一种蜂毒肽糖肽及其制备方法和用途
文献发布时间：2024-04-18 19:52:40
技术领域
本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种蜂毒肽糖肽及其制备方法和用途。
背景技术
蜂毒肽(melittin)是蜂毒发挥药理作用和生物活性的主要成分，有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤等作用。研究表明，蜂毒肽具有热稳定性好、免疫原性较低、不易产生过敏反应、杀菌效率优于常规抗生素等优点，有很大的潜在药用价值。但因存在强溶血性，当前，蜂毒肽在临床上的应用受到了较大的限制。
蛋白质糖基化是存在于生命所有领域中最普遍和最复杂的蛋白质的翻译后修饰(Post-translational modifications，PTMs)之一，在调节真核生物的生物复杂性中发挥着关键作用，已成为当前化学和生物学研究的热点方向之一。多肽分子糖基化可以改变原肽的物理和药理学性质，有望提高多肽药物的治疗效果，改善多肽药物在临床使用中存在的缺陷。
在多肽的糖基化修饰中，精氨酸-糖基化修饰是一种全新的糖基化修饰方法，研究表明部分经该法修饰的抗菌肽对病菌的定殖和产生病理效应至关重要。目前，尚未见对蜂毒肽进行糖基化修饰得到蜂毒肽糖肽的文献报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中蜂毒肽在临床上应用时存在的不足，提供一种蜂毒肽糖肽及其制备方法和用途。
本发明提供了一种蜂毒肽糖肽，所述蜂毒肽糖肽以Ac-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH
进一步地，所述第22位和/或第24位精氨酸被半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、核糖、麦芽糖或乳糖糖基化修饰。
进一步地，所述蜂毒肽糖肽为式I所示的化合物：
其中，R
R
进一步地，所述蜂毒肽糖肽为式II所示的化合物：
其中，R
或者，所述蜂毒肽糖肽为式III所示的化合物：
其中，R
或者，所述蜂毒肽糖肽为式IV所示的化合物：
其中，R
进一步地，所述蜂毒肽糖肽为如下化合物之一：
/>
/>
本发明还提供了前述的蜂毒肽糖肽的制备方法，它包括如下步骤：
(1)采用多肽固相合成法在树脂上合成SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的肽链，最后一个氨基酸脱保护后乙酰化，得到含肽树脂；
(2)在脱保护剂的作用下，将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的肽链中的鸟氨酸的保护基DDe脱去，裸露侧链氨基；
(3)在碱存在下，于溶剂中将步骤(2)得到的含有裸露侧链氨基的含肽树脂与硝酸银和糖配体作用进行胍基化反应，将糖配体连接到肽链上；
(4)去除糖配体上的乙酰基；
(5)将肽链从载体树脂上切下，纯化后得相应蜂毒肽糖肽。
进一步地，
步骤(1)中，所述多肽固相合成法为Fmoc固相合成法；
和/或，步骤(2)中，所述脱去保护基DDe的方法包括如下步骤：溶剂中，含肽树脂与水合肼反应；
和/或，步骤(3)中，含有裸露侧链氨基的含肽树脂、硝酸银、糖配体的质量比为(1～10)：(1～10)：(1～10)；
和/或，步骤(3)中，所述溶剂为DMF；
和/或，步骤(3)中，所述碱为三乙胺；
和/或，步骤(3)中，所述反应温度为室温；和/或，所述反应时间为6～12h；
和/或，步骤(4)中，所述去除糖配体上的乙酰基的方法包括如下步骤：在溶剂中用5％水合肼去除糖配体上的乙酰基；
和/或，步骤(5)中，所述将肽链从载体树脂上切下使用的溶液为TIPS、H
和/或，步骤(5)中，所述纯化的方法为反向高效液相色谱法；
优选地，
步骤(1)中，所述Fmoc固相合成法中，采用的缩合剂为DIC-Oxyme缩合体系，活化剂为DIC，以NMP为溶剂；和/或，所述脱保护试剂为Oxyme、哌啶及DMF的混合溶液，比例为7.1:100:400(g/ml/ml)；
和/或，步骤(1)中，所述最后一个氨基酸脱保护后乙酰化时，乙酰化试剂为DIEA与醋酸酐和DMF的混合液，投料比为1:1:8(v/v)；
和/或，步骤(2)中，所述脱保护剂为2％水合肼的DMF溶液，投料比为树脂载样量:NH
和/或，步骤(2)中，所述脱去保护基DDe时，溶剂为DMF；
和/或，步骤(4)中，所述去除糖配体上的乙酰基时，溶剂为DMF。
进一步地，所述糖配体结构如下：
本发明还提供了前述的蜂毒肽糖肽在制备抗菌药物中的用途；
优选地，所述药物为抗金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的药物。
本发明还提供了前述的蜂毒肽糖肽在制备抗肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述药物为预防和/或治疗结直肠癌的药物。
本发明还提供了一种药物，它是以前述的蜂毒肽糖肽为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
1、本发明设计并合成了一类蜂毒肽糖肽，实验证实了部分蜂毒肽糖肽可提高抗菌活性以及对肿瘤细胞的抑制作用，同时大部分蜂毒肽糖肽可降低溶血副作用，在抗菌以及抗肿瘤治疗中具有潜在的应用价值。
2、本发明以氨基树脂为载体，按照模板蜂毒肽(Melittin)：Ac-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH
综上，本发明成功制备得到一类蜂毒肽糖肽，且证明了该类蜂毒肽糖肽的溶血效果相比于蜂毒肽大大降低，有效解决了现有技术中蜂毒肽存在强溶血性的问题，有利于临床应用。同时，本发明制备得到的部分蜂毒肽糖肽抗菌活性以及抑制肿瘤细胞的活性显著优于蜂毒肽，在制备抗菌药物及抗肿瘤药物的研发领域具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为MT-1a的HPLC图谱。
图2为MT-1a的质谱图。
图3为MT-2a的HPLC图谱。
