酮、十氢-3a-甲基-7-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-4,8-表硫代薁、新植二烯、六氢法尼基丙酮、顺-1-十六烯、金合欢基丙酮、十六(烷)酸甲酯、异植物醇、异扁枝烯、(E,E)-香叶基芳樟醇、硬脂醇、亚油酸甲酯。

为了便于更为有效的对爵床挥发油提取工艺进行过程质量控制，本发明优选的实施方式为，一种由上述提取纯化方法制备得到的爵床挥发油的检测方法，所述方法包括采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟5min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以8℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；

检测并控制所述爵床挥发油化学成分，六氢法尼基丙酮,1-辛烯-3-醇,1,8-桉树脑,4-乙烯基愈创木酚和里哪醇。

更为全面的，检测所述爵床挥发油的主要化学成分包括：1-辛烯-3-醇、1,8-桉树脑、里哪醇、顺-3-壬烯-1-醇、4-乙基苯甲醛、藏红花醛、2-甲基-2-烯-4-壬酮、β-环柠檬醛、3-羟基-2-亚甲基丁酸甲酯、4-乙烯基愈创木酚、(E,E)-3-己烯基-2-甲基-2-丁烯酸酯、δ-榄香烯、1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘、1,1,4,5-四甲基茚、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、β-榄香烯、β-石竹烯、香叶基丙酮、α-石竹烯、2,4,6-三甲氧基甲苯、马兜铃烯、大牛儿烯D、β-紫罗兰酮、2-十三烷酮、2-十三烷酮、(+)-喇叭烯、(E)-β-法呢烯、2,6-二叔丁基对甲酚、δ-杜松烯、反-橙花叔醇、环氧石竹烯、环氧化蛇麻烯II、β-桉油醇、2-十四碳烯醛、顺-4-氧代-菖蒲烯、2-十五烷酮、十氢-3a-甲基-7-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-4,8-表硫代薁、新植二烯、六氢法尼基丙酮、顺-1-十六烯、金合欢基丙酮、十六(烷)酸甲酯、异植物醇、异扁枝烯、(E,E)-香叶基芳樟醇、硬脂醇、亚油酸甲酯。

本发明的一个实施方案中将上述检测方法用于爵床挥发油的鉴别以及将上述分离方法结合检测方法用于爵床的鉴别。

例如，一种爵床挥发油的鉴别方法，所述方法包括将待测挥发油采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟5min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以8℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；

待测挥发油检测结果与爵床挥发油化学成分(包括香蛇麻烯,六氢法尼基丙酮,1-辛烯-3-醇,1,8-桉树脑,4-乙烯基愈创木酚和里哪醇)比对。

一种爵床的鉴别方法，所述方法包括待测物种挥发油的提取和待测物种挥发油的检测，

所述待测物种挥发油的提取包括：(1)取待测物种洗净晾干后粉粹至粒径为50-100目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂即得到干燥纯净的挥发油；

待测物种挥发油的检测包括：将待测物种挥发油采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟5min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以8℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；

待测挥发油检测结果与爵床挥发油化学成分(包括香蛇麻烯,六氢法尼基丙酮,1-辛烯-3-醇,1,8-桉树脑,4-乙烯基愈创木酚和里哪醇)比对。

此外，本发明研究了所述爵床挥发油的系列可能功用，公开了上述爵床挥发油的应用。

发明人前期也研究过多种植物挥发油的功能，如广西牡荆挥发油等，但不同植物挥发油成分十分复杂，且来源不同，功能也存在较大差异，据发明人了解，同时具有抑菌、抗肿瘤活性多功能用途的挥发油种类仍较少，其功能仍主要跟活性成分及其相关比例有关。而在研究爵床挥发油过过程中，发明人发现该挥发油同时具有良好的抑菌和抗癌活性多种功能，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有良好的抑菌作用。

具体的实施方式中，本发明公开了所述爵床挥发油作为抑菌剂应用于食品、药品、化妆品或保健品的用途；进一步的，所述爵床挥发油作为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的抑菌剂。

进一步的，本发明公开了上述爵床挥发油的应用，所述爵床挥发油作为氧化制剂应用于食品、药品或保健品。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

预实验

水蒸气蒸馏法：

(1)取500g干爵床粉粹磨粉，加入1000g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为5h，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。同时蒸馏萃取法：

