基于血液的络合物组对照物

相关专利申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本专利申请案主张于2020年5月13日提交的编号为63/024,065的美国临时专利申请案的优先权，该专利申请案中的全部内容以引用方式全文并入本文。

背景技术

识别特定细胞群对于研究和诊断应用至关重要。检测细胞子群的唯一细胞标志物(例如表达在细胞表面或细胞质中的蛋白质)是辨别非均质细胞群中的细胞类型的一种常用方法。传统细胞识别化验包括对生物样本中的细胞染色，以及检测由细胞群表达的标志物或标志物组合，以将细胞分类为特定细胞类型。

免疫表型是检测标志物存在与否的一种实验室方法，以识别生物样本中各种目标细胞群的存在性和比例。免疫表型使用针对特定细胞标志物的荧光团共轭抗体来标记细胞，然后通过流式细胞术分析单个细胞的标志物表达特征，以识别和量化给定细胞群。经过分析的细胞群可基于它们独特的标志物表达特征而分为不同的组。免疫表型的应用包括检测肿瘤标志物以区分正常细胞群和癌细胞群。免疫表型可辅助用于数种血癌的诊断、分类、治疗和预后，例如白血病和淋巴瘤。

加州圣荷塞BD Biosciences公司的BD OneFlow

发明内容

目前，没有一种过程对照物对所有OneFlow

提供了对照组合物及其制备方法。对照组合物的方面包括第一白细胞组分，其包括白细胞的一种或多种阳性对照标志物；第二细胞组分，其包括造血干/祖细胞的一种或多种阳性对照标志物；和第三细胞组分，其包含赘生性细胞的一种或多种阳性对照标志物，其中第一白细胞组分、第二细胞组分和第三细胞组分被固定。还提供了使用对照组合物作为阳性对照的方法，例如在流式细胞分析中，以及用于实施本发明方法的试剂盒。

附图说明

通过下文具体实施方式结合附图可最佳理解本发明。附图包括：

图1示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

图2示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

图3示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

图4示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

图5示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

图6示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

图7示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

图8示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

图9示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

图10示出了流式细胞分析结果，显示了对对照组合物中由BD OneFlow

实施方式

提供了对照组合物及其制备方法。对照组合物的方面包括第一白细胞组分，其包括白细胞的一种或多种阳性对照标志物；第二细胞组分，其包括造血干/祖细胞的一种或多种阳性对照标志物；和第三细胞组分，其包含赘生性细胞的一种或多种阳性对照标志物，其中第一白细胞组分、第二细胞组分和第三细胞组分被固定。还提供了使用对照组合物作为阳性对照的方法，例如在流式细胞分析中，以及用于实施本发明方法的试剂盒。

在详细描述本发明之前，应明白，本发明并不限于描述的特定实施例，当然可以有不同的实施例。还应明白，本文件中使用的术语仅用于描述特定实施例，而不是限定范围，因为本发明的范围将仅由随附的权利要求来限制。

对于值范围，应明白，除非上下文另有明确指明，否则介于该范围的上限和下限之间的截至下限单位的十分之一的每个居间值以及处于该范围的任何其他声明值或居间值均包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限值可单独包括于该等较小范围中，也包含在本发明中，但在声明范围中特定排除的限值除外。如果声明的范围包括上下限值中的一者或两者，则排除此类被包括限值的一者或两者的范围也包括在本发明中。

本文件中的某些范围使用前面带“大约”字样的数值表示。本文件中使用的术语“大约”旨在为其后面的准确数字以及接近或约等于该准确数字的数字提供字面表述。在确定一个数字是否接近或约等于一个特定引述数字时，该非引述的接近或约等于数字可以是就其上下文而言基本等效于该特定引述数字的一个数字。

除非另有定义，否则本文件中使用的任何技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。虽然可以使用类似或等效于本文件中描述的方法和材料的任何方法和材料，但本发明中描述的是代表性的例证方法和材料。

本说明书中引述的所有出版文献和专利通过引用并入本文件，如同每份出版文献或专利具体注明应通过引用并入，并由此通过引用并入本文件，以披露和描述引述该等出版文献所关联的方法和/或材料。对任何出版文献的引述是因为该出版文献在申请日期之前披露，不应解释为承认本发明不可因为本发明在先而先于该出版文献。此外，提供的公布日期可能不同于实际公布日期，这可能需要另行确认。

需要说明，在本文件中以及在随附的权利要求中，除非上下文明确指明，否则单数形式的不定冠词和定冠词所指的内容包括复数。还需要说明的是，权利要求草案可能排除了任何可选要素。因此，本声明旨在作为在陈述权利要求要素时使用诸如“仅仅”、“只是”等类似排他性术语或使用“否定”限制时的先行依据。

如同所属领域技术人员在阅读本发明文件后会理解的，本文件中描述和说明的每个实施例具有各自的要素和特征，此类要素和特征可直接与任何其他实施例的特征分离或组合，而并未脱离本发明的范围或精神。陈述的任何方法可以陈述的顺序执行或以逻辑上可能的任何其他顺序执行。

对于出于语法流畅性而使用功能说明来描述的装置和方法，应明确说明，除非是明确根据35U.S.C.§112撰写，否则权利要求不应被解释为因“方法”或“步骤”等解释限制而受到任何限制，而应被赋予等效文件的司法原则下的权利要求规定的定义的完整范围的含义和等效内容；如果权利要求是明确根据35U.S.C.§112撰写，则应被赋予35U.S.C.§112下的完整法定等效含义。

在进一步描述本发明的各个方面时，首先详细描述对照组合物，然后描述在各种应用中使用该等对照组合物的方法的实施例，以及可能包括对照组合物的试剂盒实施例。

如上文概述，提供了对照组合物，如流式细胞术对照组合物。该等对照组合物可用于验证流式细胞分析仪系统、方法和试剂的功能或性能，以用于流式细胞分析。本发明的对照组合物可为阳性对照组合物。一种阳性对照组合物可对一种或多种目标标志物(例如细胞表面标志物或细胞内标志物)显示阳性(例如已知表达)。本发明的对照组合物可对在流式细胞分析(例如流式细胞术诊断化验)中可检测到的所有目标标志物显示阳性，可作为在一个特定流式细胞分析或多个不同流式细胞分析中的阳性对照物的唯一对照组合物。在某些实施例中，对照组合物作为流式细胞术免疫表型化验中的阳性对照物，对个体生物样本(例如血液样本)进行流式细胞术分析，以诊断、分类、治疗和/或预后血细胞癌。在某些实施例中，对照组合物可包括在流式细胞术免疫表型化验中使用的所有标志物，以鉴别正常和赘生性细胞细胞(例如正常细胞和血癌细胞)，以及对各种细胞子群进行分类。在某些实施例中，对照组合物可包括多于给定化验(例如免疫表型化验)中所需的所有标志物的更多标志物，以识别和鉴定一个特定细胞群或多个细胞群。在某些实施例中，对照组合物可包括在多个不同化验中所需的所有标志物，其中每个化验旨在分析不同于其他化验所分析的细胞群的一个或多个细胞群。在某些实施例中，对照组合物可包括多于给定化验(例如免疫表型化验)中所需的所有标志物的更多标志物，例如2个或多个，3个或多个，4个或多个，5个或多个，10个或多个，等等，以识别和签定一个特定细胞群或多个细胞群，以辅助对一种血癌或血癌组的诊断。在某些实施例中，对照组合物可包括在多个不同化验中所需的所有标志物，其中每个化验旨在分析不同于其他化验所分析的细胞群的一种特定血癌或血癌组的一个或多个细胞群的特性。在某些情况下，对照组合物包括一种或多种细胞类型以及由每种细胞类型唯一表达的所有标志物。在某些实施例中，对照组合物可包括多于给定化验(例如免疫表型化验)中所需的所有标志物的更多标志物，以识别和鉴定疾病或失调，例如一种血癌或血癌组。在某些实施例中，对照组合物可包括在多个不同化验中所需的所有标志物，其中每个化验旨在识别和鉴定不同于其他化验所分析的疾病或失调(例如血癌或血癌组)的一种特定疾病或失调(例如血癌或血癌组)。

在某些实施例中，对照组合物包括一个或多个阳性对照标志物。在本文件中，“阳性对照标志物”是已知存在于对照组合物中的一种标志物，例如由细胞在对照组合物中表达的蛋白质。目标阳性对照标志物可包括例如属于试剂盒的结合物的靶标的标志物，以用于特定化验例如诊断化验。在一些情况下，阳性对照标志物包括用于识别细胞谱系中显著细胞群的标志物，以区分细胞谱系中的不同细胞类型，或对样本中的细胞群分类，例如赘生性细胞群。在一些情况下，一个或多个阳性对照标志物包括细胞表面标志物。细胞表面标志物指的是表达在细胞表面上的标志物，例如蛋白质。细胞表面标志物可结合到细胞膜或存在于细胞膜内。在一些实施例中，细胞表面标志物包括细胞表面配体、细胞表面受体、信号传递分子或其组分。在一些情况下，一个或多个阳性对照标志物包括细胞内标志物。细胞内标志物是存在于细胞内(例如存在于细胞质内)的标志物，例如蛋白质。细胞内标志物可包括例如转录因子、酶、细胞支架蛋白质、细胞器官蛋白质等。

对照组合物可包括例如显示阳性的任何适当数量的阳性对照标志物。在一些情况下，对照组合物可包括选自由以下成分组成的成分组的一个或多个标志物：MPO(髓过氧化物酶)、CD79a(免疫球蛋白相关α；IGA；B淋巴细胞特定MB1蛋白质；MB1；膜结合免疫球蛋白IgM-α)、CD34(造血祖细胞抗原CD34)、CD19(B淋巴细胞抗原CD19)、CD7(Tp41)、细胞质形式CD3(细胞质CD3；cyCD3)以及细胞表面形式：(CD3)(T细胞抗原受体络合物；T3络合物)、CD45(白细胞共同抗原；LCA；T200糖蛋白；CD45R；Ly5同系物；B220；蛋白质酪氨酸磷酸酶受体类型C；PTPRC)、CD20(B淋巴细胞表面抗原B1；B1；Bp35；白细胞表面抗原Leu-16；膜跨4结构域亚簇A成分1)、λ轻链(IGL；Igλ)、K轻链(IGK；Igκ)、CD38(ADP-核糖环化酶/循环ADP-核糖水解酶、外烟酰胺腺嘌呤二核苷酸糖水解酶)、CD4(T细胞抗原T4/Leu3)、CD8(p32；OKT8 T细胞抗原；T8 T细胞抗原)、CD5(T1；LEU1)、TCRγδ、CD56(细胞粘附分子、神经1；NCAM1；MSK39)、CD23(IgE受体II的Fc片断；FCER2；IgE结合因子；IGEBF；C型外源凝集素结构域簇4，成分J；CLEC4J；IgE的Fc片断受体，低亲和力Ii；免疫球蛋白E受体，低亲和力II)、CD10(膜金属肽链内切酶；MME；常见急性淋巴细胞性白血病抗原；CALLA；中性内肽酶；中性肽链内切酶；NEP；脑啡肽酶；atriopeptidase)、CD79b(免疫球蛋白相关β；IGB；免疫球蛋白相关B29蛋白质；B29)、CD200(OX2；膜糖蛋白MRC OX2；MOX2)、CD43(涎福林；SPN；白细胞唾液酸蛋白；LSN；白细胞大唾液糖蛋白；CD43；GPL115)、β2-微球蛋白(B2M)、CD138(多配体蛋白聚糖1；SDC1；SYND1；多配体蛋白聚糖；SDC)、CD28(Tp44)、Cd27(肿瘤坏死因子受体亚簇成分7；TNFRSF7；S152)、CD117(KIT原癌基因、受体酪氨酸激酶；KIT；v-kit哈迪-朱克曼4猫肉瘤病毒致癌基因同系物；肥大细胞生长因子受体；干细胞生长因子受体；SCFR)、CD81(抗恶性细胞增生抗体靶标1；TAPA1)、CD71(铁传递蛋白受体；TFRC；铁传递蛋白受体1；TFR1；TFR；TRFR)、CD105(内皮素；ENG)、TdT(末端脱氧核苷酸转移酶；DNTT；末端转移酶；TDT)。在一些情况下，对照组合物包括多个阳性对照标志物，其范围为10％或以上，15％或以上，20％或以上，25％或以上，30％或以上，35％或以上，40％或以上，45％或以上，50％或以上，55％或以上，60％或以上，或65％或以上，选自由以下成分成的组：MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、CD3(细胞质CD3和细胞表面CD3)、CD45、CD20、λ轻链、K轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。在一些情况下，对照组合物包括阳性对照标志物MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、CD3(细胞质CD3和细胞表面CD3)、CD45、CD20、λ轻链、K轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。在一些实施例中，对照组合物包括由所有BD OneFlow系列产品化验的所有标志物，包括由截至本专利申请的申请日期可用的系列产品化验的所有69个标志物(dbiosciences.com/eu/applications/clinical/blood-cell-disorders/oneflow-reagents/m/1641972/overview)。

