一种抗冠状病毒N蛋白的抗体及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物技术、免疫学领域，涉及一种抗冠状病毒N蛋白的抗体及其应用。

背景技术

病原体实验室检测包括实时荧光RT-PCR、病毒基因测序和血清免疫学检测，虽然RT-PCR和病毒基因测序是诊断的金标准，但检测时间长，实验室生物安全要求标准高等原因，而血清免疫学检测因检测时间短、操作简单，作为疾病早期筛查的指标具有一定的临床意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗冠状病毒N蛋白的抗体，所述抗体具有较高的结合N蛋白的活性。

本发明的第一方面提供了一种抗N蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：

SEQ IDNO：2的HCDR1、SEQ IDNO：3的HCDR2和SEQ IDNO：4的 HCDR3，与SEQ IDNO：10的LCDR1、SEQ IDNO：11的LCDR2和SEQ IDNO： 12的LCDR3。

进一步，所述单克隆抗体还包含具有与SEQ IDNO：5、6、7、8所示氨基酸序列至少90％序列一致性的重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4；以及具有与SEQ IDNO：13、14、15、16所示氨基酸序列至少90％序列一致性的轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。

进一步，所述单克隆抗体重链可变区具有与SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的VH，所述轻链可变区具有与 SEQ IDNO：17所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的 VL。

进一步，所述单克隆抗体的VH具有SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的VL具有SEQ IDNO：17所示的氨基酸序列。

进一步，所述单克隆抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。

本发明的第二方面提供了如下任一项所述的物质：

1)核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段；

2)重组表达载体，所述重组表达载体包含1)中所述的核酸分子；

3)宿主细胞，所述宿主细胞包含2)中所述的重组表达载体；

4)药物偶联物，所述药物偶联物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段；

5)一种检测冠状病毒N蛋白的产品，所述产品包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段；或编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段的核酸分子、重组表达载体、宿主细胞、药物偶联物；

6)一种组合物，所述组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段，或编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段的核酸分子、重组表达载体、宿主细胞、药物偶联物。

进一步，所述重组表达载体具有与抗体可操作地连接的信号肽。

进一步，所述重组表达载体进一步包含转录调控元件。

进一步，所述的产品还包含用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。

进一步，用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。

进一步，所述药物偶联物还包含选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子或酶。

本发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的物质；和/或药学上可接受的载体。

本发明第四方面提供了如下任一项所述的方法：

1)一种制备本发明第一方面所述单克隆抗体的方法，所述方法包括：培养本发明第二方面所述的宿主细胞，任选地从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长于的培养基中分离所述抗体；

2)一种检测样品中N蛋白的方法，所述方法包括：使本发明第一方面所述的单克隆抗体接触待测样本，确定所述待测样本中N蛋白的存在或水平。

进一步，1)中所述方法还包括对所述单克隆抗体进行纯化。

进一步，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞。

进一步，所述细胞选自HEK293细胞。

本发明的第四方面提供了如下任一项所述的应用：

1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质在检测 N蛋白中的应用；

2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质在制备检测冠状病毒感染的产品中的应用；

3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质在制备检测冠状病毒感染相关疾病的产品中的应用；

4)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质或本发明第三方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病的药物中的应用。

进一步，所述产品包括试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括：胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒(ELISA)、荧光免疫试剂盒和微流体芯片。

进一步，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV。

进一步，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

进一步，所述冠状病毒感染相关疾病为COVID。

进一步，所述冠状病毒感染相关疾病为COVID-19。

附图说明

图1是检测单克隆抗体8D7的电泳图；

图2是检测单克隆抗体8D7的HPLC图；

图3是ELISA检测单克隆抗体8D7的结合活性图。

具体实施方式

在描述本发明方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本发明所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。

除非另外定义，否则本发明所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本发明所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本发明所提到的所有出版物均通过全文引用的方式并入本发明中。