称取500g干爵床粉粹磨粉于蒸馏烧瓶巾，加入1000g蒸溜水，同时量取乙醚于蒸馏烧瓶中，连接同时蒸德萃取装置，同时蒸留萃取收集乙醚液，并用无水硫酸钠脱水，乙醚萃取液于旋转蒸发仪真空浓缩，得到挥发油。

乙醚回流萃取法：

称取500g干爵床粉粹磨粉于蒸馏烧瓶巾，加入乙醚进行回流萃取。

表1预实验结果

实施例1爵床挥发油的提取纯化方法

(1)取500g新鲜爵床洗净晾干后粉粹至粒径为60目，加入1000g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为5h，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。

实施例2爵床挥发油的检测方法

采用GC-MS对实施例1得到的爵床挥发油进行检测，具体检测条件如下：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟5min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以8℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min。共检测出爵床挥发油中化学成分47种，具体化学成分及相对含量见表2。

表2爵床挥发油化学成分

实施例3爵床挥发油的抑菌作用

1、试验菌种和培养基

试验菌种：选择四种细菌菌株用于抑菌试验，包括革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)，枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)，幼虫芽孢杆菌(ATCC 9545)和革兰氏阴性菌：大肠杆菌(ATCC 25922)，绿脓杆菌(ATCC 27853)。

试验用培养基：细菌MHB(Mueller Hinton Broth)培养基。

2、试验方法

(1)灭菌：

将实验所需要的培养基、试管、培养皿、滤纸片(6mm)、枪头、蒸馏水等在121℃湿热灭菌20min，灭完菌将其放置超净工作台紫外灭菌30min。

(2)菌悬液的配制：

从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的MHB培养基中，放入恒温摇床中37℃条件下隔夜培养。分别吸取以上培养好的处于对数生长期的供试菌液0.5mL，用MH肉汤稀释成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。再用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后，得到1-2×10

(3)供试药物：

对照药物：氯霉素；样品：实施例1所得爵床挥发油的5mg/mL稀释液。

(4)抑菌活性的测定：

采用滤纸片法测定抑菌活性。无菌条件下，在已灭菌的培养皿中倾入MHA培养基20mL，冷却凝固后制成固体平板。向每个固体平板中加入100μL已稀释好的菌悬液，涂布均匀，放置5min，使培养基充分吸收菌液。用记号笔在有菌琼脂平板上标号。用无菌镊子将灭完菌的干燥的滤纸片夹出，放入写相应对照编号的培养皿中，向灭完菌的干燥的滤纸片滴加配制好的样品溶液或氯霉素溶液10μL，每个样品做三个平行，放入37℃恒温培养箱培养25h。培养时间到后取出培养皿观察透明抑菌圈，采用十字交叉法用测微尺测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径大小，取其平均值(mm)为测定结果，每项抑菌实验均平行重复3次。以抑菌圈直径的大小来进行抑菌活性强弱的判定，抑菌圈表现得越大，则表明其抗菌活性也就越强。

(5)MIC的测定：

吸取稀释好的菌液加于96孔细胞培养板中，每孔100μL，并加入已配置好的不同浓度的药物100μL。倒数第二孔不加药物(仅加培养基和细菌)加入稀释菌液100μL，为细菌生长对照孔。最后一列为阳性对照氯霉素。置于振荡器上振荡1min，使孔内溶液充分混匀后，将96孔板振荡摇匀后置于37℃恒温培养箱中培养16-18小时后，向每孔中加入用无菌水配置的1％TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)溶液20μL，振荡摇匀于37℃恒温培养箱中培养30到60分钟，观察每孔颜色变化。取未呈现颜色变化的最后一孔所含挥发油浓度为其最低抑菌浓度MIC。

重复所有MIC值的测量一式三份。

3、实验结果

抑菌效果用最小抑菌浓度MIC表示，测量结果见表3。

表3爵床挥发油抑菌活性

由表3可以看出，爵床挥发油对5种供试菌都有一定的抑制作用，其对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为1.250mg/mL，对枯草杆菌的最低抑菌浓度为0.625mg/mL，对幼虫芽孢杆菌的最低抑菌浓度为0.625mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为2.500mg/mL，对绿脓杆菌的最低抑菌浓度为1.250mg/mL。