对照组合物的要素包括一个或多个细胞组分。在本文件中，“细胞组分”指例如细胞、细胞群，或一个或多个细胞的悬液或包含于细胞内或由细胞生成的一个细胞的一些部分。在一些情况下，对照组合物包括不同细胞组分(例如不同细胞群)的组合。对照组合物可为细胞组分的任何适当组合，以便为化验提供所有目标阳性对照标志物。如果成分包括一个以上的细胞组分组合，则成分中不同细胞组分的数量可不同，例如介于二到十之间，比如二到五，例如二到三。在一些情况下，对照组合物包括第一白细胞组分，其包括用于白细胞的一个或多个阳性对照标志物；第二细胞组分，其包括用于干细胞/祖细胞的一个或多个阳性对照标志物；以及第三细胞组分，其包括用于赘生性细胞的一个或多个阳性对照标志物，其中，第一白细胞组分、第二细胞组分和第三细胞组分是固定的。对照组合物可包括任何适当数量的细胞。在一些情况下，对照组合物包括以下范围数量的细胞：1x10

第一白细胞组分可包括用于白细胞的任何适当阳性对照标志物，例如由白细胞表达的蛋白质。如果一个给定标志物是由白细胞表达，则该给定标志物被视为是用于白细胞的适当阳性对照标志物，可用于识别非均质细胞群中的白细胞。在一些情况下，阳性对照标志物由白细胞或分化白细胞表达。在一些情况下，第一白细胞组分包括一个或多个下列阳性对照标志物：MPO、CD79a、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD20、λ轻链、K轻链、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、β2-微球蛋白。在一些情况下，第一白细胞组分包括5个或以上、10个或以上或15个或以上的下列阳性对照标志物：MPO、CD79a、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD20、λ轻链、K轻链、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、β2-微球蛋白。

第一白细胞组分可包括为白细胞提供阳性对照标志物的任何适当细胞或细胞部分。在一些情况下，第一白细胞组分包括全白细胞。在本文件中，“白细胞”或“白血球”指在人体宿主免疫防御系统中起一定作用的细胞。白细胞可包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、粒细胞(嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞)，以及淋巴细胞(B和T淋巴细胞)。第一白细胞组分可根据任何领域内已知的适当方法制备，如下文所述。在一些情况下，第一白细胞组分包括全白细胞，基本没有全红细胞。在一些情况下，第一白细胞组分包括一定数量的纯化或浓缩全白细胞。在一些情况下，第一白细胞组分由与溶解剂接触以溶解红细胞的全白细胞制备。在一些情况下，使用溶解试剂制备的第一白细胞组分包括溶解红细胞的残留物或部分，包括例如溶解红细胞的细胞膜和细胞质内容。在一些情况下，使用溶解试剂制备的第一白细胞组分包括一定数量的溶解剂，例如红细胞溶解后尚未清除的溶解剂或清洗步骤后残留的多余溶解剂。第一白细胞组分可包括任何适当数量的细胞。在一些情况下，第一白细胞组分包括以下范围数量的细胞：对照组合物总细胞数的80％到95％、85％到95％，或90％到95％。在一些情况下，第一白细胞组分包括以下范围数量的细胞：2x10

第二细胞组分可包括用于造血干细胞/祖细胞的任何适当阳性对照标志物，例如由造血干细胞/祖细胞表达的蛋白质。在一些情况下，第二细胞组分包括下列阳性对照标志物：CD34、CD117、CD105、CD71、TdT。在一些情况下，第二细胞组分包括2个或以上、3个或以上、4个或以上或5个或以上的下列阳性对照标志物：CD34、CD117、CD105、CD71、TdT。

第二细胞组分可包括为造血干细胞/祖细胞提供阳性对照标志物的任何适当细胞或细胞部分。在一些情况下，第二细胞组分包括造血干细胞/祖细胞。在本文件中，术语“造血干细胞(HSC)”指具有多谱系造血分化潜力和持续自我再生活动的细胞。“自我再生”指细胞分裂并生成至少一个具有与父细胞相同特性(例如自我再生)的子细胞的能力第二子细胞可定向于特定分化路径。例如，自我再生造血干细胞分裂并形成一个子干细胞，并且另一个子干细胞定向于骨髓或淋巴路径分化。定向祖细胞通常丧失了自我再生能力，在细胞分裂时生成显示出进一步分化(受限)表型的两个子细胞。造血干细胞能够在接受了骨髓或脐带血移植的人体中再生长期多谱系血细胞生成(例如“长期移植”)。根据本发明实施例用于对照组合物的造血干细胞可得自以下来源的任何一者或多者：胚胎组织、脐带血、骨髓、外周血、流通外周血、干细胞系，或者可体外得自其他细胞，比如胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)或成体多能细胞。以上来源的细胞可在使用前采用所属领域技术人员可接受的任何方法体外扩展。在一些情况下，造血干细胞可分离自任何上述来源(例如骨髓)或体外培养。如果使用的细胞得自永生干细胞系，则可进一步有利于轻松获取和制备充分数量的细胞。在本文件中，术语“造血祖细胞”包括能够分化为造血系统的数种细胞类型的多能细胞，包括但不限于粒细胞、单核细胞、红细胞、巨核细胞、B细胞和T细胞。造血祖细胞定向于造血细胞谱系，一般不自我再生。术语“造血祖细胞”包括短期造血干细胞(ST-HSC)、多能祖细胞(MPP)、共同髓系祖细胞(CMP)、粒-单系祖细胞(GMP)，以及巨核-红血球系祖细胞(MEP)。术语“造血祖细胞”不包括能够自我再生的造血干细胞(在本文件称为“造血干细胞”)。造血祖细胞的存在性可通过完整甲基纤维素化验从功能上确定为集落形成单位细胞(CFU-C)，或者使用所属领域技术人员熟知的化验检测细胞表面标志物来从表型上确定。

造血干细胞/祖细胞可分离自任何适当来源。在一些实施例中，对照组合物的造血干细胞/祖细胞得自骨髓。在一些实施例中，对照组合物的造血干细胞/祖细胞得自脐带血和/或胎盘脐带血(例如得自在一个人出生时收集自该个人的脐带血，或者得自在人出生时收集自两个或多个不同人的脐带血池)。在其他实施例中，分离的造血干细胞/祖细胞得自外周血(例如移动外周血干细胞)。在一些实施例中，分离的造血干细胞/祖细胞得自单个人，而在其他实施例中，分离的HSPC得自两个或多个人(其中该等两个或多个人可为但不限于相同人种的人或相同种族的人)。适当的HSPC包括例如正常人初级骨髓CD34+cells(

第二细胞组分可包括任何适当数量的细胞。在一些情况下，第二白细胞组分包括以下范围数量的细胞：对照组合物总细胞数的1％到10％、3％到10％，或5％到10％。在一些情况下，第二细胞组分包括以下范围数量的细胞：0.1x10

第三细胞组分可包括用于赘生性细胞的任何适当阳性对照标志物，例如由赘生性细胞表达的蛋白质。在一些情况下，第三细胞组分包括下列阳性对照标志物：CD38、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD56、CD45、CD28、CD27、CD81、CD138。在一些情况下，第三细胞组分包括5个或以上、10个或以上或15个或以上的下列阳性对照标志物：CD38、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD56、CD45、CD28、CD27、CD81、CD138。

第三细胞组分可包括为赘生性细胞表达阳性对照标志物的任何适当细胞或细胞部分。在一些情况下，第三细胞组分包括赘生性细胞。该第三细胞组分可由任何适当的赘生性细胞源(例如赘生性细胞系)制备。

在本文件中，“赘生性细胞”指表现出相对自主生长特性的细胞，因此它们表现了异常的增长表型，表现为严重失控的细胞增生。赘生性细胞可包括可能活跃复制或暂时处于非复制休眠状态的细胞(G 1或G 0)；类似地，赘生性细胞可包括显著分化表型细胞、非显著分化表型细胞或二者混合的细胞。因此，并非所有赘生性细胞均一定在给定的时间点复制细胞。赘生性细胞可包括特定细胞谱系的异常非成熟细胞和成熟细胞。赘生性细胞可包括良性肿瘤细胞和恶性肿瘤细胞。恶性赘生性细胞通常称为癌症，如果由内胚层和外胚层组织，通常称为上皮癌，或者如果源自中胚层产生的细胞类型，则称为肉瘤。

在一些情况下，赘生性细胞包括血液癌细胞或血癌细胞。术语“血液癌”或“血癌”指源自血液的细胞癌。在某些实施例中，血癌细胞包括异常白细胞，例如淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。在一些情况下，赘生性细胞包括得自外周血、骨髓和淋巴节组织的B、T和NK细胞谱系的赘生性成熟淋巴细胞群。在某些实施例中，赘生性细胞包括得自骨髓和外周血的赘生性不成熟造血干细胞/祖细胞群(淋巴和非淋巴谱系)。在某些实施例中，对照组合物包括得自癌细胞系的赘生性细胞，其中癌症选自此癌组：急性淋巴细胞白血病、非淋巴急性白血病、B、T和骨髓急性白血病(例如BCP-ALL、T-ALL)、B细胞慢性淋巴组织增生疾病(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL))、浆细胞疾病(例如(例如多发性骨髓瘤)、未分化白血病(AUL)以及混合表型急性白血病(MPAL)。在某些实施例中，对照组合物包括得自癌细胞系的赘生性细胞，其中癌症选自此癌组：多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、包括急性骨髓性白血病和慢性髓细胞性白血病在内的骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、B细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤、前体B淋巴细胞白血病/淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞淋巴球性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤(有或没有绒毛淋巴细胞)、毛细胞白血病、浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤、MALT型淋巴节外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(有或没有单核细胞样B细胞)、伯基特淋巴瘤；前体T淋巴细胞淋巴瘤/淋巴瘤、T细胞淋巴球性白血病、T细胞粒状淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成体T细胞淋巴瘤/白血病(HTLV 1阳性)、鼻型淋巴结外NK/T细胞淋巴瘤、肠病变型T细胞淋巴瘤、肝脾型.γ.-.δ。T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎型T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病/赛扎里氏综合征、间变性大细胞淋巴瘤(T/零位细胞、原发性皮肤型)、间变性大细胞淋巴瘤(T-/零位细胞、原发系统型)、非表征型外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、真性红细胞增多症(PV)、骨髓增生异常综合征(MDS)、惰性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)以及侵袭性非霍奇金淋巴瘤(aNHL)。