术语“冠状病毒”或“CoV”是指冠状病毒家族的任何病毒，包含但不限于SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV。SARS-CoV-2是指被鉴定为新出现的冠状病毒。SARS-CoV-2也被称为2019-nCoV。其通过病毒纤突蛋白与人宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合。

如本发明所使用的，术语“冠状病毒感染”或“CoV感染”是指感染冠状病毒，如SARS-CoV-2、MERS-CoV或SARS-CoV。所述术语包含通常在下呼吸道中的冠状病毒呼吸道感染。症状可以包含高烧、干咳、呼吸短促、肺炎、胃肠道症状(如腹泻)、器官衰竭(肾衰竭和肾功能障碍)、脓毒性休克和严重病例的死亡。

如本发明所用，术语“抗体”包括与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、一价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区(VH)以及第一、第二、第三和任选存在的第四恒定区(分别为CH1、CH2、CH3、CH4)组成；哺乳动物轻链分类为λ或κ，而每条轻链由可变区(VL)和恒定区组成。抗体呈“Y”形，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。 Y的每个臂包括与单一轻链的可变区和恒定区结合的单一重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区(complementaritydetermining region；CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、 HCDR3)。本发明中所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、 IMGT、Chothia或Al-Lazikani的约定来限定或鉴定三个CDR插在被称为构架区(framework region；FR)(轻链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重链FR包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4)的侧翼链段(stretch)之间，所述侧翼链段比CDR更高度保守且形成支撑高度可变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但呈现出各种效应功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体分类。抗体的五种主要类别或同型为大免疫球蛋白A(IgA)、IgD、 IgE、IgG和IgM，其特征分别在于α、δ、ε、γ和μ重链的存在。若干主要抗体类别分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4 (γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。

在某些实施例中，本发明提供的抗体涵盖其任何抗原结合片段。如本发明所用，术语“抗原结合片段”是指由抗体的一部分形成的抗体片段，其包含一或多个CDR或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体 (二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体所结合相同的抗原。

术语“可操作地连接”是指两个或更多个所关注的生物序列在存在或不存在间隔子或连接子的情况下的并接，使得它们处于允许它们以预期方式起作用的关系中。当关于多肽使用时，其意指多肽序列以允许连接的产物具有预期的生物学功能的方式连接。关于多核苷酸也可以使用所述术语。举例来说，当编码多肽的多核苷酸与调控序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)可操作地连接时，其意指所述多核苷酸序列以允许调控由多核苷酸表达多肽的方式连接。在一个实施例中，可操作地连接的核苷酸序列是相邻的(例如在信号序列的情况下)。替代地，可操作地连接的核苷酸序列可以不相邻(例如在增强子的情况下)。

针对抗冠状病毒N蛋白的抗体

本发明提供了针对N蛋白的单克隆抗体，所述抗体包含SEQ IDNO：2的 HCDR1、SEQIDNO：3的HCDR2和SEQ IDNO：4的HCDR3，与SEQ IDNO： 10的LCDR1、SEQ IDNO：11的LCDR2和SEQ IDNO：12的LCDR3。

在一实施方式中，所述单克隆抗体还包含具有与SEQ IDNO：5、6、7、8 所示氨基酸序列至少90％序列一致性的重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3 和HFR4；以及具有与SEQIDNO：13、14、15、16所示氨基酸序列至少90％序列一致性的轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。

在又一实施方式中，所述单克隆抗体重链可变区具有与SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的VH，所述轻链可变区具有与SEQ IDNO：17所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的VL。

作为优选地实施方式，所述单克隆抗体的VH具有SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的VL具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，本发明提供的抗体和其抗原结合片段包含重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施例中，本发明提供的抗体和其抗原结合片段是由本发明提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单结构域抗体。

