一种苦杏仁冷榨结合水酶法提油的工艺

技术领域

本发明属于植物油提取工艺技术领域，具体涉及一种苦杏仁冷榨结合水酶法提油的工艺。

背景技术

苦杏仁为蔷薇科植物山杏、西伯利亚杏、东北杏或杏的干燥成熟种仁。苦杏仁中脂肪和蛋白质的含量分别约为50％和27％；此外，苦杏仁还含有总糖约4.1％和苦杏仁苷约3％。苦杏仁油中95％以上是亚麻酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，是一种很好的保健食用油。苦杏仁蛋白中含有17种氨基酸，种类齐全，含量丰富，其中8种人体必需氨基酸占总氨基酸的28.37％，接近国际参考模式(FAO/WHO)。苦杏仁是一种有利于人体氨基酸营养平衡及保健作用的天然干果资源。但由于其含有苦杏仁苷具有毒副作用，导致苦杏仁没有得到丰富开发利用。因此，若是将苦杏仁中的油脂和蛋白质这两种主要成分分别进行提取，则可提升苦杏仁的综合利用价值。

目前，苦杏仁提油采用的传统工艺主要包括高温压榨法和有机溶剂浸提法，新工艺主要是冷榨法和水酶法。高温压榨法出油率较高，但因在高温条件下进行，存在机械设备复杂、耗能大、饼粕中蛋白质严重变性的情况，致使油料综合利用率低；有机溶剂浸出法出油率较高，但提取时间长，有机溶剂消耗量大，有机溶剂残留，破坏油脂风味，污染环境，存在危害人体健康的安全风险，而且饼粕中蛋白严重变性，生物利用度低，易造成资源浪费。

新工艺中冷榨法提油率较低，但在中低温条件下进行，耗能较低且饼粕中蛋白质会发生一定程度的变性；水酶法虽是以水为溶剂，绿色无污染，但单纯靠酶解法提油的话，酶解反应使用蛋白酶会水解苦杏仁蛋白，致使蛋白质变性严重。所以，目前苦杏仁提油采用的新工艺中的冷榨法和水酶法在进行苦杏仁提油时，均会影响苦杏仁中的蛋白质。

因此，以解决影响苦杏仁中的油脂和蛋白质为目的，探寻一种既可保证苦杏仁较高的提油率，又可以对减少苦杏仁中蛋白质的变性程度的新工艺是目前研发人员亟待解决的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种苦杏仁冷榨结合水酶法提油的工艺，要解决是对现有苦杏仁提油工艺存在不能兼顾苦杏仁的高的提油率和减少的蛋白质变性成都的问题，旨在提出一种新型的苦杏仁的提油工艺，以期为拓宽苦杏仁产品的应用领域和推动苦杏仁资源的增值利用提供试验依据和技术参考。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的一种苦杏仁冷榨结合水酶法提油的工艺，包括以下步骤：

S1、苦杏仁脱皮处理；

S2、冷榨法提油：将经脱皮处理后的苦杏仁预热至52℃～70℃，榨取粗油，离心、除杂，分别收集粗油和冷榨粕，粗油离心除杂取上层清油；

S3、水酶法酶解：冷榨粕经干燥、粉碎后，装入酶反应器中，加去离子水，调节pH，加入酶制剂，进行酶解反应，酶解结束后冷却、离心，吸取并收集上层清油；所述酶制剂采用非蛋白酶复合酶；

S4、乳化层破乳：将S3所得乳状液冷冻，解冻后破乳、离心，取上层清油，将其与S3中所得清油合并，得到苦杏仁冷榨结合水酶法提取的油。

优选的，S1中，苦杏仁脱皮处理方法如下：

将苦杏仁放入沸水煮3～5mn，捞出，控水，脱皮，烘干，烘干后从中挑选完好无损的苦杏仁。

优选的，所述烘干条件为：50℃烘干至水份≤5％。

优选的，S2中，所述榨取粗油的温度设定为60℃。

优选的，S3中，所述酶制剂为果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、糖化酶、α-淀粉酶5种酶中任意两种或者三种复配使用。

优选的，酶制剂选用α-淀粉酶、糖化酶、半纤维素酶按照1:1:1的质量比例复配。

优选的，酶解反应的工艺条件为：酶解温度50～60℃、酶解pH5.5～6.5、用的酶的质量占苦杏仁粕质量的2.0～3.0％、酶解时间2.0～3.0h。

优选的，酶解反应的最佳工艺条件为：酶解温度55℃、酶解pH6.0、加酶量2.5％、酶解时间2.6h。

优选的，S4中，所述乳状液的冷冻条件为：于-20℃、冷冻18h。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明以苦杏仁为原料，采用冷榨结合水酶法对苦杏仁提油，提出了一种新型的苦杏仁提油的工艺，使用该工艺对苦杏仁进行提油时，可以同时兼顾苦杏仁中的油脂和蛋白质的得率和品质，该工艺根据扬长避短、绿色高效的原则，将冷榨法和水酶法两种工艺的优点结合起来，低温压榨法在基本保持天然蛋白特性的基础上快速提取部分油脂，后续基于复合非蛋白酶的水酶法提取粕中残油，则可在极大程度上提取油脂的同时降低蛋白质变性度。

