基于低共熔溶剂辅助水热分解微藻的可持续脂质提取方法

技术领域

本发明涉及脂质提取领域，具体是涉及基于低共熔溶剂辅助水热分解微藻的可持续脂质提取方法。

背景技术

由于全球化石燃料的日益枯竭及其对环境的不利影响，对传统石油来源燃料的替代燃料的寻找不断增加。作为第三代生物质，微藻因其高光合作用效率、高生长率和高单位面积产量而被认为是一种非常有前途的解决方案。微藻生产的各种生物燃料中，液体燃料可以为航空、重型运输和制造业等难以脱碳的行业减少碳排放做出重大贡献。基于微藻的生物燃料生产过程包括微藻培养、收获、脂质提取和脂质转化。基于微藻的大规模液体燃料生产的一个主要问题是传统的脂质提取涉及使用有毒溶剂和高水平的能源消耗。

具有高选择性渗透性的刚性微藻细胞壁以及脂质分子与有机大分子之间广泛的分子间相互作用阻碍了从微藻中有效提取脂质。由于低能耗和无溶剂工艺，湿微藻生物质的水热处理(HTT)被认为是一种很有前途的燃料生产工艺。HTT被证明可以有效地破坏微藻细胞壁，并将二氯甲烷提取脂质的效率提高到84％。由于极性脂质通过氢键与细胞膜中的蛋白质紧密相连，因此在HTT后仍使用有毒的二氯甲烷进行脂质提取。在200℃下使用HTT将微藻碳水化合物和蛋白质水解，然后通过过滤获得含脂质的残留物以进一步液化乙醇。然而，滤渣中含有大量蛋白质，表明脂质没有得到有效分离。由于微藻细胞壁结构和大分子之间的氢键被破坏，在连续流动反应器中用HTT在260℃处理生物质后，通过过滤从湿微藻中分离出72.3％的脂质。进一步优化工艺，在间歇式反应器中，在245℃下对微藻进行HTT后，脂质提取效率达到89.2％。然而，HTT的温度对于工业规模生产来说仍然过高。同时，微藻脂质在过高的温度下可能会与蛋白质和碳水化合物的水解产物发生反应，导致脂质变质和微藻生物质碳化。

低共熔溶剂(DES)由于其低成本、低毒性和高生物降解性，目前在生物质预处理中引起了相当大的关注。据报道，各种技术可在生物质预处理后有效回收DES，包括反溶剂添加、结晶、膜过滤、固-液萃取、液-液萃取、短程蒸馏和超临界流体萃取。据报道，DES可有效重建干燥的微藻细胞壁并水解细胞质淀粉以进行生物乙醇发酵。使用DES预处理干燥的微藻生物质将脂质提取效率从52.03％提高到80.9％。还有报道表明DES辅助微波处理显着提高了从干燥的微藻生物质中提取脂质的选择性。然而，上述过程的重点是从干燥的微藻生物质中提取脂质。微藻生物质干燥消耗的能量巨大，能量回收难度大。一旦DES直接用于从湿微藻中提取脂质，DES的量可以大大增加。同时加入大量甲醇和硫酸转化脂质，提高脂质提取效率。这是因为湿微藻中的水用DES重建了氢键网络，显着降低了DES破坏微藻结构的效率。仅通过DES预处理无法轻易实现湿微藻的高脂质提取效率。

由于DES可以用水重建氢键网络，DES也被用来促进HTT用于生化化合物的生产。使用DES辅助HTT能够从褐藻中提取多糖。据报道，提取效率明显高于盐酸辅助HTT。这一发现表明，DES不仅作为促进生物质水解的酸催化剂，而且作为氢键供体(HBD)和受体(HBA)破坏生物质的氢键网络。有报道表明在HTT下直接添加氯化胆碱作为HBA，有效改善了王木叶片和叶鞘的脱木质化，表明HBA可以在水热条件下直接重建分子间相互作用。同时，在使用水热和DES处理生物质分馏后，通过基于膜的超滤和电渗析方法实现了高纯度(≥98％)DES的高回收率(≥92％)。然而，很少研究通过DES辅助HTT分解湿微藻生物质以提取绿色脂质。

发明内容

基于此，有必要针对现有技术问题，提供一种基于低共熔溶剂辅助水热分解微藻的可持续脂质提取方法。

为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案为：

基于低共熔溶剂辅助水热分解微藻的可持续脂质提取方法，包括以下步骤：

S1，将干燥的微藻粉在不锈钢反应器中搅拌使其分散在蒸馏水中，随后以10％-30％的浓度添加DES；

S2，通过油浴加热系统以120℃-200℃的温度将S1中反应器中的内容物加热5-30分钟，然后以水浴的方式冷却反应器以尽快降低反应混合物的温度；

S3，在S2的混合物中加入正己烷以提取油脂，经过离心操作后收集正己烷层并转移到玻璃样品瓶；

S4，将样品瓶放入鼓风干燥箱进行烘干得到油脂。

优选的，所述DES为氯化胆碱和丙酸以1:2的摩尔比例混合制得。

优选的，所述DES的浓度为25％。

优选的，S2步骤中，所述水热温度为160℃。

优选的，在S2步骤中，所述加热时长为20分钟。

优选的，在S4步骤中，所述烘干温度为60℃，烘干时间为24h。

本发明与现有技术相比具有的有益效果是：

其一，本发明相较于传统工艺的脂质提取方法，具有绿色环保的优点，提取过程避免了剧毒物质的使用；

其二，本发明的绿色提取方法显著的提高了脂质提取的效率；

其三，本发明的绿色提取方法相较于传统工艺具有极低的能源消耗的优势。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