图4为MT-2a的质谱图。
图5为MT-3a的HPLC图谱。
图6为MT-3a的质谱图。
图7为MT-1b的高效液相图谱。
图8为MT-1b的质谱图。
图9为MT-2b的HPLC图谱。
图10为MT-2b的质谱图。
图11为MT-3b的HPLC图谱。
图12为MT-3b的质谱图。
图13为MT-1c的高效液相图谱。
图14为MT-1c的质谱图。
图15为MT-2c的HPLC图谱。
图16为MT-2c的质谱图。
图17为MT-3c的HPLC图谱。
图18为MT-3c的质谱图。
图19为MT-1d的高效液相图谱。
图20为MT-1d的质谱图。
图21为MT-2d的HPLC图谱。
图22为MT-2d的质谱图。
图23为MT-3d的HPLC图谱。
图24为MT-3d的质谱图。
图25为MT-1e的HPLC图谱。
图26为MT-1e的质谱图。
图27为MT-2e的HPLC图谱。
图28为MT-2e的质谱图。
图29为MT-3e的HPLC图谱。
图30为MT-3e的质谱图。
图31为MT-1f的高效液相图谱。
图32为MT-1f的质谱图。
图33为MT-2f的HPLC图谱。
图34为MT-2f的质谱图。
图35为MT-3f的HPLC图谱。
图36为MT-3f的质谱图。
图37为MT-1g的高效液相图谱。
图38为MT-1g的质谱图。
图39为MT-2g的HPLC图谱。
图40为MT-2g的质谱图。
图41为MT-3g的HPLC图谱。
图42为MT-3g的质谱图。
图43为MT-1h的高效液相图谱。
图44为MT-1h的质谱图。
图45为MT-2h的HPLC图谱。
图46为MT-2h的质谱图。
图47为MT-3h的HPLC图谱。
图48为MT-3h的质谱图。
图49为各蜂毒肽糖肽对兔红细胞的溶血作用。
图50为各蜂毒肽糖肽对人结直肠癌HCT-116的细胞毒性实验结果。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明中使用的8种糖配体是根据文献Pan M,Li S,Li X,et al.Synthesis ofand specific antibody generation for glycopeptides with arginine N-GlcNAcylation[J].Angew Chem Int Ed Engl,2014,53(52):14517-14521和Ye W,Y uleL,Wei C,et al.Total synthesis of TRADD death domain with arginine N-GlcNAcylation by hydrazide-based native chemical ligation[J].Chinese ChemicalLetters,2020,31(1):107-110制备而得。8种糖配体结构如下：
其中，半乳糖糖配体和葡萄糖糖配体互为同分异构体；木糖糖配体和核糖糖配体互为同分异构体；麦芽糖糖配体和乳糖糖配体互为同分异构体。
本发明按照模板蜂毒肽(Melittin)：
Ac-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH
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/>
其中，MT-1a～3a和MT-1e～3e互为同分异构体；MT-1d～3d和MT-1f～3f互为同分异构体；MT-1g～3g和MT-1h～3h互为同分异构体。
以下实施例涉及的缩略词解释如下：Fmoc：芴甲氧羰基；DCM：二氯甲烷；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；Oxyme：2-肟氰乙酸乙酯；DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺；NMP：N-甲基吡咯烷酮；TFA：三氟乙酸；TIPs：三异丙基硅烷。
涉及的部分实验材料来源如下：氨基酸、氨基树脂购自上海吉尔生化有限公司；N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、2-肟氰乙酸乙酯(Oxyme)、三氟乙酸(TFA)、乙腈(色谱纯)购自高新区恒宇祥化玻实验仪器经营部；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙醚、二氯甲烷(DCM)、哌啶、苯酚均为分析纯，购自高新区恒宇祥化玻实验仪器经营部。
实施例1、本发明蜂毒肽糖肽MT-1a的制备
1、蜂毒肽糖肽的底物肽的合成
蜂毒肽糖肽的底物肽(化合物1、化合物2和化合物3)结构如下：
本发明中
(1)化合物1的制备
取氨基树脂(Rink Amide树脂)526mg(载样量为0.38mmol·g
加20％哌啶-DMF溶液(0.1M 2-肟氰乙酸乙酯)至树脂完全淹没，25℃下振荡5min×2脱去树脂上的Fmoc，依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂5、5、3次。将序列中首个氨基酸(1mmol)、Oxyme(142mg，1mmol)和DIC(155.0μL，1mmol)混溶于6ml N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，加入到树脂中60℃下振荡20min，依次用DMF、DCM、DMF洗涤树脂5、5、3次。重复脱保护、耦合氨基酸步骤的做法，根据多肽序列：Ac-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKOrnQQ-NH
(2)化合物2的制备
根据多肽序列：Ac-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKOrnKRQQ-NH
(3)化合物3的制备
根据多肽序列：Ac-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKOrnKOrnQQ-NH
2、蜂毒肽糖肽的底物肽上鸟氨酸的保护基DDe的脱去