第三细胞组分可包括任何适当数量的细胞。在一些情况下，第三白细胞组分包括以下范围数量的细胞：对照组合物总细胞数的1％到10％、3％到10％或5％到10％。在一些情况下，第三细胞组分包括以下范围数量的细胞：0.1x10

在某些实施例中，对照组合物为干燥化成分。一种干燥化对照组合物可以是一种包括少量溶剂的成分。例如，一种干燥化对照组合物可包括少量液体，例如水。在一些情况下，一种干燥化对照组合物基本不包括溶剂。例如，干燥化对照组合物可基本不包括液体，例如水。在某些实施例中，一种干燥化对照组合物包括25重量百分比或以下的溶剂，例如20重量百分比或以下；或15重量百分比或以下；或10重量百分比或以下；或5重量百分比或以下；或3重量百分比或以下；或1重量百分比或以下；或0.5重量百分比或以下溶剂。在一些情况下，一种干燥化对照组合物不是液体。在一些情况下，一种干燥化对照组合物基本上是固体。例如，一种干燥化对照组合物可具有高黏度，例如以下范围的黏度：标准条件下10,000cP或以上；或25,000cP或以上；或50,000cP或以上；或75,000cP或以上；或100,000cP或以上；或150,000cP或以上；或200,000cP或以上；或250,000cP或以上。在一些实施例中，对照组合物可为以下范围的量：0.1mg到1000mg，例如0.1mg到900mg，例如0.1mg到800mg，例如0.1mg到700mg，例如0.1mg到600mg，例如0.1mg到500mg，例如0.1mg到400mg，或0.1mg到100mg，0.1mg到300mg，或0.1mg到200mg，或0.1mg到100mg,0.1mg到90mg，或0.1mg到80mg，或0.1mg到70mg，或0.1mg到60mg，或0.1mg到50mg，或0.1mg到40mg，或0.1mg到30mg，或0.1mg到25mg，或0.1mg到20mg，或0.1mg到15mg，或0.1mg到10mg，或0.1mg到5mg，或0.1mg到1mg，或0.1mg到0.5mg。在一些实施例中，对照组合物可为以下范围的量：0.1g到10g，或0.1g到5g，或0.1g到1g，或0.1g到0.5g。

在一些情况下，对照组合物为冻干成分。在某些情况下，一种冻干的对照组合物为已通过升华去除水分的一种成分，其中该成分中的水经历了从固体到气体的相变。例如，一种冻干的成分可为已通过以下方法去除了该成分中的水分的一种成分：凝固该成分(例如凝固该成分中的水)，降低该成分周围的压力，从而让成分中的水升华。在某些情况下，一种冻干的对照组合物包括少量的水，例如25％或以下；或20％或以下；或15％或以下；或10％或以下；或9％或以下；或8％或以下；或7％或以下；或6％或以下；或5％或以下；或4％或以下；或3％或以下；或2％或以下；或1％或以下；或0.5％或以下；或0.25％或以下；或0.1％或以下(按卡尔费休(KF)滴定法测量)。在一些情况下，一种冻干成分具有3％或以下的水(按卡尔费休滴定法测量)。在一些情况下，一种冻干成分具有1％或以下的水(按卡尔费休滴定法测量)。在一些情况下，一种冻干成分具有0.5％或以下的水(按卡尔费休滴定法测量)。冻干成分可包括添加剂和/或赋形剂，例如稳定剂。在一些情况下，冻干成分包括稳定剂，例如糖或多元醇。适合用于冻干成分的糖和多元醇包括兼容其他试剂、缓冲液以及使用的样本组分的糖。适合的糖的例子包括但不限于蔗糖、麦芽糖、海藻糖、2-羟丙基-β-环糊精(β-HPCD)、乳糖、葡萄糖、左旋糖、半乳糖、氨基葡萄糖等等及其组合。在某些情况下，糖为二糖。例如，二糖可为蔗糖。适合的多元醇类的例子包括但不限于甘露醇、丙三醇、赤藓糖醇、苏糖醇、木糖醇、山梨醇等等及其组合。

在某些实施例中，对照组合物为液体成分。该液体成分可包括任何适当的液体介质(例如缓冲液)以容纳(例如悬浮)上文所述的细胞组分。在这些情况下，对照组合物的量可为0.1ml到200ml。例如，对照组合物可为以下范围的量：0.1ml到1000ml，例如0.1ml到900ml、或0.1ml到800ml、或0.1ml到700ml、或0.1ml到600ml、或0.1ml到500ml、或0.1ml到400ml、或0.1ml到300ml、或0.1ml到200ml、或0.1ml到100ml、或0.1ml到50ml、或0.1ml到25ml、或0.1ml到10ml、或0.1ml到5ml、或0.1ml到1ml、或0.1ml到0.5ml。

对照组合物可在任何适当温度下存储。在一些情况下，对照组合物在以下范围的温度下存储：1℃到30℃、2℃到27℃或5℃到25℃。

对照组合物可装在兼容该对照组合物的任何适当容器中。“兼容”指容器与接触于容器表面的对照组合物的液体和/或试剂基本处于惰性状态(例如基本不与之反应)。目标容器可为不同容器，可包括但不限于血液采集管、试管、离心管、培养管、falcon管、微管、埃彭道夫管、标本采集容器、标本运输容器，以及注射器。

盛装对照组合物的容器可配置为盛装任何适当体积的对照组合物。在一些情况下，容器大小可取决于要在容器中盛装的对照组合物的体积。在某些实施例中，容器可配置为盛装以下范围的对照组合物量：0.1mg到1000mg，例如0.1mg到900mg、例如0.1mg到800mg、例如0.1mg到700mg、例如0.1mg到600mg、例如0.1mg到500mg、例如0.1mg到400mg，或0.1mg到100mg、0.1mg到300mg、或0.1mg到200mg、或0.1mg到100mg、0.1mg到90mg、或0.1mg到80mg、或0.1mg到70mg、或0.1mg到60mg、或0.1mg到50mg、或0.1mg到40mg、或0.1mg到30mg、或0.1mg到25mg、或0.1mg到20mg、或0.1mg到15mg、或0.1mg到10mg、或0.1mg到5mg、或0.1mg到1mg、或0.1mg到0.5mg。在某些实施例中，容器可配置为盛装以下的范围的对照组合物量：0.1g到10g、或0.1g到5g、或0.1g到1g、或0.1g到0.5g。例如，容器可配置为盛装以下范围的对照组合物体积(例如液体体积)：0.1ml到1000ml，例如0.1ml到900ml、或0.1ml到800ml、或0.1ml到700ml、或0.1ml到600ml、或0.1ml到500ml、或0.1ml到400ml、或0.1ml到300ml、或0.1ml到200ml、或0.1ml到100ml、或0.1ml到50ml、或0.1ml到25ml、或0.1ml到10ml、或0.1ml到5ml、或0.1ml到1ml、或0.1ml到0.5ml。在某些情况下，容器可配置为盛装0.1ml到200ml体积(例如液体对照组合物体积)。

容器可为不同形状。例如，盛装对照组合物的容器可用于化验中，例如流式细胞分析。在这些情况下，容器可配置为兼容化验和/或用于执行化验的方法或其他装置的形状。例如，容器可配置为用于执行化验的典型实验室设备的形状，或配置为兼容用于执行化验的其他装置的形状。在一些实施例中，液体容器可为小玻璃瓶或试管。在某些情况下，液体容器为小玻璃瓶。在某些情况下，液体容器为试管。

如上所述，容器实施例可兼容接触于试剂装置的对照组合物。适当容器材料的例子包括但不限于玻璃和塑料。例如，容器可由玻璃组成，例如不限于硅玻璃、硼硅玻璃(例如PYREX

在一些实施例中，容器可被密封。即容器可包括密封件，基本阻止容器内容物溢出容器。容器密封件还可基本阻止其他物质进入容器。例如，密封件可为防水密封件，基本阻止液体进入或溢出容器，或者可为气密密封件，基本阻止气体进入或逸出容器。在一些情况下，密封件为可移除或可破坏密封件，以便容器内容物可在需要时暴露于周围环境，例如，当需要移除容器内容物的一部分时。在一些情况下，密封件由弹性材料制成，以提供屏障(例如水密性和/或气密性密封件)，将样本保持在容器内。特定类型的密封件包括但不限于膜(聚合物膜)、盖等，取决于容器类型。适合的密封件材料包括例如橡胶或聚合物密封件，例如不限于硅胶、天然橡胶、丁苯橡胶、乙烯丙烯共聚物、聚氯丁烯、聚丙烯酸酯、聚丁二烯、聚氨酯、丁苯，等等，及其组合。例如，在某些实施例中，密封件为可被针、注射器或插管穿透的隔膜。密封件还可方便接触容器中的样本，以及作为覆盖在容器开口上的保护屏障。在一些情况下，密封件为可移除密封件，例如螺纹帽或其它适当的密封元件，可施加到容器的开口。例如，在向容器添加样本之前或之后，可以在开口上旋上螺纹帽。

本发明的实施例要素还包括在标志物检测化验中按上文所述方法将对照组合物用作对照物，例如阳性对照物。“标志物检测化验”指检测组合物中一种或多种标志物的存在性和/或不存在性。方法可包括使用对照组合物执行流式细胞分析。“流式细胞分析”指一种分析技术，其中，粒子在液体样本中流经试管(通常称为流通槽)时，测定粒子的物理和/或化学属性。可通过使液体样本接受各种刺激物来研究液体样本，其中光是一种常用刺激方法。包含流通池以及相关液流、光提供和光检测组件的装置通常称为流式细胞分析仪。流式细胞分析可包括将测试组合物集中为穿过光源的单个粒子流，在穿过期间，从粒子分散发出的光被各种检测器测量。测量值用于生成多参数数据集，描述粒子的物理特性及其荧光特性(如果粒子被荧光标记)。在一些情况下，使用多个标记结合物标记粒子，其中每个不同的标记(例如荧光标记)对应于一个不同的标志物。在某些情况下，对照组合物作为流式细胞分析中的阳性对照物，以验证流式细胞分析的性能。对照组合物可提供各种标志物(例如目标阳性对照标志物)，如上文所述，用于流式细胞分析检测。在给定流式细胞分析中，每个测试组合物和对照组合物可用于流式细胞分析，并可为每个测试组合物和对照组合物获得流式细胞分析数据。在某些实施例中，方法包括使用对照组合物和/或测试组合物根据本文件中所述的任何实施例执行流式细胞分析，其中流式细胞分析包括：使用特定于一种或多种阳性对照标志物的一种或多种结合物接触对照组合物，以生成标记的对照组合物；将标记的对照组合物引入到流式细胞分析仪以生成流式细胞分析数据，指示是否检测到一种或多种阳性对照标志物，其中指示一种或多种阳性标志物检测的流式细胞分析数据验证流式细胞分析以及一种或多种结合物的功能。

