一种无需使用有机溶剂的裂殖壶菌脂质提取方法和应用

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，尤其是一种无需使用有机溶剂的裂殖壶菌脂质提取方法和应用。

背景技术

裂殖壶菌（Schiochytrium sp.）是一种海洋异养真核微生物。裂殖壶菌具有生长速度快，可利用廉价碳源等优势，已被广泛用于科学研究和工业化生产。尤其是，裂殖壶菌具有高脂质合成和积累的能力。部分野生型裂殖壶菌，在未经过发酵条件优化或代谢工程改造，其总脂质含量达到细胞干重（DCW）的55%以上。

为了促进经济效益，除了将常用的发酵碳源为葡萄糖，替换为廉价碳源，以降低生产成本；同时，优化发酵条件和利用代谢工程策略提高脂质产量也可以促进裂殖壶菌生产脂质的经济效益。此外，脂质提取也是促进经济效益的关键阶段。有机溶剂，如：甲醇，丙酮，正己烷和氯仿等是常用的微生物提取脂质的有机溶剂。但是这种提取方法不可避免存在有机溶剂残留的问题，这将导致脂质产品在市场应用时具有一定的局限性。

表面活性剂是一类能够使目标溶液表面张力显著下降的物质。表面活性剂含有两种性质的基团：亲水基团和疏水基团，其可与细胞膜相互作用，促进细胞壁破裂，进而促进脂质的提取。

因此，亟需一种或几种相关的新的裂殖壶菌脂质提取方法。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种无需使用有机溶剂的裂殖壶菌脂质提取方法和应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种无需使用有机溶剂的裂殖壶菌脂质提取方法，所述方法包括如下步骤：

（1）从-80℃冰箱取裂殖壶菌保菌管菌液，加入裂殖壶菌种子液培养基中，28℃，170 rpm培养；

（2）裂殖壶菌种子液每隔24 h，转接1 mL菌液至新鲜的种子液培养基中，连续转接两次，获得第三代种子液；

（3）取第三代种子液按1%的接种量接种到裂殖壶菌的发酵培养基中，28℃，170rpm培养5天，收集发酵液；

（4）向发酵液中逐渐加入2 M NaOH至发酵液pH为10-12；

（5）加入质量终浓度为0.3%的破壁酶，在50℃，170 rpm条件下处理4-6 h；

（6）处理后的发酵液进行后续萃取；

（7）将复合表面活性剂替代正己烷添加至发酵液中，混合均匀，8,000 rpm离心5min；

（8）静止4-6 h，待两相分层；

（9）8,000 rpm离心5 min，取上清液；

（10）将上清液旋蒸，挥发有机相；

（11）旋蒸结束后，将旋蒸瓶置于60℃烘箱，烘干，称重，获得总脂质。

进一步地，所述裂殖壶菌为裂殖壶菌HX-308（该菌株为现有技术中的公知菌株，例如在专利公开号CN104974944A中已经公开，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，其保藏编号为CCTCC No.M 209059）。

进一步地，所述种子液培养基为：葡萄糖：40-60 g/L，酵母浸粉：4-6 g/L，硫酸钠：5-8 g/L，硫酸镁：2-4 g/L，硫酸铵：4-8 g/L，氯化钾：1-2 g/L，氯化钙：0.1-0.2 g/L，硫酸钾：0.5-1 g/L，磷酸二氢钾：0.5-2 g/L，谷氨酸钠：8-12g/L，七水合硫酸锌：1-5 mg/L，六水合氯化钴：0.01-0.1 mg/L，五水合硫酸铜：2-6 mg/L，六水合硫酸镍：1-2 mg/L，七水合硫酸铁：8-15 mg/L，泛酸钙：2-4 mg/L，四水合氯化锰：3-5 mg/L，二水合钼酸钠：0.02-0.04 mg/L。