鸟氨酸在底物肽链中的简写为Orn，结构如下所示：
将底物肽上鸟氨酸的保护基DDe脱去，制备得到化合物4、化合物5和化合物6。化合物4、化合物5和化合物6的结构如下：
(1)化合物4的制备
向526mg干燥的含肽树脂(化合物1)，加入含2％水合肼的DMF溶液(10ml)，25℃下震荡反应三次，每次6min，反应完成后依次用DCM、DMF、无水乙醚洗涤树脂各3次，抽真空干燥树脂，得到化合物4。
(2)化合物5的制备
原料为含肽树脂(化合物2)，方法同化合物4的制备，得到化合物5。
(3)化合物6的制备
原料为含肽树脂(化合物3)，方法同化合物4的制备，得到化合物6。
3、蜂毒肽糖肽MT-1a的制备
(1)MT-1a粗品的制备
将263.2mg的含肽树脂(化合物4)放入50ml离心管中，加入硝酸银102mg、三乙胺278μl、半乳糖糖配体400mg以及DMF 10ml，室温下震荡反应12h，完成后依次用DMF、MeOH、DCM洗涤树脂5、5、3次，抽真空干燥树脂得到化合物7。
完成上述步骤后将263.2mg树脂(化合物7)与含5％水合肼的DMF溶液(10ml)混合，室温下震荡反应10h，脱掉糖配体上的乙酰基，完成后依次用DMF、H
向化合物8中加入TIPS：H
(2)MT-1a的纯化
将MT-1a粗品用乙腈和水(50％+50％，v/v)溶解，通过制备型RP-HPLC纯化。分离条件如下：
仪器：Pre-HPLC SD-1VARIAN高效液相色谱仪；
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ(250×20mml.D，S-10μm，12nm)；
流动相：流动相A为体积分数为0.1％TFA的水溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液；
步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，48％～75％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
最终制备得到MT-1a纯化品。
(3)产物的鉴别与结构分析
将上述制备得到的MT-1a通过HPLC进行鉴别以及HR-Q-TOF-MS(高分辨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)进行结构分析。色谱流动相为乙腈和水。流动相A为体积分数为0.1％TFA的水溶液，流动相B为体积分数为0.1％TFA的乙腈溶液，梯度洗脱(0～5min，流动相B：5％；5～30min，流动相B：5％～95％)；流速1.0mL·min
实施例2、本发明蜂毒肽糖肽MT-2a的制备
以含肽树脂(化合物5)263.2mg和半乳糖糖配体400mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-2a纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～68％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-2a纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图3)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图4所示。
实施例3、本发明蜂毒肽糖肽MT-3a的制备
以含肽树脂(化合物6)263.2mg和半乳糖糖配体800mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-3a纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～68％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-3a纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图5)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图6所示。
实施例4、本发明蜂毒肽糖肽MT-1b的制备
以含肽树脂(化合物4)263.2mg和N-乙酰氨基葡萄糖糖配体410mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-1b纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，40％～70％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-1b纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图7)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图8所示。
实施例5、本发明蜂毒肽糖肽MT-2b的制备
以含肽树脂(化合物5)263.2mg和N-乙酰氨基葡萄糖糖配体410mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-2b纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，40％～70％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-2b纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图9)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图10所示。
实施例6、本发明蜂毒肽糖肽MT-3b的制备