同时，在此提油工艺的基础上，为尽可能降低蛋白质变性度，从五种非蛋白酶中筛选三种酶作为复合酶。探究了酶解温度、酶解pH、加酶量、酶解时间对苦杏仁提油率的影响，然后运用响应面试验优化工艺参数，对比不同提油方法对苦杏仁蛋白氨基酸组成、分子量分布、结构特性、表面微观形态的影响。可以为拓宽苦杏仁产品的应用领域和推动苦杏仁资源的增值利用提供试验依据和技术参考。

附图说明

图1为本发明提出的苦杏仁提油工艺优化中不同非蛋白酶酶制剂对苦杏仁粕提油率的影响；不同小写字母表示显著性差异，p<0.05。

图2为本发明提出的苦杏仁提油工艺优化中酶解温度(A)、酶解pH(B)、加酶量(C)和酶解时间(D)对苦杏仁粕提油率的影响；不同小写字母表示显著性差异，p<0.05。

图3为本发明提出的苦杏仁提油工艺优化中酶解温度(A)与酶解pH(B)对苦杏仁粕总提油率的影响。

图4为本发明提出的苦杏仁提油工艺优化中酶解温度(A)与加酶量(B)对苦杏仁粕总提油率的影响。

图5为本发明提出的苦杏仁提油工艺优化中酶解温度(A)与酶解时间(B)对苦杏仁粕总提油率的影响。

图6为本发明提出的苦杏仁提油工艺优化中酶解pH(A)与加酶量(B)对苦杏仁粕总提油率的影响。

图7为本发明提出的苦杏仁提油工艺优化中酶解pH(A)与酶解时间(B)对苦杏仁粕总提油率的影响。

图8为本发明提出的苦杏仁提油工艺优化中加酶量(A)与酶解时间(B)对苦杏仁粕总提油率的影响。

图9为本发明提出的苦杏仁不同提油方法的苦杏仁蛋白的SDS-PAGE电泳图谱；1：未提油蛋白；2：冷榨法提油蛋白；3：冷榨结合水酶法提油蛋白；M：Marker。

图10为本发明提出的苦杏仁不同提油方法的苦杏仁蛋白红外光谱图(A)与荧光光谱图(B)。

图11为本发明提出的苦杏仁不同提油方法的苦杏仁蛋白的冷场发射扫描电子显微镜图；A1-A3分别为未提油蛋白100×、500×和1000×；B1-B3分别为冷榨法提油蛋白100×、500×和1000×；C1-C3分别为冷榨结合水酶法提油蛋白100×、500×和1000×。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中所用到的材料与试剂如下：

苦杏仁：河北蔚县丰润农产品加工有限公司；半纤维素酶(1500U/g)、α-淀粉酶(3700U/g)、糖化酶(100000U/g)、果胶酶(40000U/g)、纤维素酶(3000U/g)：北京索莱宝科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、石油醚、乙醇、溴化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：国药集团化学试剂有限公司。

本发明实施例中所用到的仪器与设备如下：

S9S商用智能榨油机：东莞香聚智能有限公司；L580低速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；ST3100PH计、e-G51HS07C加热磁力搅拌器：奥豪斯仪器(常州)有限公司；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；RJ-TGL-16G-Ⅱ型高速台式离心机：无锡市瑞江分析仪器有限公司；真空冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；K1100全自动凯氏定氮仪：山东海能科学仪器有限公司；Agilent1100高效液相色谱系统：美国安捷伦公司；F-7000型荧光分光光度计：日立HITACHI公司；SU8100冷场发射扫描电子显微镜：日本株式会社日立高新技术；IS10傅里叶红外光谱仪：美国Nicolet公司。

结合具体实施例，对本发明做进一步的阐述。

实施例1

一种苦杏仁冷榨结合水酶法提油的工艺，包括以下步骤：

S1、苦杏仁脱皮处理：将10kg苦杏仁放入沸水中4min，然后迅速捞出，将水控净放入脱皮机中进行脱皮，将苦杏仁放入50℃烘箱中烘干至水份5％(以重量计)，然后手工挑选未脱掉皮和损坏霉变的苦杏仁，得到完好无损的苦杏仁，备用；

S2、冷榨法提油：将脱皮苦杏仁在烘箱中预热至60℃，设置榨油机温度60℃、螺杆转速30r/min榨取粗油，离心除杂，分别收集粗油和冷榨粕，将粗油称重，计算冷榨法提油率；

