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用于生产芳香醇的方法

文献发布时间：2023-06-19 09:24:30

本发明是2014年9月19日申请的发明名称为“用于生产芳香醇的方法”的第201480051538.3号发明专利申请的分案申请。

技术领域

本领域涉及细胞色素P450s，及其生产倍半萜醇的用途。

背景技术

萜烃(比如α-檀香萜和β-檀香萜)通过生化途径(例如通过遗传改造的细胞)来生产。这些萜和源于该萜的醇是檀香油的主要组成成分，并且该醇是通常通过蒸馏檀香属物种(比如檀香木)的心材可商业获得的重要的香料成分。作为该醇的具体例，包括α-甜橙醇(α-sinensol)、β-甜橙醇(β-sinensol)、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反- 香柠檬醇和表-β-檀香醇。虽然发展出了新型生化途径(包括基因工程细胞)来生成萜烃，但仍期望发现一种生化途径来生成并生产源于檀香萜的醇。更进一步期望使用一种生化途径，其不仅能生成该醇，并且更期望能够通过该生化途径来选择性地生产该醇的顺式异构体，比如α-异甜橙醇(iso-α-sinensol)、β-异甜橙醇、(Z)-α- 檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(Z)-α-反-香柠檬醇和(Z)-表-β-檀香醇。

细胞色素P450s代表的是氧化酶类的酶族。P450s常用来催化单加氧酶反应。基于氨基酸序列的同源性，将细胞色素P450s酶分类为族和子族。相同子族的成员共享超过55％的氨基酸序列同一性并且具有通常相似的酶活性(底物和/或产物的选择性)。 CYP71AV1(NCBI登录号ABB82944.1,SEQ ID No.51和52)和 CYP71AV8(NCBI登录号ADM86719.1,SEQID No.1和2)是CYP71AV子族的两个成员，并且共享78％的氨基酸序列同一性。 CYP71AV1已被证明可氧化紫穗槐二烯(Teoh et al,FEBS letters 580 (2006)1411-1416)。CYP71AV8已被证明可氧化(+)-朱栾倍半萜、大根香叶烯A和紫穗槐二烯(Cankar et al,FEBSLett.585(1),178-182 (2011))。

已经报道有：在使用工程细胞的工序中，使用萜合酶来催化生产二萜或倍半萜。使用细胞色素P450多肽对该二萜或倍半萜进行进一步处理，从而催化由细胞产生的二萜或倍半萜的羟基化、氧化、脱甲基化或甲基化。

发明内容

本发明提供一种用于生产倍半萜醇的方法，包括：

i)使式(I)的萜烯与多肽接触，

该多肽具有与从由SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,SEQID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO: 34,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66,SEQ IDNO: 68,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81构成的群组中选出的多肽至少有约45％序列同一性的氨基酸序列；以及

ii)任选地分离上述醇，该醇中，R是由9个碳构成的饱和的、单不饱和或多不饱和脂肪族基团，并且R可以是支链或由一个或多个非芳族环组成。

本发明更进一步提供一种用于生产倍半萜醇的方法，该倍半萜醇包括α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇和表-β-檀香醇、澳白檀醇(lancelol)和/或它们的混合物，该方法包括：

i)使α-法呢烯、β-法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯、表-β-檀香萜和/或β-甜没药烯与多肽接触，从而生产醇，该多肽具有与从由SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQID NO:6,SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQID NO: 36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO: 71,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:79和SEQ IDNO:81构成的群组中选出的多肽至少有约45％序列同一性的氨基酸序列；

ii)任选地分离上述醇。

本发明还提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β- 檀香醇,α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α-檀香萜、β- 檀香萜、α-反-香柠檬烯、表-β-檀香萜和/或β-甜没药烯与具有P450s 单加氧酶活性的多肽接触，所生产出的倍半萜醇包含至少约36％的顺式异构体。

本发明更进一步提供一种分离的多肽，其具有单加氧酶活性并且包含氨基酸序列，该氨基酸序列与从由SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73构成的群组中选出的氨基酸序列有至少约45％、50％、 55％、50％、65％、70％、80％、90％、95％、98％或更多的同一性。

本发明更进一步提供一种分离的多肽，其具有单加氧酶活性并且包含氨基酸序列，该氨基酸序列与从由SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81构成的群组中选出的氨基酸序列有至少约45％、50％、 55％、50％、65％、70％、80％、90％、95％、98％或更多的同一性。

本发明还提供一种分离的多肽，其具有单加氧酶活性并且包含从由SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:71,SEQ IDNO:73,SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81构成的群组中选出的氨基酸序列。