以含肽树脂(化合物6)263.2mg和N-乙酰氨基葡萄糖糖配体820mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-3b纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～68％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-3b纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图11)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图12所示。
实施例7、本发明蜂毒肽糖肽MT-1c的制备
以含肽树脂(化合物4)263.2mg和鼠李糖糖配体377mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-1c纯化品。纯化时步骤与参数：40％流动相B洗脱0～5min，40％～60％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-1c纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图13)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图14所示。
实施例8、本发明蜂毒肽糖肽MT-2c的制备
以含肽树脂(化合物5)263.2mg和鼠李糖糖配体377mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-2c纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～55％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-2c纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图15)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图16所示。
实施例9、本发明蜂毒肽糖肽MT-3c的制备
以含肽树脂(化合物6)263.2mg和鼠李糖糖配体754mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-3c纯化品。纯化时步骤与参数：37％流动相B洗脱0～5min，37％～60％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-3c纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图17)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图18所示。
实施例10、本发明蜂毒肽糖肽MT-1d的制备
以含肽树脂(化合物4)263.2mg和木糖糖配体368mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-1d纯化品。纯化时步骤与参数：40％流动相B洗脱0～5min，40％～70％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-1d纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图19)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图20所示。
实施例11、本发明蜂毒肽糖肽MT-2d的制备
以含肽树脂(化合物5)263.2mg和木糖糖配体338mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-2d纯化品。纯化时步骤与参数：40％流动相B洗脱0～5min，40％～70％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-2d纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图21)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图22所示。
实施例12、本发明蜂毒肽糖肽MT-3d的制备
以含肽树脂(化合物6)263.2mg和木糖糖配体736mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-3d纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～68％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-3d纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图23)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图24所示。
实施例13、本发明蜂毒肽糖肽MT-1e的制备
以含肽树脂(化合物4)263.2mg和葡萄糖糖配体400mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-1e纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～65％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-1e纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图25)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图26所示。
实施例14、本发明蜂毒肽糖肽MT-2e的制备