S3、水酶法酶解：上述冷榨粕依次经干燥、粉碎至60目细度后，装入酶反应器中，按料液比1:4的比例加蒸馏水，调节pH6.0，加入2.5％酶制剂(与苦杏仁粕的质量比)，混匀后于55℃酶解2.6h，结束后冷却，于4000r/min离心20min，吸取并收集上层清油，称其质量，并记为清油1，计算苦杏仁粕水酶法清油提取率，下层剩余部分称为乳状液和渣相，所述酶制剂采用的酶制剂为：半纤维素酶、糖化酶、α-淀粉酶3种酶，它们按照1:1:1的质量比例复配；

S4、乳化层破乳：将S3所得乳状液于-20℃冷冻18h，然后于50℃解冻破乳2h，解冻后将乳状液4000r/min离心20min，取上层清油，称其重量，并记为清油2，将其与清油1合并并称重，计算苦杏仁粕水酶法总油提取率。

计算公式如下：

本实施例中所得到的苦杏仁的冷榨法提油率为36.14％，苦杏仁粕水酶法清油提取率为52.98％，苦杏仁粕水酶法总油提取率为73.46％，苦杏仁冷榨结合水酶法提油率为84.24％。

实施例2

一种苦杏仁冷榨结合水酶法提油的工艺，包括以下步骤：

S1、苦杏仁脱皮处理：将10kg苦杏仁放入沸水中4min，然后迅速捞出，将水控净放入脱皮机中进行脱皮，将苦杏仁放入45℃烘箱中烘干至水份5％(以重量计)，然后手工挑选未脱掉皮和损坏霉变的苦杏仁，得到完好无损的苦杏仁，备用；

S2、冷榨法提油：将脱皮苦杏仁在烘箱中预热至58℃，设置榨油机温度60℃、螺杆转速30r/min榨取粗油，离心除杂，分别收集粗油和冷榨粕，将粗油称重，计算冷榨法提油率；

S3、水酶法酶解：上述冷榨粕依次经干燥、粉碎至60目细度后，装入酶反应器中，按料液比1:4的比例加蒸馏水，调节pH5.8，加入2.5％酶制剂(与苦杏仁粕的质量比)，混匀后于55℃酶解2.6h，结束后冷却，于4000r/min离心20min，吸取并收集上层清油，称其质量，并记为清油1，计算苦杏仁粕水酶法清油提取率，下层剩余部分称为乳状液和渣相，所述酶制剂采用的酶制剂为：果胶酶和半纤维素酶2种酶，它们按照1:1的质量比例复配；

S4、乳化层破乳：将S3所得乳状液于-20℃冷冻18h，然后于50℃解冻破乳2h，解冻后将乳状液4000r/min离心20min，取上层清油，称其重量，并记为清油2，将其与清油1合并并称重，计算苦杏仁粕水酶法总油提取率。

计算公式同实施例1。

本实施例中所得到的苦杏仁的冷榨法提油率为36.05％，苦杏仁粕水酶法清油提取率为52.75％，苦杏仁粕水酶法总油提取率为73.18％，苦杏仁冷榨结合水酶法提油率为83.97％。

实施例3

一种苦杏仁冷榨结合水酶法提油的工艺，包括以下步骤：

S1、苦杏仁脱皮处理：将10kg苦杏仁放入沸水中4min，然后迅速捞出，将水控净放入脱皮机中进行脱皮，将苦杏仁放入50℃烘箱中烘干至水份5％(以重量计)，然后手工挑选未脱掉皮和损坏霉变的苦杏仁，得到完好无损的苦杏仁，备用；

S2、冷榨法提油：将脱皮苦杏仁在烘箱中预热至62℃，设置榨油机温度60℃、螺杆转速30r/min榨取粗油，离心除杂，分别收集粗油和冷榨粕，将粗油称重，计算冷榨法提油率；

S3、水酶法酶解：上述冷榨粕依次经干燥、粉碎至60目细度后，装入酶反应器中，按料液比1:4的比例加蒸馏水，调节pH6.0，加入2.5％酶制剂(与苦杏仁粕的质量比)，混匀后于55℃酶解2.5h，结束后冷却，于4000r/min离心20min，吸取并收集上层清油，称其质量，并记为清油1，计算苦杏仁粕水酶法清油提取率，下层剩余部分称为乳状液和渣相，所述酶制剂采用的酶制剂为；半纤维素酶、糖化酶、α-淀粉酶3种酶，它们按照1:1:1的质量比例复配；

S4、乳化层破乳：将S3所得乳状液于-20℃冷冻18h，然后于50℃解冻破乳2h，解冻后将乳状液4000r/min离心20min，取上层清油，称其重量，并记为清油2，将其与清油1合并并称重，计算苦杏仁粕水酶法总油提取率。

计算公式同实施例1。

本实施例中所得到的苦杏仁的冷榨法提油率为36.19％，苦杏仁粕水酶法清油提取率为52.91％，苦杏仁粕水酶法总油提取率为73.35％，苦杏仁冷榨结合水酶法提油率为84.22％。