本发明更进一步提供一种用于生产倍半萜醇的方法，该倍半萜醇从由α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇和澳白檀醇或它们的混合物构成的群组中选出，该方法包括：

i)在适合于生产具有单加氧酶活性的p450多肽的条件下培养细胞，其中，该细胞：

a)生产丙烯酸焦磷酸酯萜前体；

b)表达P450还原酶；

c)表达具有α-法呢烯、β-法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反 -香柠檬烯和/或表-β-檀香萜的合酶活性，并且生产α-法呢烯、β- 法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜的多肽；并且

d)表达具有氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与从由SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO: 52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ IDNO:64,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:79和SEQID NO:81构成的群组中选出的多肽至少有约 45％的序列同一性；并且

ii)任选地从该细胞中分离上述醇。

附图说明

具体实施方式

在一些实施方案中，提供一种用于生产倍半萜醇的方法，该倍半萜醇包括α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反- 香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/或它们的混合物，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：2有至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或 98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：4有至少约45％、50％、55％、60％、65％、 70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：6有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：8有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：28有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：30有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：32有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：34有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：36有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：38有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：40有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：42有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：44有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：50有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：52有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：54有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：58有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：60有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：62有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：64有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：66有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：68有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：71有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：73有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：79有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

在一些实施方案中，提供一种生产α-甜橙醇、β-甜橙醇、α- 檀香醇、β-檀香醇、α-反-香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/ 或它们的混合物的方法，该方法包括：使α-法呢烯、β-法呢烯、α- 檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜与多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO：81有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，该方法包含一种表达上述多肽的细胞。

本发明提供的用于生产多肽(其用于生产醇)的核苷酸序列具有与从由SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41,SEQ IDNO:43,SEQ ID NO: 49,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:59,SEQID NO:61,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:80构成的群组中选出的序列至少有约45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的核酸序列。本发明所提供的核苷酸序列是异源的，因为它们不是典型地也不是通常地由表达于其中的细胞来制造，并且其相对于其所引入的细胞通常不是内源的–其典型地从另一个细胞获得或可以合成出。

在另一实施方案中，提供一种用于生产倍半萜醇的方法，该倍半萜醇包括α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反- 香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/或它们的混合物，该方法包括：使反-α-法呢烯、反-β-法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯、表-β-檀香萜和/或β-甜没药烯与具有P450单加氧酶活性的多肽接触，所生产出的倍半萜醇包含至少约36％的顺式异构体，上述多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列与具有从由SEQID NO:28, SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO: 64,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73构成的群组中选出的氨基酸序列的多肽有至少约45％、50％、55％、60％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％的序列同一性。

在另一实施方案中，提供一种用于生产倍半萜醇的方法，该倍半萜醇包括α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反- 香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/或它们的混合物，该方法包括：使反-α-法呢烯、反-β-法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯、表-β-檀香萜和/或β-甜没药烯与具有P450单加氧酶活性的多肽接触，所生产出的倍半萜醇包含至少约46％的顺式异构体，上述多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列与具有从由SEQID NO:30, SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO: 68,SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73构成的群组中选出的氨基酸序列的多肽有至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、 95％或98％的序列同一性。

在另一实施方案中，提供一种用于生产倍半萜醇的方法，该倍半萜醇包括α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反- 香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/或它们的混合物，该方法包括：使反-α-法呢烯、反-β-法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯、表-β-檀香萜和/或β-甜没药烯与具有P450单加氧酶活性的多肽接触，所生产出的倍半萜醇包含至少约50％的顺式异构体，上述多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列与具有从由SEQID NO:58, SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73构成的群组中选出的氨基酸序列的多肽有至少约45％、 50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或98％的序列同一性。

在另一实施方案中，提供一种用于生产倍半萜醇的方法，该倍半萜醇包括α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反- 香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/或它们的混合物，该方法包括：使反-α-法呢烯、反-β-法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯、表-β-檀香萜和/或β-甜没药烯与具有P450单加氧酶活性的多肽接触，所生产出的倍半萜醇包含至少约72％的顺式异构体，上述多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列与含有从由SEQID NO:58, SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73构成的群组中选出的氨基酸序列的多肽有至少约45％、 50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或98％的序列同一性。

在另一实施方案中，提供一种用于生产倍半萜醇的方法，该倍半萜醇包括α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反- 香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/或它们的混合物，该方法包括：使反-α-法呢烯、反-β-法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯、表-β-檀香萜和/或β-甜没药烯与具有P450单加氧酶活性的多肽接触，所生产出的倍半萜醇包含至少约96％的顺式异构体，上述多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列与具有从由SEQID NO: 68,SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73构成的群组中选出的氨基酸序列的多肽有至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、 90％、95％或98％的序列同一性。

在另一实施方案中，提供一种用于生产倍半萜醇的方法，该倍半萜醇包括α-甜橙醇、β-甜橙醇、α-檀香醇、β-檀香醇、α-反- 香柠檬醇、表-β-檀香醇、澳白檀醇和/或它们的混合物，该方法包括：使反-α-法呢烯、反-β-法呢烯、α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯、表-β-檀香萜和/或β-甜没药烯与具有P450单加氧酶活性的多肽接触，所生产出的倍半萜醇包含至少约100％的顺式异构体，上述多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列与具有从由SEQID NO:71和SEQ ID NO:73构成的群组中选出的氨基酸序列的多肽有至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或98％的序列同一性。