在某些实施例中，本发明提供的抗体和其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白(Ig)恒定区，其任选地进一步包含重链和/或轻链恒定区。在某些实施例中，重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区(或任选地CH2-CH3-CH4区)。在某些实施例中，本发明提供的抗体和其抗原结合片段包含人IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA1、IgA2或IgM的重链恒定区。在某些实施例中，本发明提供的抗体和其抗原结合片段包含人IgG1的重链恒定区。在某些实施例中，本发明提供的抗体和其抗原结合片段包含人IgG4的重链恒定区。在某些实施例中，轻链恒定区包含Ckappa(Cκ)或Clambda(Cλ)。本发明提供的抗体和其抗原结合片段的恒定区可与野生型恒定区序列一致或相差一或多个突变。

本发明提供的抗体和其抗原结合片段也涵盖本发明提供的抗体序列的各种变体。

在某些实施例中，本发明提供的抗体和其抗原结合片段在CDR序列中的一或多个和/或FR序列中的一或多个中包含一或多个氨基酸残基取代。在某些实施例中，亲和力变体在CDR序列和/或FR序列中包含总共不超过20、15、10、 9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。

在某些实施例中，本发明提供的抗体和其抗原结合片段包含与本发明列出的那种(或那些)CDR序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性但仍保持以类似于或甚至高于其亲本抗体的水平与冠状病毒N蛋白特异性结合的1、2或3 个CDR序列。

在某些实施例中，本发明提供的抗体和其抗原结合片段包含与本发明中列出的那种(或那些)可变区序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性但仍保持在类似于或甚至高于其亲本抗体对于冠状病毒N蛋白的特异性结合亲和力的水平的一或多个可变区序列。在一些实施例中，突变发生在CDR外的区域(例如在 FR中)。

重组表达载体

如本发明所用，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒；噬菌粒；粘粒和人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或 P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和乳多空病毒(例如SV40)。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。术语“复制起点”是指当在载体中存在时其起始复制的序列。复制起点可被复制起始因子或替代地被DNA解螺旋酶识别。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。

载体可以是重组表达载体或克隆载体。本发明提供了载体(例如表达载体)，其含有编码抗N蛋白抗体的本发明提供的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作地连接的启动子和/或至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13 噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、 pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、 pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、 pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、 pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、 pEF-Bos等。

“重组表达载体”是编码基因的核酸分子，其在宿主细胞中表达且此外含有控制所述基因的表达的必需元件。通常，表达载体包含转录启动子、所关注基因和转录终止子。

在某些实施例中，重组表达载体是基于病毒的载体。在某些实施例中，重组表达载体是慢病毒载体。在某些实施例中，重组表达载体是腺相关病毒(AAV) 载体。

在某些实施例中，编码本发明提供的抗N蛋白抗体或其抗原结合片段的核酸序列进行了密码子优化。如本发明所用，术语“密码子优化”是指通过，用在所关注的脊椎动物(例如人)的基因中较频繁或最频繁使用的密码子置换至少一个、超过一个或大量天然序列的密码子，来改变核酸序列以增强在所述脊椎动物细胞中的表达，但核酸序列的改变不改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。各种物种对特定氨基酸的某些密码子呈现出特定的偏好。

在某些实施例中，编码抗N蛋白抗体的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗N蛋白抗体的重链可变区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗N蛋白抗体的轻链可变区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗N蛋白抗体的重链恒定区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗N蛋白抗体的轻链恒定区的核酸序列进行了密码子优化。

宿主细胞

可将包含编码抗体的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中进行克隆或基因表达。适用于克隆或表达本发明载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。用于此目的的适合原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属 (Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如绿脓杆菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。

除原核生物外，真核微生物，如丝状真菌或酵母，是适用于表达抗冠状病毒N蛋白的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的烘焙酵母是低级真核宿主微生物中最常用的。然而，多种其它属、种和菌株通常可用且适用于本发明中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus) (ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、克鲁维雄酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum) (ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.the rmotole ra ns)和马克斯克鲁维酵母 (K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢菌属 (Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

适合表达本发明提供的抗体或抗原片段的宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出多种杆状病毒株和变体以及来自如下宿主的对应容许的昆虫宿主细胞：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus) (蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒株公开可用，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica) NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5病毒株，并且所述病毒可以根据本发明用作本发明中的病毒，特定来说用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。