发酵培养基为：葡萄糖：60-100 g/L，酵母浸粉：5-15 g/L，硫酸钠：5-12 g/L，硫酸镁：2-4 g/L，硫酸铵：4-8 g/L，氯化钾：1-2 g/L，氯化钙：0.1-0.2 g/L，硫酸钾：0.5-1 g/L，磷酸二氢钾：0.5-2 g/L，谷氨酸钠：15-20 g/L，七水合硫酸锌：1-5 mg/L，六水合氯化钴：0.01-0.1 mg/L，五水合硫酸铜：2-6 mg/L，六水合硫酸镍：1-2 mg/L，七水合硫酸铁：8-15mg/L，泛酸钙：2-4 mg/L，四水合氯化锰：3-5 mg/L，二水合钼酸钠：0.02-0.04 mg/L，维生素B

进一步地，每升发酵液能够获得69.87±1.75 g的总脂质。

进一步地，所述复合表面活性剂由十二烷基苯磺酸钠、甜菜碱和吐温80组成。

进一步地，所述十二烷基苯磺酸钠在发酵液中的添加终浓度为70 mg/L，甜菜碱在发酵液中的添加终浓度为80 mg/L，吐温80在发酵液中的添加终浓度为3 mL/L。

如上所述的裂殖壶菌脂质提取方法在裂殖壶菌脂质提取方面中的应用。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明方法在脂质提取过程中，将有机溶剂正己烷更换为一种复合表面活性剂，促进了脂质提取。本发明方法优化了裂殖壶菌脂质提取工艺，在脂质提取过程中，避免了有机溶剂的加入，提高了脂质安全性，扩展了脂质产品的市场应用范围，同时，本发明操作简便易行，具有较强的普适应。

2、本发明方法中使用了复合表面活性剂，复合表面活性剂配方包括三组组分，十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、甜菜碱和吐温80；其中SDBS是一种阴离子表面活性剂，甜菜碱是一种两性离子表面活性剂，吐温80是一种非离子表面活性剂。这三种表面活性剂均来源广泛，且使用复合表面活性剂进行脂质提取的效果优于正己烷（有机溶剂）脂质提取的效果。同时，避免了脂质生产过程中有机溶剂残留的问题，扩展了脂质产品在市场中的应用。

3、本发明采用裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）HX-308为原始菌株。HX-308发酵培养5天，获得发酵液。通过将萃取剂正己烷替换为表面活性剂，优化了裂殖壶菌油脂提取工艺。借助单因素试验，正交试验等优化试验确定了最优复合表面活性剂配方为：SDBS在发酵液中的添加量为70 mg/L，甜菜碱在发酵液中的添加量为：80 mg/L，吐温80在发酵液中的添加量为：3 mL/L），每升发酵液可获得69.87±1.75 g的脂质。

4、本发明进行了三组分协同作用试验，验证了复合表面活性剂三种组分十二烷基苯磺酸钠、甜菜碱和吐温80之间存在协同作用，三者十二烷基苯磺酸钠、甜菜碱和吐温80能够协同提高裂殖壶菌脂质的提取量。本发明优化了裂殖壶菌脂质提取工艺，避免了有机溶剂残留问题，扩展了脂质产品在市场中的应用。

5、本发明在裂殖壶菌脂质提取过程中使用复合表面活性剂替换传统脂质提取时使用的正己烷，实现提取的脂质含量由52.73±2.70 g/L增加至69.87±1.75 g/L。同时本研究有效避免了脂质生产过程中有机试剂的残留，扩大了脂质产品的市场应用。

附图说明

图1为本发明中十二烷基苯磺酸钠（SDBS）的不同添加量对油脂提取的影响图；

图2为本发明中甜菜碱的不同添加量对油脂提取的影响图；

图3为本发明中吐温80的不同添加量对油脂提取的影响图；

图4为本发明中不同复合表面活性剂对油脂提取的影响图；

图5为本发明中验证表面活性剂的三种组分SDBS、甜菜碱、吐温80是否存在协同作用的结果图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