对对照组合物中目标阳性对照标志物的检测(例如阳性流式细胞分析数据或阳性流式细胞分析结果)可验证流式细胞分析及该等一种或多种结合物的功能，例如可指示化验正确执行，系统和试剂正确工作。在某些实施例中，显示检测到阳性对照标志物的流式细胞分析数据指示制备用于流式细胞分析(例如标记对照组合物和/或测试组合物，将对照组合物和/或测试组合物引入到测试细胞分析仪)的对照组合物和/或测试组合物的方法正确执行。在某些实施例中，显示检测到阳性对照标志物的流式细胞分析数据指示流式细胞分析系统(例如流式细胞分析仪、计算机软件和硬件)正确工作，流式细胞分析系统正确设置。在某些实施例中，显示检测到阳性对照标志物的流式细胞分析数据指示在流式细胞分析中使用的试剂(例如共轭于可检测标记的结合物、缓冲液等)正确工作。在一些情况下，对照组合物的阳性流式细胞分析数据验证测试组合物的流式细胞分析数据或结果。在此类情况下，阳性流式细胞分析结果可确认获得的测试组合物的阳性流式细胞分析结果确实为阳性，而不是因为试验程序错误或设备/试剂问题。测试组合物的阴性流式细胞分析结果可包括指示在测试组合物中未检测到一种或多种目标标志物。在某些实施例中，测试组合物中未检测到的一种或多种目标标志物对应于未检测到的一种或多种阳性对照标志物。

流式细胞分析数据可提供为点阵图，分别在x轴和y轴上显示两个测量参数以及代表检测到单个粒子的事件。示例点阵图参见图1-10。在图1-10中，参数荧光、前向散射(FSC)和/或测向散射(SSC)。在具有共同特性(例如前向散射、侧向散射和标志物表达)的细胞群周围放置选通控制，以分析和量化这些目标群。目标群可按其前向散射和侧向散射属性及其由荧光检测到的标志物表达模式来区分。点阵图分析可识别正常和赘生性细胞群。图1提供了流式细胞分析数据，显示对在对照组合物中以BD OneFlow

没有出现显示对照组合物中目标阳性对照标志物检测的数据可指示流式细胞分析未正确执行，和/或系统和/或试剂未正确工作。在一些情况下，显示未检测到阳性对照标志物的流式细胞分析数据意味着获得的测试组合物的流式细胞分析数据不准确、不可靠，对测试组合物执行的流式细胞分析的一个或多个步骤和要素受到影响或无正确工作。在某些实施例中，显示未检测到阳性对照标志物的流式细胞分析数据指示制备用于流式细胞分析(例如标记对照组合物和/或测试组合物，将对照组合物和/或测试组合物引入到测试细胞分析仪)的对照组合物和/或测试组合物的方法未正确执行。在某些实施例中，显示未检测到阳性对照标志物的流式细胞分析数据指示流式细胞分析系统(例如任何流式细胞分析仪、计算机软件和硬件等)未正确工作，以及/或流式细胞分析系统设置不正确。在某些实施例中，显示未检测到阳性对照标志物的流式细胞分析数据指示在流式细胞分析中使用的试剂(例如任何共轭于可检测标记的结合物、缓冲液等)未正确工作。在一些情况下，数据显示流式细胞分析协议步骤可能被跳过或无以正确顺序执行，或者试剂未在适当的时间添加或未添加。数据可指示需要修复或替换流式细胞分析系统和试剂。在一些情况下，数据指示流式细胞分析的一个或多个参数(例如细胞浓度、流式细胞分析仪设置、细胞染色、细胞透化、清洗、重组等)需要调整。在一些情况下，方法包括基于流式细胞分析数据调整(例如增加、减少、重置等)流式细胞分析的一个或多个参数。

在流式细胞分析中使用的测试组合物可为得自对象的生物样本，例如由对象的组织和液体(例如血液)制备的细胞悬液。术语“生物样本”采用其传统含义，指整个有机体、植物、真菌或动物组织、细胞或组成部分的子部分，在某些情况下可在血液、黏液、淋巴液、滑膜液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道分泌物和精液中找到。因此，“生物样本”既指原生有机体或其组织的子部分，也指从该有机体或其组织的子部分制备的匀浆、溶菌产物或提取物，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤段、呼吸道、胃肠道、心血管以及泌尿生殖道、眼泪、唾液、奶汁、血细胞、肿瘤、器官。生物样本可为任何类型的有机体组织，包括健康和病变组织(例如癌化、恶性和坏死性组织等)。在某些实施例中，生物样本为液体样本，诸如血液或其洐生物例如血浆、眼泪、尿液、精液等，其中在一些情况下样本为血液样本，包括全血，诸如得自静脉穿刺或手指针刺的血液(其中在化验前血液可与任何试剂组合或不组合，例如防腐剂、抗凝血剂等)。

在某些实施例中，样本源为“哺乳动物”或“哺乳类”，其中此类术语广泛用于描述哺乳类生物，包括食肉动物类(例如狗和猫)、啮齿类(例如家鼠、豚鼠、田鼠)，以及灵长类(例如人、黑猩猩和猴子)。在一些情况下，对象为人。方法可应用于得自两种性别的任何阶段的人对象(即新生儿、婴儿、少年、青少年、成年人)的样本，其中在某些实施例中，人对象为少年、青少年或成年人。虽然本发明可应用于来自人对象的样本，但应说明，这些方法也可执行于来自其它动物对象(即“非人类对象”的样本，例如不限于鸟、家鼠、田鼠、狗、猫、家畜和马。

如上文所述，方法可包括将对照组合物与特定于一个或多个阳性对照标志物的一个或多个结合物接触，以生成标记的对照组合物。该接触可将标记结合物与阳性对照标志物稳定关联。将对照组合物与一个或多个特定结合物接触的方法可包括将对照组合物与特定结合物在容器或反应腔中组合。在一些情况下，对照组合物与一种或多种特定结合物接触足够的时间以标记目标标志物，例如接触10分钟到一夜，包括20到30分钟。在一些情况下，将对照组合物与一个或多个特定结合物接触的方法包括将对照组合物与一个或多个特定结合物组合，例如培养、混合等。在一些情况下，接触包括将对照组合物引入或放入包含有标记结合物的容器。标记特定结合物可以任何方便的形式装于容器中，例如存储稳定组合物。在一些情况下，接触可在20到27摄氏度的温度范围内发生，例如22摄氏度。接触可于pH 6.0到9.0的范围发生，例如pH 7.4。

对照组合物可同时或连续与可检测标记接触。对照组合物可与充分数量的可检测标记接触充分的时间，以让可检测标记与其特定目标结合。例如，对照组合物可接触5分钟到数小时，例如30分钟到2小时。在接触步骤中，对照组合物可保持于任何方便的温度，例如零度到室温之间。然后可按比执行清洗步骤，例如清除任何未结合的可检测标记及其他对照组合物组分。清洗可使用任何方便的协议执行，例如将反应混合物与合适的清洗缓冲液(例如PBS、HEPES)组合，并将细胞从液体分离。根据需要，给定的洗涤方案可以包括一个或多个不同的洗涤步骤。执行任何清洗协议之后，细胞可重新悬浮在合适液体中，例如清洗缓冲液或其他缓冲液。

结合物可包括特定结合结构域和标记结构域。“特定结合”及类似术语指一个结构域相对于溶液或反应混合物中的其他分子或部分的首选结合(例如同一结合对中的一个结合物与另一个结合对成员的结合。特定结合结构域可(例如共价或非共价)结合到细胞内的特定抗原表位。在某些情况下，特定结合结构域非共价地结合到目标。在该等情况下，与结合目标(例如一个或多个阳性对照标志物)的特定结合结构域关联其特征为以下范围的KD(离解常数)：10

在一些情况下，一个或多个结合物(或特定结合物)共轭于可检测标记以形成例如标记结合物。可检测标记可基于例如荧光发光最大值、荧光极化、荧光寿命、光散射、质量、分子质量或其组合而可检测。在某些情况下，可检测标记可为荧光团(即荧光标记、荧光染料等)。荧光团可选自适合用于分析应用(例如流式细胞分析、成像等)的多种染料中的任何一者。各种来源的很多染料均商业可用，例如Molecular Probes(Eugene,OR)以及Exciton(Dayton,OH)。可整合到微粒中的荧光团的例子包括但不限于二钠4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；吖啶及其洐生物例如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红以及异硫氰酸酯吖啶；5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸钠盐(EDANS)；4-氨基-N-[3-(乙烯基磺酰)苯基]萘酰亚胺-3,5-二磺酸盐(荧光黄VS)；N-(4-苯胺-1-萘基)马来酰亚胺；2-氨基苯甲酰胺；灿烂黄；香豆素及洐生物例如香豆精、7-乙酰氧基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆满151)；青色素及洐生物例如四溴四氯荧光素、Cy3,Cy5,Cy5.5,和Cy7；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；溴邻苯三酚红；7-二乙胺基-3-(4'-异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素；二乙氨基香豆素；二乙烯三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰基二氢二苯乙烯-2,2'-二磺酸；4,4`-二异硫氰基-2,2`-芪二磺酸；丹磺酰氯(DNS、丹酰氯)；4-(4`-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲氨基偶氮苯-4'-硫代异氰酸酯(DABITC)；曙红及洐生物例如曙红和曙红异硫氰酸酯；赤藓红及洐生物例如赤藓红和赤藓红异硫氰酸酯；乙啡啶；荧光素及洐生物例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、氯三嗪基荧光素、萘基荧光素和QFITC(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；绿色荧光蛋白质(GFP)；礁珊瑚荧光蛋白质(RCFP)；丽丝胺

在一些情况下，荧光团为聚合染料。在该方法的一些实例中，聚合染料包括共轭聚合物。共轭聚合物(CP)其特征在于离域电子结构，包括交替非饱和键(例如双键和/或三键)以及饱和键(例如单键)的主链，其中π电子可从一个键移动到另一个键。这样，共轭主链可在聚合染料上赋予一个扩展的线性结构，在聚合物的重复单元之间具有受限的键角度。例如，蛋白质和核酸虽然也是聚合性的，但在一些情况下不形成扩展杆结构，而是折叠为高序三维形状。此外，CP可形成“刚性杆”聚合物主链，沿聚合物主链在单体重复单元之间形成有限扭曲角度。在一些情况下，聚合染料包括具有刚性杆结构的CP。聚合染料的结构特性可影响分子的荧光属性。

目标聚合染料包括但不限于Gaylord等人在以下专利号的美国专利中描述的染料：20040142344、20080293164、20080064042、20100136702、20110256549、20110257374、20120028828、20120252986、20130190193、20160264737、20160266131、20180231530、20180009990、20180009989以及20180163054，上述专利的内容通过引用全文并入本文；以及Gaylord等人，J.Am.Chem。Soc.,2001,123(26),pp 6417–6418；Feng等人，Chem。Soc.Rev.,2010,39,2411-2419；以及Traina等人，J.Am.Chem。Soc.,2011,133(32),pp12600–12607描述的染料，其内容通过引用全文并入本文。

聚合染料可具有一种或多种所需的光谱属性，例如特定吸收最大波长、特定发射最大波长、消光系数、量子产率等等(参见Chattopadhyay等人，“亮紫荧光团：一种新的用于免疫荧光试验的超亮荧光化合物”。《细胞计量术》A部分，81A(6),456-466,2012)。在一些实施例中，聚合染料具有介于280nm和475nm之间的吸收曲线。在某些实施例中，聚合染料具有介于280nm和475nm之间的最大吸收(最大激发)。在一些实施例中，聚合染料吸收具有介于280nm和475nm之间波长的入射光。在一些实施例中，聚合染料具有400nm到850nm的最大发射波长，例如415nm到800nm，其中目标发射最大值的特定例子包括但不限于：421nm、510nm、570nm、602nm、650nm、711nm和786nm。在一些情况下，聚合染料具有选自以下组范围的最大发射波长：410nm到430nm、500nm到520nm、560nm到580nm、590nm到610nm、640nm到660nm、700nm到720nm以及775nm到795nm。在某些实施例中，聚合染料具有421nm的最大发射波长。在一些情况下，聚合染料具有510nm的最大发射波长。在一些情况下，聚合染料具有570nm的最大发射波长。在某些实施例中，聚合染料具有602nm的最大发射波长。在一些情况下，聚合染料具有650nm的最大发射波长。在一些情况下，聚合染料具有711nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合染料具有786nm的最大发射波长。在某些情况下，聚合染料具有421nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合染料具有510nm±5nm的最大发射波长。在某些情况下，聚合染料具有570nm±5nm的最大发射波长。在一些情况下，聚合染料具有602nm±5nm的最大发射波长。在一些实施例中，聚合染料具有650nm±5nm的最大发射波长。在某些情况下，聚合染料具有711nm±5nm的最大发射波长。在一些情况下，聚合染料具有786nm±5nm的最大发射波长。在某些实施例中，聚合染料具有选自以下组的发射最大值：421nm、510nm、570nm、602nm、650nm、711nm以及786nm。