以含肽树脂(化合物5)263.2mg和葡萄糖糖配体400mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-2e纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～55％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-2e纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图27)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图28所示。
实施例15、本发明蜂毒肽糖肽MT-3e的制备
以含肽树脂(化合物6)263.2mg和葡萄糖糖配体800mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-3e纯化品。纯化时步骤与参数：35％流动相B洗脱0～5min，35％～50％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-3e纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图29)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图30所示。
实施例16、本发明蜂毒肽糖肽MT-1f的制备
以含肽树脂(化合物4)263.2mg和核糖糖配体368mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-1f纯化品。纯化时步骤与参数：36％流动相B洗脱0～5min，36％～60％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-1f纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图31)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图32所示。
实施例17、本发明蜂毒肽糖肽MT-2f的制备
以含肽树脂(化合物5)263.2mg和核糖糖配体368mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-2f纯化品。纯化时步骤与参数：40％流动相B洗脱0～5min，40％～65％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-2f纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图33)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图34所示。
实施例18、本发明蜂毒肽糖肽MT-3f的制备
以含肽树脂(化合物6)263.2mg和核糖糖配体736mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-3f纯化品。纯化时步骤与参数：35％流动相B洗脱0～5min，35％～50％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-3f纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图35)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图36所示。
实施例19、本发明蜂毒肽糖肽MT-1g的制备
以含肽树脂(化合物4)263.2mg和麦芽糖糖配体593mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-1g纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～50％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-1g纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图37)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图38所示。
实施例20、本发明蜂毒肽糖肽MT-2g的制备
以含肽树脂(化合物5)263.2mg和麦芽糖糖配体593mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-2g纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～55％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-2g纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图39)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图40所示。
实施例21、本发明蜂毒肽糖肽MT-3g的制备
以含肽树脂(化合物6)263.2mg和麦芽糖糖配体800mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-3g纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～60％流动相B洗脱5～60min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-3g纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度欠佳(图41)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图42所示。
实施例22、本发明蜂毒肽糖肽MT-1h的制备