还提供一种分离的核酸分子，其从如下构成的群组中选出：i) 具有从由SEQ IDNO:70和SEQ ID NO:72构成的群组中选出的核酸序列的核酸；以及ii)核酸分子，其编码具有P450单加氧酶活性的多肽，该多肽包含与从由SEQ ID NOs:71和SEQ ID NO:73 构成的群组中选出的氨基酸序列有至少约45％、50％、55％、50％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％或更多的同一性的氨基酸序列。更特别的是，所编码的多肽具有从由SEQ ID NOs:71和SEQ ID NO:73构成的群组中选出的序列。

还提供一种分离的核酸分子，其从如下构成的群组中选出：i) 具有从由SEQ IDNO:78和SEQ ID NO:80构成的群组中选出的核酸序列的核酸；以及ii)核酸分子，其编码具有P450单加氧酶活性的多肽，该多肽包含与从由SEQ ID NOs:79和SEQ ID NO:82 构成的群组中选出的氨基酸序列有至少约45％、50％、55％、50％、 65％、70％、80％、90％、95％或98％或更多的同一性的氨基酸序列。更特别的是，所编码的多肽具有从由SEQ ID NOs:79和SEQ ID NO:82构成的群组中选出的序列。

还提供一种分离的核酸分子，其从如下构成的群组中选出：i) 具有从由SEQID.NO:27,29,31,33和35构成的群组中选出的核酸序列的核酸；以及ii)核酸分子，其编码具有P450单加氧酶活性的多肽，该多肽具有从由SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36构成的群组中选出的序列。

在另一实施方案中提供一种用于生产具有P450单加氧酶活性的多肽的方法，该方法包括：把核酸转化到宿主细胞或非人类生物体的步骤，该核酸编码与从由SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73 构成的群组中选出的多肽有至少约45％、50％、55％、50％、65％、 70％、80％、90％、95％或98％的序列同一性的多肽；以及在允许生产该多肽的条件下培养该宿主细胞或生物体的步骤。

在更进一步的实施方案中提供一种用于生产具有P450单加氧酶活性的多肽的方法，该方法包括：把核酸转化到宿主细胞或非人类生物体的步骤，该核酸编码具有从由SEQID NO:71和SEQ ID NO:73构成的群组中选出的序列的多肽；以及在允许生产该多肽的条件下培养该宿主细胞或生物体的步骤。

在另一实施方案中提供一种用于生产具有P450单加氧酶活性的多肽的方法，该方法包括：把核酸转化到宿主细胞或非人类生物体的步骤，该核酸编码与从由SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81 构成的群组中选出的多肽有至少约45％、50％、55％、50％、65％、 70％、80％、90％、95％或98％的序列同一性的多肽；以及在允许生产该多肽的条件下培养该宿主细胞或生物体的步骤。

在更进一步的实施方案中提供一种用于生产具有P450单加氧酶活性的多肽的方法，该方法包括：把核酸转化到宿主细胞或非人类生物体的步骤，该核酸编码具有从由SEQID NO:79和SEQ ID NO:81构成的群组中选出的序列的多肽；以及在允许生产该多肽的条件下培养该宿主细胞或生物体的步骤。

上述醇可以转化成醛或羧酸，例如但不限于甜橙醛、檀香醛，香柠檬醛和澳白檀醛(lanceals)。所述醇、醛或酸可以进一步转化为衍生物，例如但不限于酯、酰胺、糖苷、醚或缩醛。

本发明所述的核酸和多肽可以分离自比如菊苣(Cichorium intybus L.)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、檀香树(Santalum Album) 和黄花蒿(Artemisia annua)。CYP71AV8,P450-BM3(CYP102A1)和 CYP71AV1包括变体均描述于此。

来自于植物菊苣(Cichorium intybus L.)的CYP71AV8已被定性为可区域选择性地氧化(+)-朱栾倍半萜生产反-诺卡醇、顺-诺卡醇和(+)-诺卡酮的P450单加氧酶。CYP71AV8也被发现催化大根香叶烯A和紫穗槐-4,11-二烯在C-12位置处的氧化(Cankar etal, FEBS Lett.585(1),178-182(2011))。野生型酶的氨基酸序列(NCBI登录号 NoADM86719.1,SEQ ID No 1和2)被用作设计在大肠杆菌(E.coli)中最优化表达的cDNA序列。

在真核生物中，P450单加氧酶是膜结合蛋白，并且这些蛋白质的N末端序列构成的膜锚定对这些酶的膜定位是至关重要的。蛋白质的这部分通常被富含脯氨酸结构域所划定，其对于酶活性的特异性的控制并不十分重要。因此，这个区域可以通过缺失、插入或突变进行修饰，而对催化活性不产生影响。然而，包含植物P450s的真核细胞色素P450s的N末端区域的特定修饰已经显示出在微生物中表达时具有对功能性重组蛋白的层级具有积极影响(Halkier et al(1995)Arch.Biochem.Biophys.322,369-377；Haudenschield et al(2000)Arch.Biochem.Biophys.379,127-136)。