一种无需使用有机溶剂的裂殖壶菌脂质提取方法，所述方法包括如下步骤：

（1）从-80℃冰箱取裂殖壶菌保菌管菌液，加入裂殖壶菌种子液培养基中，28℃，170 rpm培养；

（2）裂殖壶菌种子液每隔24 h，转接1 mL菌液至新鲜的种子液培养基中，连续转接两次，获得第三代种子液；

（3）取第三代种子液按1%的接种量接种到裂殖壶菌的发酵培养基中，28℃，170rpm培养5天，收集发酵液；

（4）向发酵液中逐渐加入2 M NaOH至发酵液pH为10-12；

（5）加入质量终浓度为0.3%的破壁酶，在50℃，170 rpm条件下处理4-6 h；

（6）处理后的发酵液进行后续萃取；

（7）将复合表面活性剂替代正己烷添加至发酵液中，混合均匀，8,000 rpm离心5min；

（8）静止4-6 h，待两相分层；

（9）8,000 rpm离心5 min，取上清液；

（10）将上清液旋蒸，挥发有机相；

（11）旋蒸结束后，将旋蒸瓶置于60℃烘箱，烘干，称重，获得总脂质。

较优地，所述裂殖壶菌为裂殖壶菌HX-308（该菌株为现有技术中的公知菌株，例如在专利公开号CN104974944A中已经公开，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，其保藏编号为CCTCC No.M 209059）。

较优地，所述种子液培养基为：葡萄糖：40-60 g/L，酵母浸粉：4-6 g/L，硫酸钠：5-8 g/L，硫酸镁：2-4 g/L，硫酸铵：4-8 g/L，氯化钾：1-2 g/L，氯化钙：0.1-0.2 g/L，硫酸钾：0.5-1 g/L，磷酸二氢钾：0.5-2 g/L，谷氨酸钠：8-12g/L，七水合硫酸锌：1-5 mg/L，六水合氯化钴：0.01-0.1 mg/L，五水合硫酸铜：2-6 mg/L，六水合硫酸镍：1-2 mg/L，七水合硫酸铁：8-15 mg/L，泛酸钙：2-4 mg/L，四水合氯化锰：3-5 mg/L，二水合钼酸钠：0.02-0.04 mg/L。

发酵培养基为：葡萄糖：60-100 g/L，酵母浸粉：5-15 g/L，硫酸钠：5-12 g/L，硫酸镁：2-4 g/L，硫酸铵：4-8 g/L，氯化钾：1-2 g/L，氯化钙：0.1-0.2 g/L，硫酸钾：0.5-1 g/L，磷酸二氢钾：0.5-2 g/L，谷氨酸钠：15-20 g/L，七水合硫酸锌：1-5 mg/L，六水合氯化钴：0.01-0.1 mg/L，五水合硫酸铜：2-6 mg/L，六水合硫酸镍：1-2 mg/L，七水合硫酸铁：8-15mg/L，泛酸钙：2-4 mg/L，四水合氯化锰：3-5 mg/L，二水合钼酸钠：0.02-0.04 mg/L，维生素B

较优地，每升发酵液能够获得69.87±1.75 g的总脂质。

较优地，所述复合表面活性剂由十二烷基苯磺酸钠、甜菜碱和吐温80组成。

较优地，所述十二烷基苯磺酸钠在发酵液中的添加终浓度为70 mg/L，甜菜碱在发酵液中的添加终浓度为80 mg/L，吐温80在发酵液中的添加终浓度为3 mL/L。

如上所述的裂殖壶菌脂质提取方法在裂殖壶菌脂质提取方面中的应用。

具体地，相关的制备及检测如下：

下述各实施例中采用的培养基如下：

种子液培养基：葡萄糖：40-60 g/L，酵母浸粉：4-6 g/L，硫酸钠：5-8 g/L，硫酸镁：2-4 g/L，硫酸铵：4-8 g/L，氯化钾：1-2 g/L，氯化钙：0.1-0.2 g/L，硫酸钾：0.5-1 g/L，磷酸二氢钾：0.5-2 g/L，谷氨酸钠：8-12 g/L，七水合硫酸锌：1-5 mg/L，六水合氯化钴：0.01-0.1 mg/L，五水合硫酸铜：2-6 mg/L，六水合硫酸镍：1-2 mg/L，七水合硫酸铁：8-15 mg/L，泛酸钙：2-4 mg/L，四水合氯化锰：3-5 mg/L，二水合钼酸钠：0.02-0.04 mg/L。