以含肽树脂(化合物4)263.2mg和乳糖糖配体593mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-1h纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～60％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-1h纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图43)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图44所示。
实施例23、本发明蜂毒肽糖肽MT-2h的制备
以含肽树脂(化合物5)263.2mg和乳糖糖配体593mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-2h纯化品。纯化时步骤与参数：38％流动相B洗脱0～5min，38％～60％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-2h纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图45)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图46所示。
实施例24、本发明蜂毒肽糖肽MT-3h的制备
以含肽树脂(化合物6)263.2mg和乳糖糖配体800mg为原料，按照蜂毒肽糖肽MT-1a的制备方法制备并纯化得到MT-3h纯化品。纯化时步骤与参数：35％流动相B洗脱0～5min，35％～50％流动相B洗脱5～80min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
按照实施例1方法的对MT-3h纯化品进行鉴别和结构分析，经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备的蜂毒肽糖肽纯度>98％(图47)。通过HR-ESI-MS质谱仪分析结果如图48所示。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、抗菌活性实验
抗菌药物储存液的配制：将目标化合物用生理盐水配制成1024μg/ml待用。
抗菌药物的稀释：将抗菌药物储存液用M-H肉汤在96孔板中进行倍比稀释(含药肉汤系列的浓度范围应覆盖该药的敏感和耐药折点，以及质控菌的MIC范围)。
接种菌液：首先制备0.5麦氏浊度菌悬液，再用M-H肉汤或无菌生理盐水将上述菌悬液进行1：100稀释(浓度约10
设置对照孔：生长对照：不含抗菌药物的肉汤100μl和100ul稀释菌液；阴性对照：只加抗菌药物的肉汤200μ1以及不含抗菌药物的肉汤200μ1。
接种菌纯度检查：取一接种环上述稀释菌液划线接种在血琼脂平板上，置恒温培养箱于37℃培养以检查接种物的纯度。
孵育：接种好的含菌药混合物的96孔板放在恒温培养箱中37℃培养16～20小时。
检查对照孔：先观察细菌纯度，检测平板细茵生长情况，以确定其是否被污染。然后观察生长对照管细菌生长情况(应生长)。阴性对照管应无菌生长；检查质控茵株的MIC值是否处于相应的质控范围。
结果判读：无肉眼可见的细菌生长试管或孔的药物最高稀释度即为抑菌终点孔，其药物浓度即为MIC值。根据MIC的测定值，查阅CISI有关文件MIC解释标准，判定最终结果是耐药(R)、敏感(S)还是中介(I)。
结果见表1，发现本发明的部分蜂毒肽糖肽可以增强蜂毒肽抑制细菌的活性，其中MT-1a、MT-3a、MT-2c对Puzza Streptococcus的MIC值减少了一倍；MT-2d、MT-2h对E.coli的MIC值减少了一倍。说明这些蜂毒肽糖肽抑菌活性相比蜂毒肽有显著提高。
表1.抗菌活性结果表(MIC值μg/mL)
注：N/A表示未检测。
试验例2、溶血实验
红细胞悬液的制备：取生长状态良好的家兔血，置于事先处理过的涂有肝素的离心管中，2500r/min，10min，离心弃上层血浆，用等体积的PBS溶液洗涤沉淀，直至上层溶液澄清，用PBS缓冲液对血细胞液重悬，混匀，使其终浓度为2％。
样品浓度的稀释：用PBS对蜂毒肽糖肽进行稀释，配成浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml的工作液。
取干净的1.5ml离心管，进行编号，从一到六，每管加入先前处理的500μl的细胞悬液，设等体积的PBS为阴性对照组，阳性对照组为1％的TritonX-100。将上述配好的工作液依次加入试管中。37℃水浴1h，2500r/min，10min，离心取上层，测定OD
溶血率(％)＝[(OD
表2.各组蜂毒肽糖肽对兔红细胞的HC
注：N/A表示未检测，蜂毒肽原肽HC
溶血实验结果如表2和图49所示，该实验结果说明蜂毒肽糖肽的溶血副作用均比原肽要低，其中MT-3a、MT-1b、MT-3b、MT-3h的溶血性显著降低。
试验例3、细胞毒性试验
采用CCK-8法进行细胞毒性试验，选用人结直肠癌细胞(HCT-116)，设三组平行试验。
细胞培养：制备细胞悬液，细胞计数，接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数(约≥5×10
药液的加入：将铺好细胞的96孔板于37℃培养箱中培养，孵化24h后，加入含有多肽(浓度从100μM开始对半稀释，做5个梯度)的新鲜培养基继续孵化48h。
加入CCK-8溶液(0.1X)：37℃下孵化1-4h。使用酶标仪读取器于450nm波长处测量光密度(OD)。
细胞存活率(％)＝[(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)]×100％细胞毒性实验结果如图50所示，该实验结果说明化合物MT-3d、MT-1h、MT-2h的对人结直肠癌细胞毒性强于蜂毒肽原肽。表明这些蜂毒肽糖肽对人结直肠癌细胞的毒性大，抑制肿瘤细胞生长效果好。
综上，本发明成功制备得到一类蜂毒肽糖肽，且证明了该类蜂毒肽糖肽的溶血效果相比于蜂毒肽大大降低，有效解决了现有技术中蜂毒肽存在强溶血性的问题，有利于临床应用。同时，本发明制备得到的部分蜂毒肽糖肽抗菌活性以及抑制肿瘤细胞的活性显著优于蜂毒肽，在制备抗菌药物及抗肿瘤药物的研发领域具有良好的应用前景。