在P450单加氧酶中，底物的识别和结合由被分布在蛋白质氨基酸序列的不同区域的几个氨基酸残基来控制。被定义为底物识别位点(SRS)的这些区域可以通过基于Gotoh所做的具体工作的简单的序列比对而被定位于任何P450的氨基酸序列中(Gotoh O(1992)J.Biol.Chem.267(1),83-90)。因此，在与底物相互作用并可以影响羟基化反应的区域选择性的CYP71AV8蛋白质残基为氨基酸Asn98 到Gly121、Thr198到Leu205、Lys232到Ile240、Asn282到Ala300、His355 到Arg367以及Thr469到Val 476。在这些区域内的一个或多个残基的修饰可以潜在地改变底物的特异性、其反应的立体化学性或者其区域选择性。作为通过P450来催化的反应的立体化学性的改变可见于Schalk et al(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(22),11948-11953。在该出版物中，植物P450酶的单个残基的变化会导致酶反应的区域专一性完全转变。

在这里“倍半萜合酶”或“具有倍半萜合酶活性的多肽”是指作为本申请的多肽，该多肽能够催化由从香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)构成的组中选出的无环焦磷酸萜前体合成为倍半萜分子或倍半萜分子的混合物。

α-檀香萜、β-檀香萜、α-反-香柠檬烯和/或表-β-檀香萜可通过例如美国专利公开号2011-0008836(公开日：2011年1月13日) 以及美国专利公开号2011-0281257(公开日：2011年11月27日) 中所述的合酶来制备，这两篇文献的整体并入于此。

根据本发明，多肽也意味着包括截短的多肽，条件是它们能够保持如任何上述实施方案所定义的P450单加氧酶活性。

在两个肽或核苷酸序列之间的同一性百分比是在已经生成这两个序列的比对时，在这两个序列中相同的氨基酸或核苷酸残基数目的函数。相同的残基定义为在这两个序列中在给定的比对位置上相同的残基。在此处使用的序列同一性的百分比是由最优比对，通过将在两个序列之间的相同残基的数目除以在最短的序列中的残基的总数然后乘以100而计算得到的。该最佳比对是同一性百分比可能是最高的比对。在该比对的一个或多个位置中的一或两个序列中引入间隙以便获得最佳比对。然后在序列同一性的百分比计算中将这些间隙作为不相同的残基来考虑。

以测定氨基酸或核酸序列同一性的百分比为目的的比对可以使用计算机程序以多种方式来实现，例如在万维网上可获得的公开可用的计算机程序。优选，可使用来自National Center for Biotechnology Information(NCBI)的地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi 的BLAST程序(Tatiana等,FEMSMicrobiol Lett.,1999,174:247-250, 1999)，其参数设为默认，来获得肽或核苷酸序列的最优比对，以及来计算序列同一性的百分比。

特定的生物体或细胞，当其天然产生FPP时，或当其并不天然产生FPP但可经转化以产生FPP时，不管是用描述于此的核酸转化之前还是与所述核酸一起都意味着“能够产生FPP”。经转化的与天然存在的生物体或细胞相比产生更高量FPP的生物体或细胞也包括在“能够产生FPP的生物体或细胞”内。转化生物体(例如微生物)以便它们产生FPP的方法已经是本领域公知的。这些方法可以例如在文献中找到，例如在下列出版物中：Martin,V.J.,Pitera， D.J.,Withers,S.T.,Newman,J.D.和Keasling,J.D.Nat Biotechnol.,2003,21(7), 796-802(大肠杆菌(E.coli)的转化)；Wu,S.,Schalk,M.,Clark,A.,Miles,R.B.,Coates,R.和Chappell,J.,Nat Biotechnol.,2006,24(11),1441-1447(植物的转化)；Takahashi,S.,Yeo,Y.,Greenhagen,B.T.,McMullin,T.,Song,L., Maurina-Brunker,J.,Rosson,R.,Noel,J.,Chappell,J,Biotechnology andBioengineering,2007,97(1),170-181(酵母的转化)。

适合于在体内进行本发明方法的非人宿主生物体可以是任何非人的多细胞或单细胞生物体。在优选的实施方案中，用于在体内进行本发明的非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。可以使用任何植物、原核生物或真菌。特别地，可使用的植物是天然产生高数量萜的植物。在更优选的方案中，该植物选自茄科 (Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科 (Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)。例如，该植物选自烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica(油菜))、苜蓿属 (Medicago(紫花苜蓿))、棉属(Gossypium(棉花))、蒿属(Artemisia)、鼠尾草属(Salvia)和薄荷属(Mentha)。优选，该植物属于烟草(Nicotiana tabacum)种。