发酵培养基：葡萄糖：60-100 g/L，酵母浸粉：5-15 g/L，硫酸钠：5-12 g/L，硫酸镁：2-4 g/L，硫酸铵：4-8 g/L，氯化钾：1-2 g/L，氯化钙：0.1-0.2 g/L，硫酸钾：0.5-1 g/L，磷酸二氢钾：0.5-2 g/L，谷氨酸钠：15-20 g/L，七水合硫酸锌：1-5 mg/L，六水合氯化钴：0.01-0.1 mg/L，五水合硫酸铜：2-6 mg/L，六水合硫酸镍：1-2 mg/L，七水合硫酸铁：8-15mg/L，泛酸钙：2-4 mg/L，四水合氯化锰：3-5 mg/L，二水合钼酸钠：0.02-0.04 mg/L，维生素B

本发明以裂殖壶菌生物合成的脂质为研究对象。在脂质提取过程中，将萃取剂正己烷更换为一种复合的表面活性剂。不仅促进了脂质的提取，而且避免在脂质提取过程中有机溶剂的残留。本发明首先通过单因素试验，分别确定了十二烷基苯磺酸钠（SDBS），甜菜碱和吐温80的最优添加量；进一步通过正交试验确定了复合表面活性剂最优配比。此外，本发明还进行了协同效应试验，确定了三种表面活性剂具有协同增效的作用。

本发明设计并实施单因素试验。在脂质提取过程中，对照试验为用正己烷提取脂质，试验组1是将正己烷替换为SDBS，分别添加30 mg/L，40 mg/L，50 mg/L，60 mg/L，70 mg/L，80 mg/L；试验组2是将正己烷替换为甜菜碱，分别添加30 mg/L，40 mg/L，50 mg/L，60mg/L，70 mg/L，80 mg/L；试验组3是将正己烷替换为吐温80，分别添加1 mL，2 mL，3 mL，4mL，5 mL，6 mL。随后进行发酵液萃取，并测定脂质含量。

本发明设计并实施正交试验。根据单因素试验结果，确定正交试验的三因素和三水平（SDBS添加量分别为：50 mg/L，60 mg/L，70 mg/L；甜菜碱添加量分别为：60 mg/L，70mg/L，80 mg/L；吐温80添加量分别为：2 mL，3 mL，4 mL）。随后进行发酵液提取脂质，并测定脂质含量。

本发明设计并实施协同效应试验。根据正交试验结果，确定促进脂质提取的最优复合表面活性剂配比。进一步利用协同效应试验，验证三组组分是否存在协同效果。实施例1为在脂质提取过程中添加最优复合表面活性剂；对比例1为仅添加甜菜碱和吐温80；对比例2为仅添加SDBS和吐温80；对比例3为仅添加SDBS和甜菜碱。随后进行发酵液萃取，并测定脂质含量。

具体的制备如下：

实施例1

单因素试验，确定SDBS三组最优添加量。

一种无需使用有机溶剂的裂殖壶菌脂质提取方法，所述方法包括如下步骤：

（1）从-80℃冰箱取一管HX-308保菌管菌液，加入50 mL裂殖壶菌种子液培养基，28℃，170 rpm培养；

（2）裂殖壶菌种子液每隔24 h，转接1 mL至新鲜的培养基，连续转接两次，获得第三代种子液；

（3）取第三代种子液1 mL于100 mL裂殖壶菌发酵培养基，相同的培养条件，培养5天，收集发酵液。

（4）收集发酵液，向发酵液中逐渐加入2 M NaOH至发酵液pH = 10-12。

（5）加入质量终浓度为0.3%破壁酶，在50℃，170 rpm条件下处理4-6 h；

（6）处理后的发酵液平分为10 mL/份；进行后续萃取；

（7）对照组按照发酵液和正己烷体积比为1：1的添加量向发酵液中添加正己烷；试验组将正己烷替代为不同浓度的SDBS分别添加至发酵液中。混合均匀，离心（8,000 rpm，5min）；

（8）静止4-6 h，待两相分层；

（9）离心（8,000 rpm，5 min），取上清液；

（10）将上清液旋蒸，挥发有机相；

（11）旋蒸结束后将，旋蒸瓶至于60℃烘箱，烘干，称重，获得总脂质。结果如图1所示。SDBS添加量为50 mg/L，60 mg/L和70 mg/L时，相同体积的发酵液脂质含量较高。