然而，脊椎动物细胞也已引起极大关注，且在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已变成常规方法。适用的哺乳动物宿主细胞系的实例是经SV40 转化的猴肾CV1株系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(经亚克隆以便在悬浮培养物中生长的293或293细胞；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR；小鼠支持细胞(TM4)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA， ATCC CCL 2)；犬科动物肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)； TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝肿瘤系(Hep G2)。

用上文所描述的表达或克隆载体转化宿主细胞以制造抗N蛋白抗体，且在适当时在改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。在另一实施例中，抗体可通过所属领域中已知的同源重组来制造。

药物组合物和给药方法

本发明进一步提供药物组合物，其包含表达本发明提供的针对冠状病毒N 蛋白抗体或其抗原结合片段的重组表达载体和一或多种药学上可接受的载体。

术语“药学上可接受的”指示，指定载体一般在化学上和/或物理上与构成调配物的其它成分相容，且在生理上与其接受者相容。

用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体可包括但不限于例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水性媒剂(例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液或林格氏葡萄糖和乳酸盐注射液)、非水性媒剂(例如植物来源的非挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油)、抗微生物剂、等渗剂(如氯化钠或右旋糖)、缓冲液(如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、抗氧化剂(如硫酸氢钠)、麻醉剂(如盐酸普鲁卡因)、悬浮/分散剂(如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸))、乳化剂(如聚山梨醇酯80(Tween-80))、稀释剂、佐剂、赋形剂、或无毒辅助物质、所属领域中已知的其它组分，或其各种组合。适合的组分可包括例如填充剂、结合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。

本发明提供用于治疗或预防与目标抗原(例如N蛋白)阳性细胞相关疾病的药剂，所述药剂包含本发明的抗N蛋白抗体或其抗原结合片段作为活性成分，可以对有需要的对象给予治疗有效量或预防有效量的该药剂，以治疗或预防冠状病毒阳性疾病。抗N蛋白抗体或其抗原结合片段可抑制冠状病毒诱导的与疾病相关的活性或消除或降低冠状病毒的数目。

另外，本发明涉及用于免疫检测或测定目标抗原(例如N蛋白)的方法、用于免疫检测或测定目标抗原(例如N蛋白)的试剂、用于免疫检测或测定表达目标抗原(例如N蛋白)的冠状病毒的方法和用于诊断与目标抗原(例如N 蛋白)冠状病毒感染相关疾病的诊断剂，其包含本发明的特异性识别目标抗原 (例如人N蛋白)结合的抗体或抗体片段作为活性成分。

在本发明中，用于检测或测定目标抗原(例如N蛋白)的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。

免疫检测或测定方法是使标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。

上述冠状病毒感染相关疾病可以通过用本发明的抗体或抗体片段检测或测定表达N蛋白来诊断。

为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用 FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。

在本发明中，对用于检测或测定目标抗原(例如N蛋白)的样品没有特别限制，只要它具有包含表达目标抗原(例如N蛋白)可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。

根据所需的诊断方法，含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原- 抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1单克隆抗体的筛选

1、重组新冠N蛋白的合成

合成SARS-CoV-2病毒的N蛋白序列，构建至pEM5.1载体；抽提转染用质粒；转染至HEK293细胞，培养细胞7天；收获上清，Ni柱纯化，经过浓缩置换缓冲液，得到重组新冠N蛋白，重组新冠N蛋白序列来源Uniprot P0DTC9。序列如SEQ IDNO：1所示。

2、免疫

第一次用福氏完全佐剂，每只100μg，腹腔注射，总剂量0.5ml/只，间隔3 周进行第二次免疫；第二次起用福氏不完全佐剂，剂量为50μg/0.5ml/只，间隔2 周进行第三次免疫；第三次注射后10天准备细胞融合；