在更优选的实施方案中，用于在体内进行本发明方法的非人宿主生物体是微生物。可以使用任何微生物，但是根据更加优选的实施方案，所述微生物是细菌或酵母。最优选，所述细菌是大肠杆菌(E.coli)，所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

这些生物体中的一些天然不会产生FPP。为了适于进行本发明的方法，必须将这些生物体转化以产生所述前体。如以上所述，用上述任何实施方案描述的用核酸修饰之前或者同时，可以将它们原样转化。

还可以使用分离的高等真核细胞代替完整生物体作为宿主以便在体内实施本发明的方法。适合的真核细胞可以是任何非人的细胞，但是优选是植物细胞或真菌细胞。

在此处所使用的多肽指的是包含于此处标明的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或变体多肽，条件是它们保持如以上定义的P450单加氧酶活性，而且它们与相应的多肽共有至少所定义的百分比的同一性。

变体多肽的实例是由选择性mRNA剪接或如此处所述形成多肽蛋白酶剪切而得到的天然存在的蛋白质。可归因于蛋白水解的变体包括，例如，当在不同类型的宿主细胞中表达时，由于从本发明多肽上蛋白水解移除一个或多个末端氨基酸而导致在N-或C- 末端的差异。本发明也包含如后所描述的用由本发明核酸的天然或人工突变而获得的核酸编码的多肽。

由在氨基和羧基末端融合另外的肽序列而产生的多肽变体也可用于本发明的方法。尤其是这样的融合可以提高多肽的表达，在期望的环境或表达系统中利于蛋白质的提纯或多肽酶活性的改善。这种另外的肽序列可以例如是信号肽。因此，本发明包含使用变体多肽的方法，例如通过与其它寡肽或多肽融合而获得的多肽和/或与信号肽连接的多肽。在本发明的方法中有利地还可以使用由与另外的功能蛋白(例如来源于萜生物合成路径的另外的蛋白质)融合而产生的多肽。

此处所使用的多肽指的是含有此处确定的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或变体多肽，条件是它们保持如上定义的活性。

变体多肽的实例是由选择性mRNA剪接或此处所述形成多肽蛋白酶剪切而得到的天然存在的蛋白质。可归因于蛋白水解的变体包括，例如，当在不同类型的宿主细胞中表达时，由于从本发明多肽上蛋白水解去移除一个或多个末端氨基酸而导致在N-或C- 末端的差异。本发明还包含用如后所描述的由本发明核酸的天然或人工突变而获得的核酸编码的多肽。

由另外的肽序列在氨基和羧基末端融合而产生的多肽变体也包含于本发明的多肽之中。尤其是这样的融合可以在期望的环境或表达系统中提高多肽的表达，利于蛋白质的提纯或多肽酶活性的改善。这种另外的肽序列可以例如为信号肽。因此，本发明包括本发明的多肽的变体，例如通过与其它寡肽或多肽融合而获得的多肽变体和/或与信号肽连接的那些多肽变体。本发明的多肽还可以包括由与另外的功能蛋白(例如来源于萜生物合成路径的另外的蛋白质)融合而产生的多肽。

本发明的核酸可以定义为包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物(DNA和/或RNA)。术语“核苷酸序列”也应该被理解为包括分离片段形式或作为较大核酸组分的聚核苷酸分子或寡核苷酸分子。本发明的核酸还包含某些分离的核苷酸序列，其包括基本上不污染内源材料的那些核苷酸序列。本发明的核酸可以是截短的，条件是其编码本发明包含的如上所述的多肽。

另一个用于转化适于在体内实施本发明方法的宿主生物体或细胞的重要工具是包括本发明任何实施方案的核酸的表达载体。因此这种载体也是本发明的目的之一。

如此处所使用的“表达载体”包括任何直线的或环状的重组载体，其包括但不限于病毒载体、噬菌体和质粒。技术人员能够根据表达系统选择适合的载体。在一个实施方案中，该表达载体包括本发明的核酸，其可操作地连接到至少一种控制转录、翻译、开始和终止的调节序列，如转录的启动子、操纵子或增强子，或mRNA核糖体的结合部位，并且非强制选择地包括至少一种选择标记。当该调节序列功能上与本发明的核酸相关时，该核苷酸序列是“可操作地连接的”。

本发明的表达载体可在如下进一步公开的用于在包藏本发明核酸的宿主生物体和/或细胞中制备遗传转化的宿主生物体和/或细胞的方法和生产或制造具有P450单加氧酶活性的多肽的方法中使用。

经转化以包藏本发明至少一种核酸以便使其异源表达或过表达本发明至少一种多肽的重组非人宿主生物体和细胞也是实施本发明方法的十分有用的手段。因此，这种非人宿主生物体和细胞是本发明的另一个目的。