对比例1

一种仅采用冷榨法对苦杏仁提油，包括以下步骤：

(1)苦杏仁脱皮处理：将5kg苦杏仁放入沸水中4min，然后迅速捞出，将水控净放入脱皮机中进行脱皮，将苦杏仁放入50℃烘箱中烘干至水份5％(以重量计)，然后手工挑选未脱掉皮和损坏霉变的苦杏仁，得到完好无损的苦杏仁，备用；

(2)冷榨法提油：将脱皮苦杏仁在烘箱中预热至50℃，设置榨油机温度50℃、螺杆转速30r/min榨取粗油，离心除杂，收集粗油，将粗油称重，计算其提油率。

计算公式为：

本对比例中所得到的苦杏仁的提油率为22.76％。

对比例2

一种仅采用水酶法对苦杏仁提油，包括以下步骤：

(1)苦杏仁脱皮处理：将5kg苦杏仁放入沸水中4min，然后迅速捞出，将水控净放入脱皮机中进行脱皮，将苦杏仁放入50℃烘箱中烘干至水份5％(以重量计)，然后手工挑选未脱掉皮和损坏霉变的苦杏仁，得到完好无损的苦杏仁，备用；

(2)水酶法酶解：将脱皮苦杏仁依次经干燥、粉碎至60目细度后，装入酶反应器中，按料液比1:4的比例加蒸馏水，调节pH4.8，加入2.5％纤维素酶(与苦杏仁粕的质量比)，混匀后于50℃酶解2.5h，结束后冷却，于4000r/min离心20min，吸取并收集上层清油，称其质量，计算其提油率。

计算公式为：

本对比例中所得到的苦杏仁的提油率为29.48％。

对比例3

一种仅采用水酶法对苦杏仁提油，包括以下步骤：

(1)苦杏仁脱皮处理：将5kg苦杏仁放入沸水中4min，然后迅速捞出，将水控净放入脱皮机中进行脱皮，将苦杏仁放入50℃烘箱中烘干至水份5％(以重量计)，然后手工挑选未脱掉皮和损坏霉变的苦杏仁，得到完好无损的苦杏仁，备用；

(2)水酶法酶解：将脱皮苦杏仁依次经干燥、粉碎至60目细度后，装入酶反应器中，按料液比1:4的比例加蒸馏水，调节pH7.5，加入4％中性蛋白酶(与苦杏仁粕的质量比)，混匀后于45℃酶解4h，酶解结束后于95℃水浴灭酶10min，冷却至室温，于4000r/min离心20min，吸取并收集上层清油，称其质量，计算其提油率。

计算公式为：

本对比例中所得到的苦杏仁的提油率为36.25％。

通过实施例1～3以及对比例1～3的结果对比，实施例1～3所得的苦杏仁的提油率分别为84.24％、83.97％、84.22％，对比例1采用冷榨法提油所得的苦杏仁的提油率为22.76％，对比例2采用非蛋白酶水酶法提油所得的苦杏仁的提油率为29.48％，对比例3采用蛋白酶水酶法提油所得的苦杏仁的提油率为36.25％。数据结果表明，本发明所提出的一种新型的苦杏仁提油工艺所得的油脂得率高于冷榨法提油、果胶酶水酶法提油、碱性蛋白酶水酶法提油。

在实施例1～3的基础上，本发明为尽可能降低蛋白质变性度，从五种非蛋白酶中筛选三种酶作为复合酶。同时，本发明还探究了酶解温度、酶解pH、加酶量、酶解时间对苦杏仁提油率的影响，然后运用响应面试验优化工艺参数，对比不同提油方法对苦杏仁蛋白氨基酸组成、分子量分布、结构特性、表面微观形态的影响，具体研究如下：

实验1酶的筛选

称取10g经冷榨法提油后的苦杏仁粕，分别在果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、糖化酶、α-淀粉酶5种酶的最适pH值以及最适温度下(果胶酶：最适pH为4.8、最适温度为50℃；纤维素酶：最适pH为4.8、最适温度为50℃；半纤维素酶：最适pH为4.8、最适温度为50℃；糖化酶：最适pH为4.5、最适温度为60℃；α-淀粉酶：最适pH为6.5、最适温度为60℃)，以相同的料液比(1:4)，加酶量(2.5％)(与苦杏仁粕的质量比)以及提取时间(2.5h)进行苦杏仁粕水酶法提油试验，以苦杏仁粕水酶法清油提取率、苦杏仁粕水酶法总油提取率为指标确定效果较好的酶制剂(水酶法提油实验具体操作和计算公式，与对比例2中相同)。