可采用的特定聚合染料包括但不限于BD Horizon Brilliant

荧光标记可基于荧光发射最大值区分，可选地进一步基于光散射或消光区分。

在其他方面，标记结构域可为通过质谱分析检测的金属同位素，诸如通过质谱细胞计量中使用的渡越时间质谱仪检测，例如其内容通过引用并入本文的公布为WO/2010/097070的国际专利申请系列号PCT/US2012/020950专利中所述。

与对照组合物接触的标记结合物在某些情况下与接触于测试组合物者相同。在某些实施例中，与对照组合物接触的标记结合物得自相同源，例如相同试剂盒或给定试剂盒中的相同容器。在某些实施例中，与对照组合物接触的标记结合物和测试组合物提供于BDOneFlow

在一些情况下，本发明的方法包括将对照和测试组合物与标记结合物接触，用于骨髓和外周血中赘生性未成熟造血细胞群(淋巴和非淋巴谱系)的流式细胞分析免疫表型，以辅助对急性淋巴细胞白血病和非淋巴急性白血病的诊断，例如由BD OneFlow

在一些情况下，本发明的方法包括将对照和测试组合物与标记结合物接触，用于外周血、骨髓和淋巴结中B、T和NK细胞谱系的正常和赘生性成熟淋巴细胞群的流式细胞分析免疫表型，以辅助血液疾病诊断，例如由BD OneFlow

在一些情况下，本发明的方法包括将对照和测试组合物与标记结合物接触，用于外周血和骨髓中B细胞的流式细胞分析免疫表型，以辅助对慢性淋巴细胞白血病和其他B细胞慢性巴组织增生疾病的诊断，例如由BD OneFlow

在一些情况下，本发明的方法包括将对照和测试组合物与标记结合物接触，用于骨髓中正常多克隆和赘生性浆细胞群的流式细胞分析免疫表型，以辅助对造血系统疾病的诊断，例如由BD OneFlow

在一些情况下，本发明的方法包括将对照和测试组合物与标记结合物接触，用于骨髓中正常和赘生性浆细胞的流式细胞分析免疫表型，以辅助对多发性骨髓瘤或其他浆细胞疾病的诊断，例如由BD OneFlow

检测标记有可检测标记(即第一、第二和/或附加可检测标记)的阳性对照标志物可包括基于荧光发射最大值区分可检测标记。例如，可采用在光谱重叠的两个或多个可检测标记之间的荧光补偿来区分来自每个可检测标记的信号(例如荧光发射)。两个或多个可检测标记也可基于光散射、荧光寿命、激发光谱或其组合来区分。

如上文所述，该等方法的要素可包括将标记对照组合物引入流式细胞分析仪，以生成指示是否检测到一个或多个阳性对照标志物的流式细胞分析数据。标记对照组合物的阳性对照标志物可由流式细胞术检测。流式细胞术是一种使用多参数数据识别和区分液体介质中不同粒子的方法，例如在标记、大小和粒度等方面彼此不同的细胞或珠子。在流式细胞分析粒子(例如按上文所述制备的细胞)的过程中，首先将包含粒子的液体介质引入流式细胞分析仪的流路径中。当处于流路径中时，基本每次一个粒子通过一个或多个传感区域，其中每个粒子单独暴露于单色光，按需要单独记录每个粒子的光散射参数和/或荧光发射的测量值(例如两个或多个光散射参数以及对一个或多个荧光发射的测量值)。实时分析每个粒子的记录数据，或按需要存储于数据存储和分析设备中，例如计算机。美国专利第4,284,412号描述了配备单个光源的典型流式细胞分析仪的配置和使用，而美国专利第4,727,020号描述了配备两个光源的流式细胞分析仪的配置和使用。这些专利的内容通过引用并入本文。也可使用多于两个光源的流式细胞分析仪。

更具体地，在流式细胞分析仪中，粒子通过悬液，基本上一次一个粒子通过流路径中的一个或多个传感区域，其中在每个区域，每个粒子由能量源照亮。该能量源可包括发射单波长光的发光器，例如具有适当滤光片的激光(He/Ne或氩)或汞弧灯。例如，488nm的光可用作具有单一传感区域的流式细胞分析仪中的发射波长。对于发射两个不同波长光的流式细胞分析仪，可采用附加发射光波长，其中特定目标波长包括但不限于：535nm、635nm，等等。

与传感区域串联的检测器模块包括一个或多个检测器，例如集光器，诸如光电倍增管(“PMT”)，当粒子通过传感区域并由能量源照亮时，用于记录经过每个粒子的光(通常称为前向光散射)、正交反射到通过传感区域的粒子流的方向的光(通常称为正交或侧向光散射)以及从粒子发射的荧光(如果粒子使用荧光标志物标记)。每个前向光散射(FSC)、正交光散射(SSC)和荧光发射包括每个粒子的一个单独参数(即每个“事件”)。因此，可从标记有两个不同荧光标志物的粒子收集(并记录)例如两个、三个、四个或更多参数。

相应地，在流式细胞分析粒子的过程中，通过将粒子暴露于激发光并按需要测量一个或多个检测通道中的每个粒子的荧光，从而检测并唯一性地识别可能包含不同数量的第一、第二和/或附加可检测标记的粒子。激发光可来自一个或多个光源，并可为窄波光或宽波光。激发光源的例子包括激光、发光二极管和弧灯。在检测通道中发射的用于识别粒子和与之关联的结合络合物的荧光可在使用单光源激发后测量，或在使用不同光源激发后单独测量。如果使用单独的激发光源激发粒子标记，则标记可选择为让所有标记均可被使用的每个激发光源激发。

流式细胞分析仪进一步包括数据采集、分析和记录装置，例如计算机，其中多个数据通道从每个检测器记录每个粒子通过传感区域时的光散射及其发射的荧光的数据。分析系统旨在分类和计数粒子，其中每个粒子呈现为一系列数字化的参数值。在使用本发明方法对粒子进行流式细胞分析的过程中，流式细胞分析仪可设置为在选定参数触发，以将目标粒子与背景和噪音区分开来。“触发”指用于检测参数的预设阈值。它通常用作检测粒子通过激光束的手段。检测到超过选定参数预设阈值的事件即触发对该粒子的光散射和荧光数据的采集。对于化验介质中其响应低于阈值的粒子或其他组分，不采集其数据。触发参数可为检测到由粒子通过光束引起的前向散射光。流式细胞分析仪然后检测并收集粒子的光散射和荧光数据。

然后可基于从整个样本收集的数据通过“选通控制”对特定目标子群进一步分析。为了选择适当的选通控制，数据被绘制为图形，以便获得可能的最佳子群划分。此步骤通常通过在二维点阵图上绘制前向光散射(FSC)与侧向(正交)光散射(SSC)来完成。流式细胞分析仪操作员然后选择目标粒子子群(即选通控制范围内的细胞)，将不在选通控制范围内的粒子排除。如果需要，操作员可通过使用鼠标在计算机屏幕上围绕目标子群绘制一条线来选择选通控制。然后通过绘制这些粒子的其他参数(例如荧光)仅对处于选通控制范围内的粒子进一步分析。然后可将基于荧光的选通控制用于进一步划分细胞子群。

如果执行流式细胞分析，可采用任何方便的流式细胞分析系统。在某些情况下，目标流式细胞分析系统包括BD Biosciences FACSCanto

在某些实施例中，方法包括对干燥化对照组合物执行本文件中披露的任一步骤，其中该等方法进一步包括重组干燥化组合物。重组包括将先前干燥用于保存和存储的对照组合物还原为液态形式。在将干燥化对照组合物与可检测结合物接触并将对照组合物引入流式细胞分析仪之前，可将干燥化对照组合物与缓冲液重组。对照组合物可根据任何方便的协议与任何适当的重组剂(例如干燥矩阵缓冲液)接触，以重组对照组合物。重组时间不定，在一些情况下，从1分钟到30分钟，例如5分钟到10分钟。重组进行的温度不定，在一些情况下，温度可从0℃到50℃。

在一些情况下，流式细胞分析进一步包括将卓见组合物与透化剂接触。透化可让结合剂(例如标记结合物)进入对照组合物中的细胞，特定结合到细胞内的标志物。如前所述，透化可在将对照组合物与特定于阳性对照标志物的结合物接触之前进行。如前所述，透化可在重组干燥化对照组合物之后进行。对照组合物的细胞可通过暴露于任何数量的细胞透化剂诸如甲醇、丙酮或去污剂(例如Triton

该等方法的要素还可包括分选样本的粒子，例如测试组合物或对照组合物中的细胞。根据某些实施例的方法包括照射包含流通池(例如粒子分选模块的流通池)的盘查区域中的粒子流中的粒子的样本，检测来自该样本的光(例如荧光)，并将样本的粒子分选到收集系统中。在某些实施例中，样本为生物样本，方法包括分选和收集至少一种类型的细胞。

可将目标细胞靶标化，以便根据各种参数(例如通过将特定荧光标记附加到目标细胞而识别的表型特性)将其从粒子流分离。在一些实施例中，系统被配置为偏转分析确定为包含靶细胞的液滴。可将各种细胞靶标化以进行分选。目标靶细胞包括但不限于干细胞、T细胞、树突细胞、B细胞、粒细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞等。目标靶细胞包括具有可由方便的亲和剂或其共轭物捕获或标记的方便标志物或抗原的细胞。例如，靶细胞可包括选自以下内容物的一个或多个抗原：MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质和/或细胞表面CD3、CD45、CD20、λ轻链、K轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。

在实施某些实施例的方法时，将一定数量的初始液体样本流入流式细胞分析仪中。注入粒子分选模块的样本量不定，例如处于以下范围的样本：0.001mL到1000mL，例如0.005mL到900mL、例如0.01mL到800mL、例如0.05mL到700mL、例如0.1mL到600mL、例如0.5mL到500mL、例如1mL到400mL、例如2mL到300mL以及包括5mL到100mL。

根据某些实施例的方法可包括计数和分选样本中的标记粒子(例如靶细胞)。在实施目标方法时，首先将包括粒子的液体样本引入系统的流嘴。一旦从流嘴出来，即基本每次一个粒子通过样本盘查区域，其中每个粒子被光源照射，按需要单独记录每个粒子的光散射参数以及某些情况下荧光发射的测量值(例如两个或多个光散射参数以及对一个或多个荧光发射的测量值)。粒子流基本每次一个粒子通过粒子分选模块中的样本盘查区域的流路径，其中每个粒子由光源照射。取决于盘查的粒子流属性，0.001mm或以上的粒子流可由光照射，例如0.005mm或以上、例如0.01mm或以上、例如0.05mm或以上、例如0.1mm或以上、例如0.5mm或以上，包括1mm或以上的粒子流可由光照射。在某些实施例中，方法包括例如使用如上文所述的激光照射样本盘查区域中的粒子流平面横截面。在其他实施例中，方法包括照射样本盘查区域中预定长度的粒子流，例如对应于漫射激光束或灯的照射形状。