根据任何上述实施方案的核酸可用于转化该非人宿主生物体和细胞并且所表达的多肽可以是任何上述的多肽。

适合于在体内进行本发明方法的非人宿主生物体可以是任何非人的多细胞或单细胞生物体。在优选的实施方案中，非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。可以使用任何植物、原核生物或真菌。特别地，可使用的植物是天然产生高数量萜的植物。在更优选的方案中，该植物选自茄科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)。例如，该植物选自烟草属 (Nicotiana)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica(油菜))、苜蓿属(Medicago(紫花苜蓿))、棉属(Gossypium(棉花))、蒿属(Artemisia)、鼠尾草属(Salvia)和薄荷属 (Mentha)。优选，该植物属于烟草(Nicotiana tabacum)种。

分离的高等真核细胞还可以经转化以代替完整生物体。作为高等真核细胞，可以是除酵母细胞外的任何非人的真核细胞。特别优选的高等真核细胞是植物细胞或真菌细胞。

术语“经转化”是指宿主经过遗传工程以便使其含有上述任何实施方案中所需要的每个核酸的一个、两个或更多个拷贝。优选地，术语“经转化”涉及异源表达由该核酸编码的多肽(该多肽使用所述核酸转化)以及过表达所述多肽的宿主。因此，在实施方案中，本发明提供了经转化的生物体，其中该多肽的表达量高于未经如此转化的相同生物体的表达量。

现有技术中已知有多种方法用于生成转基因宿主生物体或细胞，如植物、真菌、原核生物，或高等真核生物体的细胞培养物。适用于细菌、真菌、酵母、植物和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体的描述参见例如Pouwels等的Cloning Vectors：A LaboratoryManual,1985,Elsevier,New York和Sambrook等的Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。尤其是用于高等植物和/或植物细胞的克隆和表达载体是技术人员可以得到的。参见例如Schardl等的Gene 61:1-11,1987。

转化宿主生物体或细胞以使其包藏转基因核酸的方法为技术人员所熟知。对于生产转基因植物，例如通用的方法包括：植物原生质体的电穿孔法、脂质体介导的转化法、土壤杆菌介导的转化法、聚乙二醇介导的转化法、粒子轰击法、植物细胞的显微注射法和应用病毒的转化法。

在一个实施方案中，转化的DNA被整合到非人宿主生物体和 /或细胞的染色体中，从而得到稳定的重组体系统。现有技术中任何公知的染色体整合方法可以应用于本发明的实践中，包括但不限定为重组酶介导的盒式交换(RMCE)、病毒位点特异性染色体插入法、腺病毒法和核内注射法。

“多肽变体”这里指的是这样一种多肽，其具有如上所述的活性且基本上与根据任何上述实施方案的多肽同源，但是其具有的氨基酸序列因为一处或多处缺失、插入或取代而不同于由本发明任一核酸所编码的氨基酸序列。

变体可以包括保守取代序列，意味着某一特定氨基酸残基被一具有类似理化特性的残基所取代。保守取代的实例包括：用一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基，例如，Ile、Val、Leu或Ala 之间相互取代；或者用一个极性残基取代另一个极性残基，例如在Lys和Arg之间、Glu和Asp之间，或Gln和Asn之间相互取代。参见Zubay,Biochemistry,1983,Addison-Wesley Pub.Co.。这类取代的效果可以用取代打分矩阵，如Altschul,J.Mol.Biol.,1991,219, 555-565中所述的PAM-120、PAM-200和PAM-250来计算。其他这类保守取代，例如具有近似疏水特性的完整区域的取代，已为本领域熟知。

天然生成的肽变体也包含在本发明范围之内。这种变体的实例是由于选择性mRNA剪接或者本文所述多肽的蛋白酶剪切而得到的蛋白质。蛋白水解引起的变体包括，例如，在不同类型宿主细胞中表达时，由本发明序列编码的多肽由于蛋白水解移除了一个或多个末端氨基酸而导致N-或C-末端的差异。

本发明多肽的变体可以用于获得例如酶活性期望的增强或减弱、区域化学(regiochemistry)或立体化学的修饰、或者底物利用或者产物分配的改变、对于底物的亲和力的增加、一种或多种想得到化合物的产量的改进的特异性、酶反应速率的增加、在特定环境(pH、温度、溶剂等等)中的更高活性或稳定性、或者在想要的表达系统中的改进的表达水平。变体或定位突变体可以通过现有技术已知的任何方法来生成。天然多肽的变体和衍生物能够通过分离其它或相同植物品系或物种(例如来自檀香属物种的植物)的天然产生的变体或者变体的核苷酸序列来获得，或者通过对编码本发明多肽的核苷酸序列进行人工规划突变来获得。天然氨基酸序列的改变可通过多种传统方法中的任一种完成。

由附属肽序列在本发明多肽的氨基和羧基末端融合产生的多肽变体可被用于增强多肽的表达，在期望的环境或表达系统中利于蛋白的纯化或提高多肽的酶活性。这种附属肽序列例如可为信号肽。因此，本发明包含本发明多肽的变体，例如通过与其它寡肽或多肽和/或连接到信号肽上的多肽融合获得的那些变体。包含在本发明范围内的融合多肽还包括由融合其它功能蛋白质如来自萜生物合成路径的其它蛋白质而产生的融合多肽。