一种提取效率较好的传统脂质提取工艺如下：

S1，将收获的湿微藻生物质在-76℃冷冻，然后在冷冻干燥机中以0.16毫巴干燥48小时以获得冻干微藻；

S2，将大约0.2g冻干微藻与5mL氯仿、5mL去离子水和10mL甲醇混合，将混合物以800rpm搅拌20分钟，然后转移到试管中；

S4，接下来，将5mL氯仿和5mL去离子水加入混合物中；

S5，收集氯仿层并在8000rpm离心4分钟后转移到玻璃瓶中。这些过程重复两次以完全提取脂质；

S6，通过将玻璃瓶转移到烤箱并在60℃下烘烤24小时来分离脂质。

可见即便提取率较好的传统提取工艺中也必须用到氯仿等有毒物质，因此本研究旨在提出一种绿色环保、低功耗同时具有较高提取率脂质提取方法。

在本研究中，采用由氯化胆碱分别与甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸制备的DES来促进微藻生物质与HTT的分解，以不同的摩尔比、不同的水热时间、不同的水热温度、不同的DES浓度用于绿色脂质提取。DES不仅加速了生物质表面亲水性蛋白质和碳水化合物的解聚和增溶，而且通过重建氢键网络破坏了微藻分子间的相互作用。因此，DES辅助有效地促进了湿微藻生物质的分解和随后的脂质扩散。综合研究不同氢键供体的DES、DES极性对脂质提取的影响。在最佳条件下实现了103.4％的高脂质提取效率。

实验材料：

脂质含量为241.20mg/g、总蛋白质含量为392.49mg/g、总碳水化合物含量为114.79mg/g的微拟球藻。

DES是通过简单的混合和加热方法制备的。将氯化胆碱和甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸以2:1摩尔比称入烧瓶中。将混合物在60℃下搅拌直至形成无色液体。随后，将制备的DES保存在螺口瓶中并储存在干燥器中以备后用。

本绿色提取方法的实验过程如下：

干燥的微藻粉(0.45g)在7mL不锈钢反应器中搅拌下重新分散在3mL蒸馏水中。随后以10％–30％的浓度添加DES。对于对照组，DES被替换为相同质量的去离子水。使用油浴加热系统将内容物加热至各种水热温度(120℃、140℃、160℃、180℃和200℃)5-30分钟。通过油浴加热将反应釜加热至160℃的水热温度并保持20分钟。然后以水浴的方式冷却反应釜以尽快降低反应混合物的温度。在混合物中加入4mL正己烷以提取油脂，在8000rpm下离心4分钟收集正己烷层，并转移到玻璃样品瓶，此过程中油脂已经溶解在正己烷中，另外还剩固体和水的混合物。将样品瓶放入鼓风干燥箱在60℃烘干24h得到油脂。加入20mL去离子水至上述固体和水的混合物中用于进一步表征，再将水和固体分离，得到水相，将固体残渣在105℃烘干24h。

实验结论分析：

2:1丙酸与氯化胆碱形成的DES在160℃水热20min时、DES浓度为25％时脂质提取效果最佳，达到103.4％的脂质提取率，相同条件下的油脂提取效果，甲酸与氯化胆碱为95.75％，琥珀酸与氯化胆碱仅为57.33％。在甲酸与氯化胆碱的DES实验中，还原糖在水热水相中的溶解度从39.09mg/g DW增加到50.70mg/g DW随着DES中甲酸含量的增加。然而，热液水相中的蛋白质溶解度从389.53mg/g DW降至351.10mg/g DW。这是因为DES中氯化胆碱含量的降低导致其作为助溶剂促进蛋白质增溶的有效性降低。

在120℃时，加DES比不加DES将脂质提取效率从6.47％略微提高到13.04％，当处理温度进一步升高至160℃时，在DES辅助HTT后，脂质提取效率高达95.75％，比没有DES的160℃的HTT(19.03％)高5.04倍。随着处理温度的升高，含DES的热液水相中的还原糖增溶也增加至27.09mg/g DW，这明显高于140℃无DES时HTT的9.90mg/g DW。这一发现表明，当HTT温度升高到140℃时，DES显着促进了湿微藻生物质的分解。在160℃下通过DES辅助HTT分解湿微藻生物质后的脂质提取效率甚至高于在245℃下没有DES的HTT获得的脂质提取效率。

还原糖在热液相中的溶解显着增加到48.09mg/g DW。然而，热液水相中的蛋白质溶解从174.86mg/g DW略微增加到201.63mg/g DW。20％ DES浓度显着促进解聚；然而，蛋白质溶解仍然不足。因此，当DES浓度增加到20％时，脂质提取效率仅增加到79.10％。

在不同水热时间下，在前5分钟内，水热水相中的蛋白质增溶增加到267.73mg/g，还原糖仅为11.04mg/g。脂质提取效率仅为22.05％，微藻生物质的解聚在DES辅助HTT 5分钟后未完成。当停留时间延长至10min时，还原糖在热液相中的增溶增加到18.96mg/g。脂质提取效率随后从22.05％增加到48.16％。当HTT停留时间进一步增加到15分钟时，还原糖在热液相中的溶解进一步增加到36.27mg/g。结果，随着HTT停留时间的延长，脂质提取效率增加到73.68％。DES辅助HTT处理20分钟后，脂质提取效率达到95.75％。

以上实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。