在某些实施例中，方法包括照射位于或靠近流通池嘴口的粒子流。例如，方法可包括照射位于距嘴口约0.001mm或以上的位置的粒子流，例如距嘴口0.005mm或以上、例如0.01mm或以上、例如0.05mm或以上、例如0.1mm或以上、例如0.5mm或以上，包括1mm或以上。在某些实施例中，方法包括照射紧邻流通池嘴口的粒子流。

与传感区域串联的检测器诸如光电倍增管(“PMT”)，当粒子通过传感区域并由能量源照亮时，用于记录经过每个粒子的光(在某些情况下称为前向光散射)、正交反射到通过传感区域的粒子流的方向的光(在一些情况下称为正交或侧向光散射)以及从粒子发射的荧光(如果粒子使用荧光标志物标记)。每个前向光散射(FSC)、正交光散射(SSC)和荧光发射(FL1、FL2等)包括每个粒子的一个单独参数(或者每个“事件”)。因此，可从标记有两个不同荧光标志物的粒子收集(并记录)例如两个、三个或四个参数。

适当的光检测协议包括但不限于光传感器或光检测器，诸如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合装置(CCD)、强化电荷耦合装置(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻、光电管、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电导体及其组合，以及其他光检测器。在某些实施例中，来自粒子分选模块的样本盘查区域的被照射粒子流的光由以下装置或传感器测量：电荷耦合装置(CCD)、半导体电荷耦合装置(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器。在某些实施例中，光由电荷耦合装置(CCD)测量。来自粒子分选模块的样本盘查区域的被照射粒子流的光由CCD测量时，CCD的有源腔检测表面积可不定，例如0.01cm2到10cm2、例如0.05cm2到9cm2、例如0.1cm2到8cm2、例如0.5cm2到7cm2以及包括1cm2到5cm2。

实时分析每个粒子的记录数据，或按需要存储于数据存储和分析设备中，例如计算机。美国专利第4,284,412号描述了配备单个光源的目标流式细胞分析仪的配置和使用，而美国专利第4,727,020号描述了配备两个光源的流式细胞分析仪的配置和使用。

在某些实施例中，通过将粒子暴露于激发光并按需要测量一个或多个检测通道中每个粒子的荧光，从而检测粒子并将其作唯一标识。在检测通道中发射的用于识别粒子和与之关联的结合络合物的荧光可在使用单光源激发后测量，或在使用不同光源激发后单独测量。如果使用单独的激发光源激发粒子标记，则标记可选择为让所有标记均可被使用的每个激发光源激发。

某些实施例中的方法还包括数据采集、分析和记录，例如使用计算机，其中多个数据通道从每个检测器记录每个粒子通过粒子分选模块的传感区域时的光散射及其发射的荧光的数据。在这些实施例中，分析包括分类和计数粒子，使得每个粒子呈现为数字化的参数值。标的系统可设置为在选定参数触发，以将目标粒子与背景和噪音区分开来。“触发”指用于检测参数的预设阈值，可用作检测粒子通过光源的手段。检测到超过选定参数阈值的事件即触发对该粒子的光散射和荧光数据的采集。对于化验介质中其响应低于阈值的粒子或其他组分，不采集其数据。触发参数可为检测到由粒子通过光束引起的前向散射光。流式细胞分析仪然后检测并收集粒子的光散射和荧光数据。

然后基于从整个粒子群收集的数据通过“选通控制”对特定目标子群进一步分析。为了选择适当的选通控制，数据被绘制为图形，以便获得可能的最佳子群划分。此步骤通过在二维点阵图上绘制前向光散射(FSC)与侧向(正交)光散射(SSC)来执行。然后选定一个粒子子群(即处于选通控制范围内的细胞)，不在选通控制范围内的粒子被排除。如果需要，可通过使用光标在计算机屏幕上围绕目标子群绘制一条线来选择选通控制。然后通过绘制这些粒子的其他参数(例如荧光)仅对处于选通控制范围内的粒子进一步分析。如果需要，上述分析可配置为获得样本中目标粒子的计数。

在某些实施例中，系统操作以确定在其间一个或多个收集系统与偏转液滴接收位置(例如流式细胞分析仪的分选块的输出)对齐的时隙。在一些实施例中，偏转信号包括初始偏转子信号和最终偏转子信号；系统操作以通过在将偏转器配置为出现液滴时偏转分析过的液滴的时隙的开始处发送初始偏转子信号而生成偏转信号。在某些情况下，方法包括在将偏转器配置为不偏转分析过的液滴的时隙的结束处向粒子分选模块发送最终偏转子信号。在一些实施例中，方法包括在时隙期间在单个分析过的液滴已被偏转之后，向粒子分选模块发送最终偏转子信号，其中最终偏转子信号将偏转器配置为不偏转分析过的液滴。分选的目标粒子例如细胞可由收集系统收集。

该等方法的要素可进一步包括流式细胞分析仪系统，其中流式细胞分析仪系统包括一个可操作地耦合到收集系统的分选流式细胞分析仪。流式粒子分选系统例如分选流式细胞分析仪用于基于粒子的至少一个测量特性分选液体样本中的粒子。在流式粒子分选系统中，悬液中的粒子诸如分子、分析物结合珠或单个细胞以粒子流形式通过一个检测区域，其中传感器检测包含于要分选的粒子流类型中的粒子。传感器一旦检测到要分选的粒子类型，即触发分选装置，选择性地分离目标粒子。

通常将液流通过检测区域使粒子暴露于来自一个或多个激光器的照射光来检测粒子，从而测量粒子的光散射和荧光属性。可使用荧光染料标记粒子或其组分以便检测，多种不同的粒子或组分可使用不同光谱的荧光染料标记不同粒子或组分来同时检测。使用一个或多个光传感器执行检测，以便独立测量每种不同荧光染料的荧光。

一种类型的流式粒子分选系统是静电分选型。在静电分选器中，从嘴口喷入悬液并进行震动，以将射流分解为均匀的离散滴。分选装置包括连接到射流以使包含要分选的粒子类型的液滴在脱离射流时带上电荷的液滴电荷赋予装置。液滴流通过由一对带相反电荷的偏转板建立的横向静电场。含有要分选的粒子的带电荷液滴被以与液滴电荷的极性和量级相关的方向和数量偏转，并收集在不同的收集容器中。不带电荷的液滴不偏转地通过静电场，并收集在中央容器中。

分选流式细胞分析仪的各种要素在以下专利号的美国专利中描述：3,960,449、4,347,935、4,667,830、4,704,891、4,770,992、5,030,002、5,040,890、5,047,321、5,245,318、5,317,162、5,464,581、5,483,469、5,602,039、5,620,842、5,627,040、5,643,796、5,700,692、6,372,506、6,809,804、6,813,017、6,821,740、7,129,505、7,201,875、7,544,326、8,140,300、8,233,146、8,753,573、8,975,595、9,092,034、9,095,494和9,097,640，其内容通过引用全文并入本文。在一些情况下，分选流式细胞分析仪为Becton Dickinson细胞分选仪，例如BD Biosciences Influx

本发明的实施例还包括产生对照组合物的方法，例如如上所述。方法可以包括将第一白细胞组分与第二细胞组分以及第三细胞组分进行组合，以产生组合的细胞组合物，第一白细胞组分包括白细胞的一种或多种阳性对照标志物，第二细胞组分包括造血干/祖细胞的一种或多种阳性对照标志物，第三细胞组分包括赘生性细胞的一种或多种阳性对照标志物，并将组合的细胞组合物与固定剂接触，以产生对照组合物。

在一些情况下，可通过从全血样品获得白细胞而产生第一白细胞组分。可以从任何合适的来源获得全血样品，诸如，例如人、非人灵长类动物、鼠类动物或另一种合适的哺乳动物。方法可以包括通过任何方便的方法从全血中分离白细胞或红细胞以产生第一白细胞组分。合适的方法包括但不限于离心、结合离心的沉降、声泳、流式细胞分选、免疫磁性细胞分离、微流体技术。在一些情况下，方法包括耗尽红细胞的全血样品。方法可以包括使一定量的全血与用于裂解红细胞的裂解剂接触，以产生第一白细胞组分。裂解剂可以破坏和裂解全血中的红细胞并留下白细胞。可以在产生组合的细胞组合物之前进行裂解，并且可以根据任何合适的方案进行裂解。可以使用任何合适的红细胞裂解剂，包括例如BD PharmLyse

方法还可以包括洗涤第一白细胞组分。可以在一定量的全血与裂解剂接触之后进行洗涤步骤，例如从白细胞组分中除去裂解的红细胞和其它组分。可以使用任何方便的方案进行洗涤，诸如通过将裂解的全血与合适的洗涤缓冲液(例如PBS、HEPES)组合并从流体中分离细胞。根据需要，给定的洗涤方案可以包括一个或多个不同的洗涤步骤。执行任何清洗协议之后，细胞可重新悬浮在合适液体中，例如清洗缓冲液或其他缓冲液。

方法还可以包括在洗涤已裂解的全血之后对第一白细胞组分进行离心。离心可以从细胞部分分离全血的组分，诸如，例如血浆，从而可以收集所分离的组分之一，例如细胞部分。在一些情况下，进行离心，以从全血样品中分离和收集白细胞。可以根据任何方便的方案进行离心。在某些实施例中，第一白细胞组分可以在10至30摄氏度、20至30摄氏度、20至25摄氏度、10至25摄氏度或15至25摄氏度的温度下进行离心。在某些实施例中，可以将第一白细胞组分离心一段时间，范围为1分钟至30分钟，例如1分钟至5分钟或5分钟至10分钟。

方法还可以包括例如在将第一白细胞组分与第二细胞组分以及第三细胞组分进行组合之前，对第一白细胞组分中存在的细胞的量进行定量。第一白细胞组分中存在的细胞(例如白细胞)的量可以为4x10

第二细胞组分可以包括提供造血干/祖细胞的阳性对照标志物的任何细胞群或细胞部分，如上文所详细描述的。在一些情况下，第二细胞组分包括造血干/祖细胞(例如，骨髓细胞、脐带血细胞等)。在一些情况下，方法还包括通过例如从培养的干细胞系获得造血干/祖细胞来产生第二细胞组分。可以根据本领域已知的任何合适的方法来维持培养的干细胞系。造血干/祖细胞可以是来源于任何合适的哺乳动物的细胞，诸如，例如人、非人灵长类动物、鼠类动物或另一种合适的哺乳动物。造血干/祖细胞可以从来源于下列任一种的细胞系获得：胎儿组织、脐带血、骨髓、外周血或动员的外周血；或造血干/祖细胞可以离体来源于其他细胞，诸如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(iPS细胞)或成体多能细胞。在某些实施例中，方法还包括例如在将第二细胞组分与第一白细胞组分或第三细胞组分进行组合之前，对第二细胞组分中存在的细胞的量进行定量。第二细胞组分可以包括的细胞的任何合适的量为4x10

第三细胞组分可以包括提供赘生性细胞的阳性对照标志物的任何细胞群或细胞部分，如上文所详细描述的。在一些情况下，第三细胞组分包括如上文所详细描述的赘生性细胞，诸如，例如淋巴瘤细胞、白血病细胞和/或骨髓瘤细胞。在一些情况下，方法还包括通过例如从培养的赘生性细胞系(例如血液癌细胞系)获得赘生性细胞来产生第三细胞组分。可以根据本领域已知的任何合适的方法来维持培养的赘生性细胞系。赘生性细胞可以是来源于任何合适的哺乳动物的细胞，诸如，例如人、非人灵长类动物、鼠类动物或另一种合适的哺乳动物。在某些实施例中，从来源于外周血、骨髓和淋巴结的细胞系获得赘生性细胞。在某些实施例中，方法还包括例如在产生组合的细胞组合物之前对第二细胞组分中存在的细胞的量进行定量。第三细胞组分可以包括任何合适的细胞的量为4x10