本发明生产出的上述醇可以通过提取而从在自然界中产生的醇中分离，例如使用公知的方法来提取(例如，从檀香木中提取)。本发明产生出的醇用作可用于香料的芳香化合物。

aaCPR 黄花蒿(Armisia annua)细胞色素P450还原酶

Bp 碱基对

Kb 千碱基

DNA 脱氧核糖核酸

cDNA 互补DNA

ClASS 黄皮(Clausena lansium)(+)-α-檀香萜合酶

CPRm 椒样薄荷(Mentha piperita)细胞色素P450还原酶

DTT 二硫苏糖醇

EDTA 乙二胺四乙酸

FPP 法呢基焦磷酸

GC 气相色谱

IPTG 异丙基-D-硫代半乳糖苷

LB 溶菌肉汤

MS 质谱

MTBE 甲基叔丁基醚

PCR 聚合酶链式反应

RMCE 重组酶介导的盒式交换

RNA 核糖核酸

mRNA 信使核糖核酸

SaSAS 檀香树(Santalum album)(+)-α-檀香烯/(-)-β-檀香烯合酶

下述实施例仅为示例，并不意味着限制本发明的发明内容、说明书或权利要求书中所规定的范围。

实施例

优化的CYP71AV8 cDNA序列在细菌中的表达

CYP71AV8的膜锚定区域被重新设计以引入如下所示的修饰。

在优化的CYP71AV8序列中，修饰5’-末端以将膜锚定区域的首个氨基酸替代为显示出提升在细菌细胞中膜结合P450s的异源表达性的多肽序列(Alkier,B.A.etal.Arch.Biochem.Biophys.322,369-377 (1995),Haudenschield,et alArch.Biochem.Biophys.379,127-136(2000))。此外，作为整个cDNA，密码子的使用适于匹配大肠杆菌(E.coli)密码子的使用。因此，多个cDNA’被设计为与CYP71AV8不同的3’末端修饰和优化：

-CYP71AV8-65188:在此结构中，前22个密码子被用于编码MALLLAVFWSALIILV肽的序列代替(SEQ ID NO 3和4)。

-CYP71AV8-P2:整个锚定编码序列被源于薄荷 (Haudenschield,et alArch.Biochem.Biophys.379,127-136(2000)中的PM2) 的优化的柠檬烯羟化酶的锚定序列代替(SEQ ID NO 5和6)。

CYP71AV8-P2O:该结构编码与上述结构相同的蛋白质，但膜锚定区域更进一步进行了密码子优化(SEQ ID NO 7和8)。

在图1中，比较不同的CYP71AV8变体的N-末端区域的氨基酸序列，在图2中，比较三种结构的DNA序列。该三种优化的 CYP71AV8 cDNA在体内合成(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)，并且克隆为NdeI-HindIII片段插入于pCWori表达质粒(Barnes,H.J. MethodEnzymol.272,3-14；(1996))。

在细菌细胞中CYP71AV8的功能性表达

对于异源表达，将CYP71AV8表达质粒转化到JM109大肠杆菌细胞(实施例1)。将转化体的单菌落用在含50μg/mL氨苄青霉素的5毫升LB培养基的接种培养物上。在37℃使细胞生长10～12 小时。然后将培养物接种到添加了50μg/m氨苄青霉素和1mM硫胺盐酸盐的250毫升TB培养基(极品肉汤)中。该培养物在28℃以适当摇动(200rpm)下温育3～4小时，之后添加75毫克/升δ-氨基乙酰丙酸(σ)和1mM IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)，然后在 28℃以200rpm摇动下将培养物保持24～48小时。

P450酶的表达可以定性评估，并通过大肠杆菌的蛋白组成的 CO结合光谱(Omura,T.&Sato,R.(1964)J.Biol.Chem.239,2379-2387)定量测量。对于蛋白提取，将细胞离心(10分钟，5000g，4℃)并在 35毫升冰的缓冲液1(100mM的Tris-HCl，pH 7.5，20％甘油，0.5mMEDTA)中重悬。添加1体积的于水中的0.3mg/ml溶菌酶 (Sigma-Aldrich)，并在4℃搅拌该悬浮液10～15分钟。在4℃将悬浮液于7000g离心10分钟，将粒状物在20ml缓冲液2(25mMKPO

按照此步骤，测定了重组CYP71AV8在450nm处具有最大吸光度的典型的CO光谱，验证了正确折叠形成有功能P450酶。

在细菌中CYP71AV8与植物P450还原酶的共表达

为了重组植物p450的活性，第二膜蛋白的存在是必要的。该蛋白，即P450还原酶(CPR)，参与到将电子从辅助因子NAPDH(还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)转移到P450活性位点。已经表明来自一种植物的CPR可以完善来自另一植物的P450酶的活性(Jensen和Moller(2010)Phytochemsitry 71,132-141)。多个编码 CPRDNA序列已被报道来自不同的植物。我们首先选择一个分离自椒样薄荷(Mentha piperita)(CPRm,未公开数据,SEQ ID NO 10) 的CPR，优化全长cDNA的密码子使用(SEQ ID No 9)，并且将其克隆至pACYCDuet-1表达质粒(Novagen)的NcoI和HindIII限制性位点以提供质粒pACYC-CPRm。