通过具体实施实例说明爵床挥发油可作为天然抗菌剂用于食品、药品保健品或化妆品行业，代替有毒副作用的合成抗菌剂。

实施例4爵床挥发油的抗氧化活性

1、样品的制备

(1)样品的制备

实施例1所得爵床挥发油的5mg/mL稀释液。

(2)试剂的配制

试剂1：BHT溶液的配制：称量250mgBHT，以甲醇为溶剂，用50ml容量瓶定容，摇匀，配制成5.0mg/ml的溶液。

试剂2：DPPH溶液的配制：称量15.8mgDPPH，用甲醇溶解，定容到250ml，摇匀，浓度即为0.16mmol/L，避光保存。

试剂3：ABTS储备液(7.4mmol/L，0.4mL)：取ABTS 3mg，加蒸馏水0.735mL。(MW＝548.7)

试剂4：K

试剂5：Trolox标准液(0.3mmol/L，9.6mL，0.1042mg/mL)：取Trolox 1mg，加蒸馏水9.6mL。(MW＝346.0)

试剂6：FRAP工作液。0.3M pH 3.6醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL，用1M HCl调节pH至3.6；10mmol/L TPTZ溶液25mL：0.078g TPTZ用40mM盐酸溶液定容至25mL；20mmol/L FeCl3溶液50mL：2.78g用RO水定容至50mL；上述溶液以10:1:1的比例混合(现配现用)。

2、DPPH抗氧化活性

分别取不同浓度的各样品溶液(0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml)1.0ml，放入10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(％)＝A0-(As-Ac)/A0×100％公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值，As—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值，Ac—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。用DPPH基础方案确定精油的抗氧化活性。通过分光光度计在517nm测量精油的自由基清除活性。在测定之前立即制备DPPH的甲醇溶液。将各种浓度的各2mL样品(0.100,0.150,0.200,0.250,0.300,0.350,0.400,0.450,0.500mg/mL)加入到2mL DPPH溶液中。将反应混合物振摇，并在阴凉处静置30分钟。通过分光光度计在517nm测量样品的吸光度。在该测定中，丁基化羟基甲苯(BHT)用作标准抗氧化剂以验证测定。实验重复三次，结果见表4所示。

3、ABTS+·自由基清除能力

分别取等体积的试剂3和试剂4混合，避光环境下反应12小时，然后用无水乙醇稀释到40～50倍，调整稀释液在734nm下的吸光度为0.7。分别取不同浓度的各样品溶液(0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml)0.4ml置于10mL离心管中，加入1.6ml的ABTS的稀释液溶液，充分摇匀，在室温避光反应6min，同时以无水乙醇为空白，于734nm波长处测定吸光值。按下列公式计算ABTS自由基清除率。ABTS自由基清除率(％)＝(A0-A)/A0×100％公式中，A0—0.4ml无水乙醇+1.6mlABTS稀释液的吸光度值，A—0.4ml样品溶液+1.6mlABTS稀释液的吸光度值。将实验重复三次，求得清除率的平均值。用ABTS基础方案确定精油的抗氧化活性。通过分光光度计在734nm测量精油的自由基清除活性。将各种浓度的各0.4mL样品(0.100,0.150,0.200,0.250,0.300,0.350,0.400,0.450,0.500mg/mL)加入到1.6mL ABTS稀释液的溶液中。将反应混合物振摇，并在阴凉处静置6分钟。通过分光光度计在734nm测量样品的吸光度。在该测定中，(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸(Trolox)用作标准抗氧化剂以验证测定。实验重复三次，结果见表4所示。

4、总抗氧化活性(FRAP法)

分别取不同浓度的各样品溶液(0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml)0.1ml置于10mL离心管中，加入2.4ml的试剂6(FRAP工作液)溶液，充分摇匀，37℃条件下水浴10min，于593nm处测定吸光度。以0.1-1.6μmol/L的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸(Trolox)的标准液替代样品绘制标准曲线。以1.0μmol/L的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸(Trolox)为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个FRAP值，计算结果。实验重复三次，结果见表4所示。

表4爵床挥发油抗氧化活性

由表4可以看出，爵床挥发油对在不同的模型下，对自由基有良好的清除作用，均有一定的抗氧化活性。

通过具体实施实例说明爵床挥发油可作为天然氧化剂用于食品、药品或保健品行业。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。