具体结果如图1所示，α-淀粉酶、糖化酶、半纤维素酶的酶解提油率高于果胶酶和纤维素酶。

纤维素酶、半纤维素酶可降解植物细胞壁的骨架，崩溃细胞壁，使油脂容易游离出来；糖化酶可降解脂多糖等复合体；α-淀粉酶可分解淀粉，使油脂容易释放出来。故选用α-淀粉酶、糖化酶、半纤维素酶按照1:1:1的质量比复配后进行下一步试验。

实验2单因素试验

2.1酶解温度对苦杏仁粕提油率的影响

在酶解pH为5.5、加酶量为2.5％(与苦杏仁粕的质量比)、酶解时间为2.5h的酶解条件下，分别在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃的温度下进行酶解试验，考察酶解温度对苦杏仁粕清油提取率、总油提取率的影响。

具体结果如图2(A图)所示，在起始阶段，随着温度的升高，苦杏仁粕提油率呈现先增加后减少的趋势，在55℃时出现最大值，继续升高温度，提油率随温度升高而下降。这是由于随着温度升高，酶的活性提高，酶解反应的速率增大，更有利于油脂从细胞中释放出来；同时，酶解体系温度升高可以增大分子扩散系数，降低溶剂及油脂的黏度，加快油脂分子的扩散速度。当超过酶的适宜反应温度时，酶的活性降低，影响酶的中心结构，使酶部分甚至全部失去催化活性；还有可能是在高温下进行酶解使得物料中的可溶性糖降低，限制了油从细胞中释放出来并减少了水解产物，从而导致提油率下降。因此，冷榨结合水酶法苦杏仁提油适宜酶解温度为55℃左右。

2.2酶解pH对苦杏仁粕提油率的影响

在酶解温度为55℃、加酶量为2.5％、酶解时间为2.5h的酶解条件下，分别在4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的酶解pH下进行酶解试验，考察酶解pH对苦杏仁粕清油提取率、总油提取率的影响。

具体结果如图2(B图)所示，在起始阶段，随着pH的增大，苦杏仁粕提油率呈现先增加后减少的趋势，在pH为5.5时出现最大值，继续增大，提油率随pH增大而下降。这是由于随着pH的增大，酶的活力升高，酶反应速度加快，当pH值等于或接近复合酶的最佳活性pH时，可获得较高的提油率。当酶解液pH大于5.5时，体系乳化程度增加，导致稳定性和提油率下降。因此，冷榨结合水酶法苦杏仁提油适宜酶解pH为5.5左右。

2.3加酶量对苦杏仁粕提油率的影响

在酶解温度为55℃、酶解pH为5.5、酶解时间为2.5h的酶解条件下，分别在1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％的加酶量下进行酶解试验，考察加酶量对苦杏仁粕清油提取率、总油提取率的影响。

具体结果如图2(C图)所示，在起始阶段，随着加酶量的增加，苦杏仁粕提油率呈现先增加后减少的趋势，在加酶量为2.5％时出现最大值，继续增大，提油率随加酶量的增加而下降。这是由于随着加酶量的增加，酶与反应底物分子碰撞的几率变大，对细胞结构破坏越大，对脂蛋白、脂多糖等复合体酶解更充分，从而促进油脂释放出来；但随着加酶量的持续增加，底物与酶的反应达到饱和时，加酶量过多会使得酶分子间产生竞争性抑制作用，降低了酶的作用效率，致使提油率降低；同时过量的酶会附着在苦杏仁表面，影响了油脂的释放；同时加酶量过多也易使酶解体系发生深度水解，水解产物增强蛋白质的乳化性，使油脂分子再度被蛋白质包裹，产生乳化现象增加了油脂的分离难度，致使提油率降低。因此，冷榨结合水酶法苦杏仁提油适宜加酶量为2.5％左右。

2.4酶解时间对苦杏仁粕提油率的影响

在酶解温度为55℃、酶解pH为5.5、加酶量为2.5％的酶解条件下，分别在1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h的酶解时间下进行酶解试验，考察酶解时间对苦杏仁粕清油提取率、总油提取率的影响。

具体结果如图2(D图)所示，在起始阶段，随着酶解时间的增加，苦杏仁粕提油率呈现先增加后减少的趋势，在酶解时间为2.5h时出现最大值；继续增大，提油率随酶解时间的增加而下降。这是由于随着酶解时间的增加，酶与原料接触的时间更充分，细胞壁和复合物等逐步被打破，提油率不断提高；但随着酶解时间的延长，会使酶长时间处于温度较高的环境下，使其活性降低甚至失活，还可能会加重油脂发生乳化现象，导致提油率下降。因此，冷榨结合水酶法苦杏仁提油适宜酶解时间为2.5h左右。

实验3响应面分析

3.1响应面试验设计

根据Box-Behnken响应面设计原理，在单因素试验基础上，以酶解温度(A)、酶解pH(B)、加酶量(C)、酶解时间(D)为自变量，以苦杏仁粕总提油率(Y)为响应值，采用DesignExpert8.0软件对各因素间交互作用进行分析,确定苦杏仁冷榨结合水酶法提油最佳工艺。