取饲养细胞，可按10

3、杂交瘤细胞的筛选和克隆

通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选，铺重组表达N蛋白过夜；洗板，加脱脂奶粉封闭，37℃，1h；洗板，加入100μl 96孔培养液上清，37℃，孵育1h；洗板，加入HRP标记羊抗鼠二抗，37℃，孵育30min；洗板，加入显色液，显色10min，加入终止液，读取OD450的数值；筛选高表达量细胞株进行亚克隆培养。

4、测序

收集细胞，采用Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)20为引物，逆转录生成 cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入载体，进行转化，挑选阳性克隆送测序。

5、结果

筛选出抗SARS-CoV-2的单克隆抗体8D7，序列如表1所示。

表1单克隆抗体8D7的序列

实施例2单克隆抗体8D7的功能性研究

1、单克隆抗体的表达和纯化

1)对筛选出的序列进行化学合成，并克隆至真核表达载体中。

2)对质粒扩增提取。

3)将编码抗体的质粒瞬时转染入哺乳动物细胞HEK293。

4)收集上清，利用亲和层析方法，纯化获得单克隆抗体。

5)结果，纯化后的抗体表达量是225mg/L。

2、单克隆抗体的理化性质检测

2.1凝胶电泳检测单克隆抗体的纯度

1)仪器设备

2)主要试剂

3)样品制备

取20μl的样品与5μl的5×还原buffer混合均匀，在95℃中加热5min，冷却；

取20μl的样品与5μl的5×非还原buffer混合均匀。

4)电泳

配置胶，加适量的电泳缓冲液，加样，进行电泳。

5)染色与脱色

电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，室温染色1h或更长时间；倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，室温脱色4-24h。完成脱色后，用ddH

6)结果

结果如图1所示，从左至右条带分别是marker、还原条带、非还原条带；单克隆抗体的检测纯度均大于95％。

2.2HPLC检测单克隆抗体的纯度

1)仪器设备

2)主要试剂

3)流动相配制

将磷酸氢二钾三水、磷酸二氢钾和氯化钾加入到约900ml纯化水中，搅拌溶解，定容至1L，用pH计测量，确定其pH在6.2±0.1之间。0.22μm滤膜过滤，室温保存。

4)样品制备

系统适用性样品：MIL62标准品用流动相稀释至2mg/ml

供试品：待测样品用流动相稀释至2mg/ml。

5)色谱条件

6)结果

结果如图2所示，单克隆抗体的检测纯度均大于95％。

3、单克隆抗体的结合活性检测

1)包被：用包被液将抗原N蛋白稀释成2μg/ml，混匀，加入96孔包被板， 100μl/孔，封膜封闭，4℃过夜。

2)洗板机洗涤3次，最后一次不能有液体残留在板子上，用吸水纸拍干板子表面的液体。

3)封闭：加入5％奶粉(0.5g奶粉溶于10mlDPBS)，300μl/孔，37℃孵育 1h，按照步骤2)洗板3次。

4)将抗体进行梯度稀释，100μl/孔，37℃反应1h，按照步骤2)洗板3次。

5)加二抗：用DPBS按照1:2000稀释，加入96孔板，100μl/孔，37℃反应1h，按照步骤2)洗板3次。

6)显色：加入TMB，100μl/孔，室温避光显色10min。

7)终止：加入2N H

8)酶标仪测OD450，10min内检测

9)结果

结果如图3所示，单克隆抗体8D7可以与抗原N蛋白特异性结合，并且呈现浓度依赖性，EC50为0.01505μg/ml。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 苏州东抗生物科技有限公司

<120> 一种抗冠状病毒N蛋白的抗体及其应用

<141> 2022-03-29

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala His His His His His His

420 425

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Tyr Ser Phe Ile Asn Tyr Gly

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asp Pro

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Arg Ser Pro Gly Ser Gly Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Asn Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met Gly

1 5 10 15

Trp

<210> 7

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr

1 5 10 15

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Thr Asn Leu Lys Asn Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

35

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Asn Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Gly Ser Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Ser Ile Ser Glu Tyr

1 5

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Tyr Ala Ser

1

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Gln Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Lys

<210> 15

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Ile Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Glu Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105