实施例2

单因素试验，确定甜菜碱三组最优添加量。

裂殖壶菌发酵条件及脂质提取步骤同实施例1。不同之处在于，在萃取过程中将萃取剂正己烷，更换为不同浓度的甜菜碱表面活性剂。结果如图2所示。甜菜碱添加量为60mg/L，70 mg/L和80 mg/L时，相同体积的发酵液脂质含量较高。

实施例3

单因素试验，确定吐温80三组最优添加量。裂殖壶菌发酵条件及脂质提取步骤同实施例1。不同之处在于，在萃取过程中将萃取剂正己烷，更换为不同添加量的吐温80表面活性剂。结果如图3所示。吐温80添加量为2 ml/L，3 ml/L和4 ml/L时，相同体积的发酵液脂质含量较高。

实施例4

设计并实施正交试验。根据单因素试验，确定了三因素三水平，如表1所示。

设计正交试验，如表2所示。

其中，正交试验的对照组的萃取剂为正己烷。按照实施1裂殖壶菌发酵及脂质提取试验步骤，测定脂质含量。结果如图4所示。SDBS添加量为70 mg/L，甜菜碱添加量为80 mg/L，吐温80添加量为3 mL/L时，相同体积的发酵液脂质含量最高，为69.87±1.75 g/L。

实施例5

为了验证复合表面活性剂的三种组分十二烷基苯磺酸钠、甜菜碱和吐温80是否存在协同增效作用，设计协同试验，如下：裂殖壶菌发酵条件及脂质提取步骤同实施例1。不同之处在于，在萃取过程中将正己烷更换为本发明筛选获得的最优复合表面活性剂（SDBS：70mg/L，甜菜碱：80 mg/L，吐温80：3 mL/L，上述添加量均为在发酵液中的添加量），对比例1、对比例2、对比例3的其余条件均同实施例1，测定脂质含量。

对比例1

裂殖壶菌发酵条件及脂质提取步骤同实施例1。不同之处在于：在萃取过程中将正己烷，更换为本发明筛选获得的最优复合表面活性剂中的两种组分：甜菜碱（80 mg/L）和吐温80（3 mL/L），上述添加量均为在发酵液中的添加量，提取脂质，测定脂质含量。

对比例2

裂殖壶菌发酵条件及脂质提取步骤同实施例1。不同之处在于：在萃取过程中将正己烷，更换为本发明筛选获得的最优复合表面活性剂中的两种组分：SDBS（70 mg/L）和吐温80（3 mL/L），上述添加量均为在发酵液中的添加量，提取脂质，测定脂质含量。

对比例3

裂殖壶菌发酵条件及脂质提取步骤同实施例1。不同之处在于：在萃取过程中将正己烷，更换为本发明筛选获得的最优复合表面活性剂中的两种组分SDBS（70 mg/L）和甜菜碱（80 mg/L），上述添加量均为在发酵液中的添加量，提取脂质，测定脂质含量。

结果如图5所示，在裂殖壶菌脂质提取过程中。同时添加三种组分时，相同体积的发酵液脂质含量最高，为69.87±1.75 g/L；而三个对比例试验中获得的脂质滴度分别为：62.43±0.49 g/L，66.20±1.01 g/L和65.80±1.13 g/L。即证明三种组分存在协同增效的作用。由此可以看出，在裂殖壶菌脂质提取时在发酵液中的同时添加70 mg/L十二烷基苯磺酸钠、80 mg/L甜菜碱、3 mL/L吐温80三者之间具有协同作用，能够协同增效提高裂殖壶菌脂质的提取量。

本发明通过单因素试验和正交试验相结合的方式，筛选获得一种复合表面活性剂促进脂质提取的配方，实现提取的脂质含量由52.73±2.70 g/L增加至69.87±1.75 g/L。最优复合表面活性剂的配方为：SDBS（70 mg/L），甜菜碱（80 mg/L），吐温80（3 mL/L）。本发明优化了脂质提取工艺，将脂质提取过程中有机溶剂正己烷更换为表面活性剂，避免了提取过程中有机溶剂的残留。本发明提供了一种有效促进脂质提取的策略，筛选获得了一种复合表面活性剂促进脂质提取的配方，扩展了脂质产品在市场中的应用。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。