可以通过使各细胞组分彼此接触，来进行第一白细胞组分、第二细胞组分和第三细胞组分的组合。在某些实施例中，可以通过将每种细胞组分引入单个容器(即，同一容器)中来进行第一白细胞组分、第二细胞组分和第三细胞组分的组合。在某些实施例中，将细胞组分进行组合包括在容器中将细胞组分混合或搅拌在一起以形成均匀的混合物。在一些情况下，将细胞组分进行组合，例如混合在一起，持续的时间量为5至20分钟、10至20分钟、10至15分钟或5至10分钟。在某些实施例中，可以在10至30摄氏度、20至30摄氏度、20至25摄氏度、10至25摄氏度或15至25摄氏度的温度下发生组合。

在某些实施例中，方法还包括固定细胞组分以产生对照组合物。可以通过暴露于多种细胞固定剂(即，固定试剂)中的任一种，诸如多聚甲醛、戊二醛、甲醇、丙酮、福尔马林或其任何组合，来固定组合的细胞组合物或第一白细胞组分、第二细胞组分和第三细胞组分中的一种或多种。根据需要，可以采用其它固定剂和固定方法。固定时间可以变化，并且在一些情况下为1分钟至1小时，诸如，例如5分钟至30分钟或30分钟至1小时。发生固定的温度可以变化，并且在一些情况下，温度为-30摄氏度至30摄氏度，诸如15摄氏度至25摄氏度、10摄氏度至20摄氏度、或20摄氏度至25摄氏度。

方法还可以包括洗涤对照组合物。可以在固定之后进行洗涤步骤，例如以便从对照组合物中除去过量的试剂、碎屑和其它组分。可以使用任何方便的方案进行洗涤，诸如通过将对照组合物与合适的洗涤缓冲液(例如PBS、HEPES)组合并从流体中分离细胞。根据需要，给定的洗涤方案可以包括一个或多个不同的洗涤步骤。执行任何清洗协议之后，细胞可重新悬浮在合适液体中，例如清洗缓冲液或其他缓冲液。

在一些情况下，方法还包括根据本文公开的任何方法对对照组合物进行离心。可以在洗涤对照组合物的细胞组分之后进行对照组合物的离心，例如，将组合的细胞组分与过量试剂(例如，洗涤缓冲液)分离。

在一些情况下，方法还包括用缓冲液重建对照组合物。可以在洗涤和离心对照组合物之后重建对照组合物。可以根据任何方便的方案将对照组合物与任何合适的重建剂(诸如，例如干燥基质缓冲液)接触。重组时间不定，在一些情况下，从1分钟到30分钟，例如5分钟到10分钟。重组进行的温度不定，在一些情况下，温度可从0℃到50℃。

在一些情况下，方法还包括对对照组合物中存在的细胞的量进行定量。对照组合物可以包括任何合适数量的细胞。在一些情况下，对照组合物包括的细胞的量为4x10

在一些情况下，方法还包括对对照组合物进行干燥。可以根据任何方便的方案对对照组合物进行干燥，所述方案稳定并允许储存对照组合物而不影响组合物的功能性，例如不破坏对照组合物中存在的标志物。可通过例如空气干燥、冻干、真空浓缩蒸发、氮气吹扫蒸发、加热等对对照组合物进行干燥。干燥时间可以变化，并且在一些情况下为1分钟至30分钟，诸如5分钟至10分钟。发生干燥的温度可以变化，并且在一些情况下，温度可以为0℃至50℃。

本发明的组合物、方法和试剂盒可用于多种不同应用，在这些应用中，需要检测阳性对照中的标志物。此类应用包括流式细胞分析和流式细胞系统、方法和试剂的质量控制。在流式细胞应用中，阳性对照可能有助于标准化用于以下的程序：流式细胞仪设置；测定分析设置；样品制备、染色和采集；和数据分析。例如，对照组合物可以用作流式细胞分析中的阳性对照，其中已知存在于对照组合物中的一种或多种标志物的检测证实了流式细胞检测的性能，例如其中使用的流式细胞方法和系统。对照组合物还可以用作流式细胞分析的一种或多种试剂的阳性对照，诸如，例如缀合至可检测标记的抗体。在一些情况下，合适的应用包括显微术和免疫组织化学。

在某些实施例中，本发明的对照组合物在诊断或基于研究的应用中用作阳性对照。此类应用可以包括例如正常细胞和赘生性细胞的流式细胞免疫分型，诸如，例如骨髓、外周血和/或淋巴结组织中的造血干/祖细胞(例如，淋巴和非淋巴谱系)的正常或赘生性群和/或白细胞群(例如，B细胞、浆细胞、T细胞和NK细胞)。在一些情况下，目的诊断应用包括流式细胞分析，用于鉴定和分类血液学病症以及用于确定个体是否患有血液学病症(诸如，例如白血病或淋巴瘤)。

在一些情况下，本发明的对照组合物用作可由BD OneFlow

本发明还提供了试剂盒。试剂盒包括可用于实施本发明的方法的一种或多种试剂。在某些方面，试剂盒包括容器，该容器包括根据本文所述的任何实施例的对照组合物。

在一些情况下，试剂盒还包括一个或多个容器，该容器包含特异于一种或多种阳性对照标记物的一种或多种结合成分，如上文所详细描述的。一种或多种结合成分可以缀合至可检测标记(例如，荧光标记)。在一些情况下，一种或多种结合成分包括抗体。

一个或多个容器可以包括一种或多种结合成分，其适合于检测目的阳性对照标志物的组合。在一些情况下，在BD OneFlow

在一些情况下，一个或多个容器包括已标记的结合成分，用于骨髓和外周血中造血细胞的赘生性未成熟群(淋巴和非淋巴谱系)的流式细胞免疫分型，以辅助诊断急性成淋巴细胞性白血病和非淋巴急性白血病，例如由BD OneFlow

在一些情况下，一个或多个容器包括已标记的结合成分，用于外周血、骨髓和淋巴结中B、T和NK细胞谱系的正常和赘生性成熟淋巴细胞群的的流式细胞免疫分型，以辅助诊断血液学病症，例如，与BD OneFlow

在一些情况下，一个或多个容器包括外周血和骨髓中的B细胞的已标记的结合成分流式细胞免疫分型，以辅助诊断慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和其它B细胞慢性淋巴组织增生性疾病，例如与BD OneFlow

在一些情况下，一个或多个容器包括已标记的结合成分，用于骨髓中正常多克隆和赘生性浆细胞群的流式细胞免疫分型，以辅助血液学病症的诊断，例如，与BD OneFlow

在一些情况下，一个或多个容器包括已标记的结合成分，用于骨髓中正常多克隆和赘生性浆细胞的流式细胞免疫分型，以辅助多发性骨髓瘤或其他浆细胞病症的诊断，例如与BD OneFlow

试剂盒还可以包括用于进行流式细胞分析的试剂。试剂的实例包括用于可检测分子的重建和稀释中的至少一种的缓冲液、用于使对照组合物或细胞样品与一种或多种结合成分接触的缓冲液、洗涤缓冲液、对照珠、用于流式细胞仪校准的荧光珠及其组合。

上述结合成分和/或试剂可以以液体或干燥(例如，冻干)形式提供。任何上述组分(结合成分和/或试剂)可存在于分开的容器(例如，分开的管、瓶或多孔条或板中的孔)中。此外，一种或多种组分可以组合成单个容器，例如玻璃或塑料小瓶、管或瓶。

除上述组分外，本发明试剂盒还可包括实施本发明方法的说明。这些说明可以多种形式存在于本发明试剂盒中，其中一种或多种可以存在于试剂盒中。这些说明可存在的一种形式是在合适的介质或基底上印刷信息，例如在一张或多张纸上印刷信息，其位于试剂盒的包装中、位于包装插入物中等。还可存在的另一种方式是网址，其可经由因特网使用以在移除站点处存取信息。试剂盒中可以存在任何方便的方式。

提供以下实施例作为说明而非限制。

实施例

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是其发明的范围，也不旨在表示以下实验是全部实验或仅进行的实验。已经努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的精确度，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。

分子和细胞生物化学中的一般方法可以在以下标准教科书中找到：《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》第3版(Sambrook等人，HarborLaboratory出版社2001)；《分子生物学的短方案(Short Protocols in MolecularBiology)》第4版(Ausubel等人编著，John Wiley&Sons 1999)；《蛋白质方法(ProteinMethods)》(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)；《用于基因治疗的非病毒载体(NonviralVectors for Gene Therapy)》(Wagner等人编著，Academic出版社1999)；《病毒载体(ViralVectors)》(Kaplift和Loewy编著，Academic出版社1995)；《免疫学方法手册(ImmunologyMethods Manual)》(I.Lefkovits编著，Academic出版社1997)；以及《细胞和组织培养：生物技术中的实验室过程(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures inBiotechnology)》(Doyle和Griffiths，John Wiley&Sons 1998)，其公开内容在此引入作为参考。本发明中提到的或相关的试剂、克隆载体、细胞以及用于方法的试剂盒可从商业供应商处获得，诸如Biorad、Agilent Technologies、Thermo Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、New England Biolabs(NEB)、美国Takara Bio公司等，以及保藏库，诸如，例如Addgene公司、美国典型培养物保藏中心(ATCC)等。

以下描述提供了一种用于制备基于全血的阳性对照的示例性方法，该阳性对照包括BD OneFlow

1.用1×Pharm Lyse(15min,Rt)裂解5DP；

2.洗涤、旋转并计数细胞；

3.5x10

4.用1％ PFA(60min,RT)固定掺入的和未掺入的白细胞；

5.洗涤、旋转、用1×干燥基质缓冲液重建，然后对细胞进行计数；

6.旋转，然后用4×干燥基质缓冲液重建5.72x10

7.等分并干燥20管2.86x10

尽管附有权利要求书，但本发明也由以下条款定义：

1.一种对照组合物，包含：

第一白细胞组分，其包含白细胞的一种或多种阳性对照标志物；

第二细胞组分，其包含造血干/祖细胞的一种或多种阳性对照标志物；和

第三细胞组分，其包含赘生性细胞的一种或多种阳性对照标志物；

其中所述第一白细胞组分、所述第二细胞组分和所述第三细胞组分被固定。

2.根据条款1的对照组合物，其中，一种或多种阳性对照标志物包含细胞表面标志物。

3.根据条款1至2的对照组合物，其中，一种或多种阳性对照标志物包含细胞内标志物。

4.根据条款1至3中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含50％或更多的选自以下的阳性对照标志物：MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD45、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD20、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。

5.根据条款1至4中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含60％或更多的选自以下的阳性对照标志物：MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD45、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD20、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。

6.根据条款1至5中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含80％或更多的选自以下的阳性对照标志物：MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD45、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD20、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。

7.根据条款1至6中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含以下阳性对照标志物:MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD45、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD20、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。

8.根据条款1至7中任一项的对照组合物，其中，第一白细胞组分包含以下阳性对照标志物:MPO、CD79a、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD20、λ轻链、κ轻链、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、β2-微球蛋白。

9.根据条款1至8中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含以下阳性对照标志物:CD34、CD117、CD105、CD71、TdT。

10.根据条款1至9中任一项的对照组合物，其中，第三细胞组分包含以下阳性对照标志物:CD38、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD56、CD45、CD28、CD27、CD81、CD138。