响应面试验设计及结果见表1。

表1响应面试验因素与水平

3.2数据模型建立与回归分析

根据表1的响应面试验设计结果对数据进行回归分析,得到苦杏仁提油率的二次多项回归模型为：

Y＝+70.49+6.71A+11.66B+4.29C+4.48D-7.22AB+1.81AC+3.85AD-4.03BC+0.66BD-1.74CD-19.83A

表2响应面试验交互作用分析

注：*表示差异显著(p<0.05)；**表示差异极显著(p<0.01)。

由表2对回归方程的方差分析可知，苦杏仁粕总提油率回归方程的拟合度达到了极显著水平(p<0.0001)，失拟项不显著(p>0.05)，拟合的模型方程效果较好，该模型成立有效。该回归方程的决定系数R

3.3响应面交互作用分析

响应面二维平面图的等高线图形情况及3D图的陡峭程度，可以反映出各个自变量和两自变量之间交互作用对响应值的影响，当等高线呈圆形且3D图坡度较平缓时，表示两因素交互作用不显著，当等高线呈椭圆形且3D图坡度较陡时，表示两因素交互作用影响显著。

由图3～图8可知：AB(酶解温度-酶解pH)、AD(酶解温度-酶解时间)、BC(酶解pH-加酶量)交互作用的等高线呈椭圆形，3D图较陡，对苦杏仁粕总提油率影响极显著；AC、BD交互作用的等高线呈扁圆形、CD交互作用的3D图坡度较平缓，对苦杏仁粕总提油率影响不显著。从响应面3D图可知，在低水平条件下随着每个因素的增大，响应值增大，当响应值增大到极值后，又逐渐减小。

3.4提油工艺条件的确定及验证试验

通过DesignExpert8.0.6软件对回归方程进一步优化，得出苦杏仁粕提油最优酶解工艺条件为：酶解温度55℃、酶解pH5.8、加酶量2.5％、酶解时间2.6h，此条件下苦杏仁粕总提油率预测值为73.50％。根据实际情况对酶解的工艺条件进行修整为酶解温度55℃、酶解pH6.0、加酶量2.5％、酶解时间2.6h，为检验结果的可靠性，采用修整条件进行5次平行验证试验，得到苦杏仁粕总提油率平均值为73.46％，与理论预测值接近，说明该方程与实际情况拟合很好。

实验4不同提油方法对苦杏仁油提取率的影响

表3不同提油方法对苦杏仁油提取率的影响

由表3可知，单一冷榨法对苦杏仁油提取率为36.14％，将冷榨法提油后的苦杏仁粕进行水酶法提油工艺优化后，冷榨结合水酶法对苦杏仁油提取率为84.24％，较单一冷榨法提油率提高了48.1％。由此可见，冷榨结合水酶法提取苦杏仁油脂是一种反应条件温和且提油率高的方法。

实验5不同提油方法对苦杏仁蛋白结构特性的影响，具体步骤如下：

分别取实施例1中苦杏仁和经过冷榨法和冷榨结合水酶法提油后得的苦杏仁粕、对比例1中仅经过冷榨法提油后得到的苦杏仁粕以及对比例3中单纯水酶法提油后得到的苦杏仁粕各60g，40℃烘干后粉碎至60目，以料液比1:11加入75％乙醇水溶液，在50℃下脱苷处理50min，抽滤取沉淀物，将冷榨结合水酶法提油的苦杏仁粕脱苷沉淀物以料液比1:25加入蒸馏水，苦杏仁粉脱苷沉淀物、冷榨苦杏仁粕粉脱苷沉淀物按照所含蛋白质重量/蒸馏水重量的比值与前述条件相当的原则折算蒸馏水用量，分别调节pH至11.0，40℃提取60min。4000r/min离心20min，取上清液调节pH至4.6，静置30min后4000r/min离心20min，取沉淀物后用蒸馏水洗三次，调节pH至7.0后冷冻干燥(冷冻干燥条件：将样品倒入平皿中，于-18℃下预冻48h，放入真空冷冻干燥仪中真空冷冻干燥48h，取出备用)。

取上述样品分别进行氨基酸组成、分子量分布、傅里叶红外光谱、内源荧光光谱、表面微观形态检测，对不同提油方法对苦杏仁蛋白结构特性的影响进行研究。

(1)氨基酸组成

称取约100mg均匀样品于水解瓶中，加入8mL6mol/LHCl，充氮气3min，封瓶，120℃水解22h，取出冷却，将水解管样品全部转移至容量瓶中，加4.8mL10mol/LNaOH中和，用蒸馏水定容至25mL，双层滤纸过滤，取1mL澄清液15000r/min离心30min，取400μL上清液于液相样品瓶中。使用Agilent1100液相色谱仪进行色谱分析(液相色谱条件：流动相流速为1.0mL/min；柱温为40℃；紫外检测器(VWD)检测波长为338nm，脯氨酸为262nm检测；氨基酸含量以外标法定量)。

