一种原代肝癌细胞分离试剂盒

技术领域

本发明涉及生物实验装置技术领域，具体为一种原代肝癌细胞分离试剂盒。

背景技术

肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用。肝脏也制造消化系统中之胆汁。肝脏是尿素合成的主要器官，又是新陈代谢的重要器官。肝脏对来自体内和体外的许多非营养性物质如各种药物、毒物以及体内某些代谢产物，具有生物转化作用。通过新陈代谢将它们彻底分解或以原形排出体外。

肝原代细胞是肝脏行使其功能的主要细胞,执行着许多重要的功能,如毒物的分解、尿素的合成、制造血浆中除几种免疫球蛋白之外的所有血浆蛋白质等；也与肝脏的多种疾病如肝纤维化、肝癌等的发生具有密切关系，因此原代肝癌细胞的研究对于了解肝癌的病理规律具有重要意义。

在对原代肝癌细胞进行研究过程中，首先要对原代肝癌细胞进行分离纯化，以便获得纯净、有活性的原代肝癌细胞。获取原代肝癌细胞的唯一方法就是通过肝癌组织活检标本进行分离培养，然而肝癌组织活检标本中掺杂大量的正常组织、血液。从肝肿瘤组织中纯化出高纯度的原代肝癌细胞，目前主要采用的方法为显微切割术与密度梯度离心法，但上述两种方法都存在，效率较低和纯度不足的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原代肝癌细胞分离试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种原代肝癌细胞分离试剂盒，包括初次细胞分离液、二次细胞分离液、初次细胞培养液、二次细胞培养液，所述初次细胞分离液包含质量分数为8-9％的小牛血清、质量分数为0.015-0.018％的DNA酶Ⅰ和Ⅱ型离解酶及0.6-0.75mmol/L Mg2+，所述二次细胞分离液包含质量分数为10-11％的小牛血清、质量分数为0.02-0.023％的DNA酶Ⅰ和Ⅱ型离解酶及0.8-0.85mmol/LMg2+，所述初次细胞培养液包括质量分数为15％-20％的DMEM/F12培养基、12％-15％肝细胞培养基HepatoZYME-SFM、0.1％-0.2％肝细胞生长因子、1％-1.5％L-抗坏血酸、8％-9％的半固体软琼脂，所述二次细胞培养液包括质量分数为15％-20％的DMEM/F12培养基、12％-15％肝细胞培养基HepatoZYME-SFM、0.1％-0.2％肝细胞生长因子、1％-1.5％L-抗坏血酸。

进一步地，还包括初次细胞过滤器和二次细胞过滤器。

进一步地，所述初次细胞过滤器中的滤网为200-220目。

进一步地，所述二次细胞过滤器的滤网170-185目。

进一步地，所述初次细胞过滤器和二次细胞过滤器包括滤管，所述滤管的底部设置有圆环形的支座，所述滤管的端口上螺纹连接有管盖，所述滤管的端口上卡接有配有下滤盖，所述初次细胞过滤器中下滤盖内的滤网为200-220目，所述二次细胞过滤器中下滤盖内的滤网为170-185目。

进一步地，所述二次细胞过滤器中的下滤盖上方还卡接有上滤盖，所述上滤盖中滤网为135-150目。

进一步地，所述上滤盖和下滤盖包括上环座，所述上环座的底部设置有下环座，所述下环座内径大于上环座外径，所述上环座与下环座卡接配合，所述下环座内径大于滤管端口外径，所述下环座与滤管的端口卡接配合。

进一步地，所述上环座底部设置有锥形面，所述锥形面的底部设置有芯管，所述滤网连接在芯管中，所述芯管的圆周外壁上设置有一组导向筋，所述导向筋条与上环座或滤管端口卡接配合。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明通过在初次细胞培养液中加入适量的软琼脂，诱导肝癌肿瘤细胞附着并克隆，在通过体积差实现肝癌肿瘤细胞与正常肝细胞的分离，分离纯度高，成本低、效率高，本发明针对正常肝细胞和原代肝癌细胞的混合细胞与肝癌细胞克隆集落存在的密度差，设置了初次细胞分离液和二次细胞分离液，后者的密度更高以便配合肝癌细胞克隆集落的高密度特性；

2、本发明中细胞过滤器的滤盖可叠放，可实现多层滤网同时进行过滤，有效提升了过滤效率和效果，在进行单向过滤时可叠放相同目数的滤网用以提升过滤质量，在进行双向过滤时可叠放不同目数的滤网以便提升过滤效率，环座之间的卡接设置，稳定性高，且不会产生边缘溢流。

综上所述，本发明，有效解决了原代肝癌细胞分离纯度底，成本高、效率底的问题，同时配备了便捷的过滤器，进一步提升原代肝癌细胞分离的效率和质量，结构简洁，使用方便，值得推广。