11.根据条款1至10中任一项的对照组合物，其中，第一白细胞组分包含的细胞的量为2x10

12.根据条款1至11中任一项的对照组合物，其中，第一白细胞组分包含白细胞。

13.根据条款1至12中任一项的对照组合物，其中，将全血与用于裂解红细胞的裂解剂接触，制备第一白细胞组分。

14.根据条款1至13中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含的细胞的量为对照组合物的总细胞的5-10％。

15.根据条款1至14中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含的细胞的量为0.1x10

16.根据条款1至15中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含造血干/祖细胞。

17.根据条款1至16中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含骨髓细胞。

18.根据条款1至16中任一项的对照组合物，其中，第二白细胞组分包含脐带血细胞。

19.根据条款1至18中任一项的对照组合物，其中，第三细胞组分包含的细胞的量为对照组合物中总细胞的5-10％。

20.根据条款1至19中任一项的对照组合物，其中，第三细胞组分包含的细胞的量为0.1x10

21.根据条款1至20中任一项的对照组合物，其中，第三细胞组分包含赘生性细胞。

22.根据条款21的对照组合物，其中，赘生性细胞包含淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。

23.根据条款1至22中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含的细胞的量为2x10

24.根据条款1至23中任一项的对照组合物，其中，对照组合物被干燥。

25.一种方法，包含：

用根据条款1至23中任一项的对照组合物进行流式细胞分析，该流式细胞分析包含：

将对照组合物与特异于一种或多种阳性对照标志物的一种或多种结合成员接触，以产生标记的对照组合物；以及

将所述标记的对照组合物引入流式细胞仪，以产生流式细胞数据，所述流式细胞数据指示是否检测到所述一种或多种阳性对照标志物，

其中指示检测到所述一种或多种阳性标志物的流式细胞数据证实了流式细胞分析以及一种或多种结合成员的功能性。

26.根据条款25的方法，其中，对照组合物被干燥。

27.根据条款26的方法，其中，流式细胞分析还包含用缓冲液重建对照组合物。

28.根据条款25至27中任一项的方法，其中，流式细胞分析还包含将对照组合物与渗透剂接触。

29.根据条款25至28中任一项的方法，其中，一种或多种结合成分缀合至可检测标记。

30.根据条款29的方法，其中，可检测标记包含荧光标记。

31.根据条款25至30中任一项的对照组合物，其中，一种或多种结合成分包含抗体。

32.一种产生对照组合物的方法，所述方法包含：

将第一白细胞组分与第二细胞组分以及第三细胞组分进行组合，以产生组合的细胞组合物，所述第一白细胞组分包含白细胞的一种或多种阳性对照标志物，所述第二细胞组分包含造血干/祖细胞的一种或多种阳性对照标志物，所述第三细胞组分包含赘生性细胞的一种或多种阳性对照标志物；以及

将所述组合的细胞组合物与固定剂接触，以产生对照组合物。

33.根据条款32的方法，其中，方法还包含使一定量的全血与用于裂解红细胞的裂解剂接触，以产生第一白细胞组分。

34.根据条款33的方法，其中，一定量的全血与裂解剂接触的时间为10至20分钟。

35.根据条款33至34中任一项的方法，其中，一定量的全血与裂解剂接触的温度为15至25摄氏度。

36.根据条款33至35中任一项的方法，其中，方法还包含洗涤第一白细胞组分。

37.根据条款36的方法，其中，方法还包含对第一白细胞组分进行离心。

38.根据条款37的方法，其中，方法还包含对第一白细胞组分中存在的细胞的量进行定量。

39.根据条款32至38中任一项的对照组合物，其中，第一白细胞组分包含的细胞的量为4x10

40.根据条款32至39中任一项的对照组合物，其中，第一白细胞组分包含白细胞。

41.根据条款32至40中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含的细胞的量为4x10

42.根据条款32至41中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含造血干/祖细胞。

43.根据条款32至42中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含骨髓细胞。

44.根据条款32至42中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含脐带血细胞。

45.根据条款32至44中任一项的对照组合物，其中，第三细胞组分包含的细胞的量为4x10

46.根据条款32至45中任一项的对照组合物，其中，第三细胞组分包含赘生性细胞。

47.根据条款46的对照组合物，其中，赘生性细胞包含淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。

48.根据条款32至47中任一项的方法，其中，组合的细胞组合物与固定剂接触的时间为30分钟至1.5小时。

49.根据条款32至48中任一项的方法，其中，组合的细胞组合物与固定剂接触的温度为15至25摄氏度。

50.根据条款32至49中任一项的方法，其中，方法还包含洗涤对照组合物。

51.根据条款50的方法，其中，方法还包含对对照组合物进行离心。

52.根据条款51的方法，其中，方法还包含用缓冲液重建对照组合物。

53.根据条款52的方法，其中，方法还包含对对照组合物中存在的细胞的量进行定量。

54.根据条款32至53中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含的细胞的量为4x10

55.根据条款53至54中任一项的方法，其中，方法还包含对对照组合物进行离心。

56.根据条款55的方法，其中，方法还包含用缓冲液重建对照组合物。

57.根据条款56的方法，其中，方法还包含对对照组合物进行干燥。

58.根据条款32至57中任一项的对照组合物，其中，一种或多种阳性对照标志物包含细胞表面标志物。

59.根据条款32至58中任一项的对照组合物，其中，一种或多种阳性对照标志物包含细胞内标志物。

60.根据条款32至59中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含50％或更多的选自以下的阳性对照标志物：MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD45、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD20、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。

61.根据条款32至60中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含60％或更多的选自以下的阳性对照标志物：MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD45、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD20、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。

62.根据条款32至61中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含80％或更多的选自以下的阳性对照标志物：MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD45、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD20、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。

63.根据条款32至62中任一项的对照组合物，其中，对照组合物包含MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3、CD45、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD20、β2-微球蛋白、CD138、CD28、CD27、CD117、CD81、CD71、CD105、TdT。

64.根据条款32至63中任一项的对照组合物，其中，第一白细胞组分包含以下阳性对照标记:MPO、CD79a、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3，CD45、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD4、CD8、CD5、TCRγδ、CD56、β2-微球蛋白、CD138。

65.根据条款32至64中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含以下阳性对照标记:CD34、CD117、CD105、CD71、TdT。

66.根据条款32至65中任一项的对照组合物，其中，第三细胞组分包含以下阳性对照标记:CD38、CD23、CD10、CD79b、CD200、CD43、CD56、CD45、CD28、CD27、CD81、CD138。

67.根据条款32至66中任一项的对照组合物，其中，第二细胞组分包含的细胞的量为对照组合物的总细胞的5-10％。

68.根据条款32至67中任一项的对照组合物，其中，第三细胞组分包含的细胞的量为对照组合物的总细胞的5-10％。

69.一种试剂盒，包含：

容器，其包含根据条款1至24中任一项的对照组合物。

70.根据条款69的试剂盒，其中，试剂盒还包含一个或多个容器，该容器包含特异于一种或多种阳性对照标志物的一种或多种结合成分。

71.根据条款70的试剂盒，其中，一种或多种结合成分缀合至可检测标记。

72.根据条款71的试剂盒，其中，可检测标记包含荧光标记。

73.根据条款70至72中任一项的试剂盒，其中，一种或多种结合成分包含抗体。

74.根据条款69至73中任一项的试剂盒，其中，一个或多个容器包含特异于MPO、CD79a、CD34、CD19、CD7、细胞质Cd3、细胞表面CD3和CD45的结合成分。

75.根据条款69至73中任一项的试剂盒，其中，一个或多个容器包含特异于CD45、CD19、CD20、λ轻链、κ轻链、CD38、CD3、CD4、CD8、CD5、TCRγδ和CD56的结合成分。

76.根据条款69至73中任一项的试剂盒，其中，一个或多个容器包含特异于CD23、CD10、CD79b、CD19、CD200、CD43、CD20和CD45的结合成分。

77.根据条款69至73中任一项的试剂盒，其中，一个或多个容器包含特异于CD38、CD56、β2-微球蛋白、CD19、抗κ、抗λ、CD45和CD138的结合成分。

78.根据条款69至73中任一项的试剂盒，其中，一个或多个容器包含特异于CD38、CD28、CD27、CD19、CD117、CD81、CD45和CD138的结合成员。

79.根据条款69至73中任一项的试剂盒，其中，一个或多个容器包含特异于CD34、CD117、CD71、CD105、TdT和CD138的结合成分。

在至少一些前述实施例中，在一个实施例中使用的一个或多个元件可互换地用于另一实施例中，除非此类替换在技术上不可行。本领域技术人员应当理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其它省略、添加和修改。所有这些修改和变化旨在落入由所附权利要求限定的主题的范围内。

所属领域的技术人员应当了解，通常而言，本文且尤其在所附权利要求书(例如，所附权利要求书的正文)中所使用的术语通常意指作为“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员还将理解，如果所引入的权利要求列举的具体数量是有意图的，则权利要求中将明确地列举此类意图，并且在没有此类列举的情况下，不存在此类意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包含使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”来介绍权利要求叙述。然而，此类短语的使用不应被解释为暗示由不定冠词“一(a)”或“一个(an)”引入的权利要求叙述将含有此类引入的权利要求叙述的任何特定权利要求限制为仅含有一个此类叙述的实施例，即使当同一权利要求包括引言短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词诸如“一(a)”或“一个(an)”时(例如，“一(a)”和/或“一个(an)”应被解释为意指“至少一个”或“一个或多个”)；这同样适用于引入权利要求叙述的明确冠词的使用。此外，即使明确地列举了特定数目的引入的权利要求列举，本领域技术人员将认识到，此类列举应被解释为意指至少所列举的数目(例如，没有其他修饰词的“两个列举”的空白列举意指至少两个列举、或者两个或更多个列举)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常，此类结构旨在本领域技术人员所理解的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、一起的A和B、一起的A和C、一起的B和C、和/或一起的A、B、和C等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的惯例的情况下。通常，此类结构旨在本领域技术人员所理解的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、一起的A和B、一起的A和C、一起的B和C、和/或一起的A、B、和C等的系统)。本领域的技术人员还将进一步理解，无论在说明书、权利要求书还是附图中，实际上呈现两个或更多个替代术语的任何析取性词语和/或短语应被理解为预期可能包括术语中的一个、术语中的任一个或两个术语。例如，短语“A或B”将被理解为可能包括“A”或“B”或“A和B”。

此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也由此根据马库什组的任何单个成员或成员的亚组进行描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，诸如就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以被容易地认为是充分描述和使得相同的范围能够被分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以被容易地分解为下三分之一、中间三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等语言包括所列举的数字，并且是指随后可被分解成如上所述子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1至3个制品的组是指具有1、2或3个制品的组。类似地，具有1至5个制品的组是指具有1、2、3、4或5个制品的组，等等。

尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。

因此，前文仅仅说明了本发明的原理。应当理解，尽管本文并未明确描述或示出，本领域的技术人员将能够设计出各种布置，这些布置体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文所列举的实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理以及发明人为促进本领域所贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体列举的实例和条件。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施例以及其特定实例的陈述旨在涵盖其结构和功能等效物两者。此外，这些等同物旨在包括当前已知的等同物和将来开发的等同物，即，所开发的执行相同功能的任何元件，而与结构无关。此外，本文所公开的任何内容都不旨在专用于公众，而不管此类公开内容是否在权利要求书中明确叙述。

因此，本发明的范围不限于本文所示和所述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求来体现。在权利要求中，35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)被明确定义为仅当在权利要求中此类限制的开始处陈述了确切短语“用于……的装置”或确切短语“用于……的步骤”时才被调用以用于权利要求中的限制；如果此类确切短语不用于权利要求中的限制，则不调用35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)。