表4不同提油方法的苦杏仁蛋白氨基酸组成及含量

由表4可知，不同提油方法的苦杏仁蛋白中都含有17种氨基酸，总氨基酸含量为72.10％-73.90％。其中7种人体必需氨基酸(色氨酸除外)含量为20.75％-21.59％，占总氨基酸含量的28.72％-29.22％。苦杏仁蛋白氨基酸组成中谷氨酸含量最高，在本发明中谷氨酸以18.14％-18.92％呈现，谷氨酸对脑震荡、神经损伤、癫痫等神经性疾病具有一定的营养补充作用，也能缓解肝性脑病患者出现的神经改变症状。本发明中不同提油方法苦杏仁粕蛋白的氨基酸组成与苦杏仁蛋白的氨基酸组成差异不明显，表明不同提油方法导致的苦杏仁蛋白就氨基酸组成而言变性度极低。

表5不同提油方法的苦杏仁蛋白必需氨基酸组成与WHO/FAO建议值的对比

苦杏仁蛋白中必需氨基酸组成是评价苦杏仁蛋白营养成分的重要评判标准，其所含必需氨基酸能够被人体全部吸收，它的营养价值才能达到最高。与联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(WHO/FAO)标准氨基酸模式中必需氨基酸建议值相比，不同提油方法的苦杏仁蛋白中必需氨基酸的总含量为34.72％-35.13％，均接近或高于WHO/FAO标准氨基酸模式，氨基酸评分达到99.20-100.38分，其中，7种必需氨基酸中苏氨酸、赖氨酸含量略低于WHO/FAO标准氨基酸模式，其余必需氨基酸含量均高于WHO/FAO标准氨基酸模式(见表5)，所以苦杏仁蛋白是一种优质的食用蛋白质。

(2)分子量分布

分离胶浓度为12％，浓缩胶为5％。将不同方法提油后的苦杏仁蛋白样品配制成浓度为10mg/mL的溶液，取30μL蛋白溶液与10μL的4倍上样缓冲液混合，沸水浴4min，冷却后离心，取18μL上样。跑样起始电压为80V，样品进入分离胶后调节电压为120V。考马斯亮蓝G-250染色30min，过夜脱色，通过凝胶成像系统拍照。与标准蛋白分子量(14-97.2kDa)相比较计算不同方法提油后苦杏仁蛋白的分子量。

由图9可知，SDS-PAGE测定结果中不同提油方法的苦杏仁蛋白的平均分子量在20-80kDa之间，苦杏仁蛋白主要有4个亚基条带，其分子量大小分别为41kDa、37kDa、29kDa、22kDa，其中分子量为41kDa、37kDa、22kDa的含量较多。冷榨结合水酶法提油蛋白的55kDa附近亚基条带着色变浅，而33kDa附近亚基条带着色变深，这可能是酶解反应导致苦杏仁蛋白中较大的亚基解离成较小的亚基。不同提油方法得到的苦杏仁粕蛋白在亚基组成上与未提油苦杏仁蛋白没有明显的差异，表明不同提油方法导致的苦杏仁蛋白就亚基组成而言变性度极低。

(3)傅里叶红外光谱

使用傅里叶红外光谱仪对不同方法提油后苦杏仁蛋白的二级结构进行测定。将苦杏仁蛋白样品与KBr经干燥处理后，准确称取待测样品与KBr混合，充分研磨成均匀粉末后压成透明薄片，使用傅里叶红外光谱仪记录所有光谱，扫描条件：扫描范围4000-400cm-1，分辨率4cm-1，扫描次数32次，谱图分析采用Omnic9.2和Peakfitv4.12软件进行分析。

由图10(A图)可知，红外图谱主要有几组特征吸收谱带，在3200-3500cm

表6不同提油方法的苦杏仁蛋白二级结构的相对含量

注：不同小写字母表示显著性差异，p<0.05。

由表6可知，通过分析波数范围在1600-1700cm

目前公认的酰胺I带二级结构的区域指：α-螺旋(1650-1660cm

综上，不同提油方法会对二级结构造成影响，与未提油蛋白相对比，冷榨法提油对苦杏仁蛋白二级结构影响较大，冷榨结合水酶法提油对苦杏仁蛋白二级结构影响不明显。

(4)内源荧光光谱

使用荧光分光光度计对不同方法提油后苦杏仁蛋白的三级结构进行测定。将苦杏仁蛋白溶解于0.01mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液中，磁力揽拌2h后4000r/min离心20min收集上清液。以考马斯亮蓝G-250法测定上清液中蛋白浓度，用磷酸盐缓冲液将蛋白浓度稀释到0.1mg/mL。采用F-7000型荧光光谱仪在激发波长280nm下扫描300-400nm之间的发射光谱，记录荧光光谱。激发和发射狭缝宽度均设置为5nm。