附图说明

图1为一种原代肝癌细胞分离试剂盒中初次细胞过滤器和二次细胞过滤器的结构示意图；

图2为初次细胞过滤器和二次细胞过滤器中上滤盖和下滤盖上部的结构示意图；

图3为初次细胞过滤器和二次细胞过滤器中上滤盖和下滤盖底部的结构示意图。

图中：1-滤管，2-支座，3-管盖，4-下滤盖，5-上滤盖，6-下环座，7-上环座，8-锥形面，9-芯管，10-滤网，11-导向筋条。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：一种原代肝癌细胞分离试剂盒，包括初次细胞分离液、二次细胞分离液、初次细胞培养液、二次细胞培养液，所述初次细胞分离液包含质量分数为8-9％的小牛血清、质量分数为0.015-0.018％的DNA酶Ⅰ和Ⅱ型离解酶及0.6-0.75mmol/L Mg2+，所述二次细胞分离液包含质量分数为10-11％的小牛血清、质量分数为0.02-0.023％的DNA酶Ⅰ和Ⅱ型离解酶及0.8-0.85mmol/L Mg2+，所述初次细胞培养液包括质量分数为15％-20％的DMEM/F12培养基、12％-15％肝细胞培养基HepatoZYME-SFM、0.1％-0.2％肝细胞生长因子、1％-1.5％L-抗坏血酸、8％-9％的半固体软琼脂，所述二次细胞培养液包括质量分数为15％-20％的DMEM/F12培养基、12％-15％肝细胞培养基HepatoZYME-SFM、0.1％-0.2％肝细胞生长因子、1％-1.5％L-抗坏血酸。

本发明使用时，首先将肝肿瘤组织通过胰酶、胶原酶消化法，获得细胞悬液，将上述细胞悬经过过滤后获得滤清液，而后将滤清液加入初次细胞分离液中经过离心、震荡分离后获得上清液中的混合有正常肝细胞和原代肝癌细胞的混合细胞溶液，再将上述混合细胞溶液加入初次细胞培养液中进行培养，培养后肝癌肿瘤细胞均在细胞培养液中的软琼脂上生长并形成克隆集落，形成克隆集落的肝癌肿瘤细胞与正常肝细胞之间存在较大体积差，通过过滤后即可获得纯净的肝癌肿瘤细胞克隆集落，再将肝癌肿瘤细胞克隆集落加入到二次细胞培养液中进行培养进行扩繁，扩繁后的细胞培养液加入到二次细胞分离液中经过离心、震荡分离后的上清液中获得纯净的肝癌细胞克隆集落，最后通过对上述菌落进行胰蛋白酶消化获得纯净的肝癌单细胞悬浮液。本发明通过在初次细胞培养液中加入适量的软琼脂，诱导肝癌肿瘤细胞附着并克隆，在通过体积差实现肝癌肿瘤细胞与正常肝细胞的分离，分离纯度高，成本低、效率高。本发明针对正常肝细胞和原代肝癌细胞的混合细胞与肝癌细胞克隆集落存在的密度差，设置了初次细胞分离液和二次细胞分离液，后者的密度更高以便配合肝癌细胞克隆集落的高密度特性。

实施例2：一种原代肝癌细胞分离试剂盒，与实施例1的区别在于，还包括初次细胞过滤器和二次细胞过滤器。

所述初次细胞过滤器中的滤网为200-220目。

所述二次细胞过滤器的滤网170-185目。

本实施例中，200-220目的滤网用于过滤出正常肝细胞和原代肝癌细胞的混合细胞，170-185目的滤网用于在初次混合细胞培养后将肝癌细胞克隆集落与正常肝细胞分离。

实施例3：请参阅图1～3，一种原代肝癌细胞分离试剂盒，与实施例1和2的区别在于，所述初次细胞过滤器和二次细胞过滤器包括滤管1，所述滤管1的底部设置有圆环形的支座2，所述滤管1的端口上螺纹连接有管盖3，所述滤管1的端口上卡接有配有下滤盖4，所述初次细胞过滤器中下滤盖4内的滤网10为200-220目，所述二次细胞过滤器中下滤盖4内的滤网10为170-185目。

所述二次细胞过滤器中的下滤盖4上方还卡接有上滤盖5，所述上滤盖5中滤网10为135-150目。

所述上滤盖3和下滤盖4包括上环座7，所述上环座7的底部设置有下环座6，所述下环座6内径大于上环座7外径，所述上环座7与下环座6卡接配合，所述下环座6内径大于滤管1端口外径，所述下环座6与滤管1的端口卡接配合。

所述上环座7底部设置有锥形面8，所述锥形面8的底部设置有芯管9，所述滤网10连接在芯管9中，所述芯管9的圆周外壁上设置有一组导向筋11，所述导向筋条11与上环座7或滤管1端口卡接配合。

本实施例通过对细胞过滤器的结构设计，使得滤盖可叠放，即多层滤网10同时进行过滤，有效提升了过滤效率和效果，在进行单向过滤(即只需进行一次筛选)时可叠放相同目数的滤网10用以提升过滤质量，在进行双向过滤(需要进行两次不同目数筛选)时可叠放不同目数的滤网10以便提升过滤效率。环座之间的卡接设置，稳定性高，且不会产生边缘溢流，导向筋条11可进一步提升卡接稳定性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。