由图10(B图)可知，苦杏仁蛋白中色氨酸残基的内源荧光对微环境极性的变化特别敏感，因此使用荧光光谱方法检测不同提油方法对苦杏仁蛋白三级结构的影响。在280nm的激发波长下三种蛋白最大吸收波长在330nm～332nm之间无明显差异。与未提油蛋白相对比，提油处理后苦杏仁蛋白的最大吸收波长向长波方向发生了轻微红移，表明部分色氨酸残基暴露于蛋白质分子表面，色氨酸残基所处环境从蛋白质分子内部非极性环境向极性环境转化。三种蛋白的最大荧光强度无明显差异，最大荧光强度大小依次是冷榨法提油蛋白>冷榨结合水酶法提油蛋白>未提油蛋白。

与未提油蛋白相对比，提油处理后苦杏仁蛋白的最大荧光强度增大，表明蛋白质折叠结构展开，原本被致密结构包裹的发色氨基酸被暴露出来。冷榨结合水酶法提油蛋白的最大吸收波长和最大荧光强度小于冷榨法提油蛋白，但是与未提油蛋白相近，可能是因为酶解反应使蛋白结构展开，更多色氨酸残基暴露于表面，活性基团的暴露增强了分子间相互作用，造成分子的再聚集，进一步导致更多色氨酸残基被包埋于疏水区域，从而引起最大吸收波长和最大荧光强度的下降。实验结果影响规律与二级结构相近，规律亦如上述(3)。

综上，不同提油方法会对三级结构造成影响，与未提油蛋白相对比，冷榨法提油对苦杏仁蛋白三级结构影响较大，冷榨结合水酶法提油对苦杏仁蛋白三级结构影响不明显，可能是因为水酶法提油过程中蛋白质发生了一定程度的复性。

(5)表面微观形态

使用冷场发射扫描电子显微镜对不同方法提油后苦杏仁蛋白的表面微观形态进行观察。将蛋白样品充分干燥，使用冷场发射扫描电子显微镜导电胶将样品粘在样品台上，用吸耳球吹掉多余和松动的样品。使用离子溅射仪在样品表面镀导电金膜后，在SU8100型冷场发射扫描电子显微镜内观察并记录样品的微观形貌(3kV)。

由图11可知，通过冷场发射扫描电子显微镜观察不同提油方法的苦杏仁蛋白的表面微观形态特征，这种形态特征反映了苦杏仁蛋白和油脂的聚集行为。未提油处理的苦杏仁蛋白呈现大量块状聚集和堆积，蛋白表面粗糙且致密紧实，是因为未提油处理的苦杏仁蛋白中油脂与蛋白质大量结合；冷榨法提油处理的苦杏仁蛋白呈现较大块聚集，蛋白表面较粗糙且有少量孔洞结构，是因为冷榨法高压处理去除部分油脂，减少了油脂和蛋白的相互作用；冷榨结合水酶法提油处理的苦杏仁蛋白呈现大小不一的块状或片状较分散排列，蛋白表面形状清晰且呈现大量孔洞结构，可能是因为经过冷榨和水酶法提油处理后的蛋白脱除了蛋白网状结构内的脂肪，显示出蛋白质的骨架结构。

本发明以苦杏仁为原料，采用一种新型提油工艺对苦杏仁提油，提油工艺包括：苦杏仁脱皮处理、冷榨法提油、水酶法酶解和乳化层破乳四个步骤。

在上述提油工艺的基础上，本发明还确定了苦杏仁提油工艺中水酶法提油的最佳工艺条件为：酶解温度55℃、酶解pH6.0、加酶量2.5％、酶解时间2.6h，所得到苦杏仁油提取率为73.46％。

不同提油方法对苦杏仁蛋白的氨基酸组成和分子量分布差异不明显。不同提油方法会对苦杏仁蛋白二、三级结构造成影响，与未提油蛋白相对比，冷榨法提油对苦杏仁蛋白二、三级结构影响较大，冷榨结合水酶法提油对苦杏仁蛋白二、三级结构影响不明显。不同提油方法的苦杏仁蛋白的表面微观形态存在差异，未提油蛋白的微观形态呈现大量块状聚集堆积和蛋白表面粗糙且致密紧实，冷榨法提油蛋白的微观形态呈现较大块聚集和蛋白表面较粗糙且有少量孔洞结构，冷榨结合水酶法提油蛋白的微观形态呈现大小不一的块状或片状较分散排列和蛋白表面形状清晰且呈现大量孔洞结构。冷榨结合水酶法提油既绿色安全又有助于保持油脂和蛋白质的天然特性，有助于拓宽苦杏仁的应用范围和推动苦杏仁资源的增值利用。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。