使用pCWori-CYP71AV8-65188和pACYCDuet-CPRm这两种质粒在大肠杆菌细胞中共表达CYP71AV8和CPRm。将这两种质粒共转化到BL21 Star

采用表达CYP71AV8的大肠杆菌细胞进行的(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α-反-香柠檬烯和(+)-表-β-檀香萜的生物转化

如上所述采用被改造成根据异源甲羟戊酸途径生产法呢基二磷酸(FPP)并表达植物的倍半萜合酶的大肠杆菌细胞来制备在生物转化测定中用作底物的不同的倍半萜烃类。该大肠杆菌宿主细胞的改造以及应用如专利WO2013064411或Schalk et al(2013)J.Am.Chem.Soc.134,18900-18903所述。简而言之，制备表达质粒使其含两个操纵子，该操纵子由编码完整的甲羟戊酸途径的基因的酶组成。体外合成第一合成的操纵子(DNA2.0，MenloPark，CA，USA)，该操纵子由大肠杆菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶(atoB)、金黄色葡萄球菌的HMG-CoA合酶(mvaS)、金黄色葡萄球菌HMG-CoA还原酶 (mvaA)和酿酒酵母FPP合酶(ERG20)基因组成，并将其连接到用 NcoI-BamHI消化的pACYCDuet-1载体(Invitrogen)上，得到 pACYC-29258。包含甲羟戊酸激酶(MvaK1)、磷酸甲激酶 (MvaK2)、甲羟戊酸磷酸脱羧酶(MvaD)和异戊烯基二磷酸异构酶(idi)的第二操纵子扩增自肺炎链球菌(ATCCBAA-334)的基因组 DNA，并且将该第二操纵子连接到pACYC-29258的第二多克隆位点以提供质粒pACYC-29258-4506。因此，这种质粒包含编码引起乙酰辅酶A变为FPP的生物合成途径的任何酶的基因。质粒 pACYC-29258-4506与质粒pET101-Cont2_1(包含编码黄皮 (Clausena lansium)(+)-α-檀香萜合酶(ClASS)的cDNA,WO2009109597) 或者质粒pETDuet-SCH10-Tps8201-opt(包含编码檀香树(Santalum album)(+)-α-檀香萜/(-)-β-檀香萜合酶(SaSAS)的cDNA,WO2010067309)共转化到大肠杆菌细胞(BL21 Star

通过在使用上述作为底物列出的倍半萜分子的大肠杆菌中的生物转化来评价CYP71AV8的酶活性。如实施例3所述那样培养并获取用pACYCDuet-CPRm和pCWori-CYP71AV8-65188转化的 BL21 Star

在这些条件下，观察到(+)-α-檀香萜的氧化。转化的主要产物是(E)-α-檀香醇。检测到通过大肠杆菌内源性酶从(E)-α-檀香醇的转化而成的其他产物：(E)-α-檀香醛(通过醇脱氢酶而产生)和 (E)-α-二氢檀香醇(通过烯酸还原酶而产生)(图3A)。相似的，使用(+)-α-檀香萜或(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α-反-香柠檬烯和(+)-表-β-檀香萜的混合物作为底物，观察到(E)-α-檀香醇、 (E)-β-檀香醇,(E)-α-反-香柠檬醇和(E)-表-β-檀香醇的形成，也获得了更进一步的代谢产物(图3B)。本实施例表明CYP71AV8可用于(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜以及相似结构的分子的末端氧化。

从单种质粒中构建合成操纵子以共表达CYP71AV8和CPR

数个双顺反子操纵子被设计为在特殊的启动子的控制下从单种质粒中表达P450酶和CPR。优化的CYP71AV8 cDNAs的三种变体(实施例1)与两种CPR cDNAs结合:密码子优化的CPRm cDNA(实施例2)以及用于编码黄花蒿(Artemisia annua)CPR(NCBI 登录号ABM88789.1,SEQ ID No 12)的密码子优化的cDNA(Seq ID No 11)。因此，设计出六种结构(Seq ID No 13-18)，每种结构均包含P450 cDNA，接下来是包括核糖体结合位点的接头序列(RBS) 和CPR cDNA(图4)。该结构通过PCR来制备:P450和CPR cDNAs 是分别扩增的，并具有5’和3’突出端(overhang)，其适于在pCWori+ 质粒的NdeI-HindIII位点中采用In-

为了评价不同N末端修饰对P450s和与CPRs耦合的影响,将六种质粒转入到大肠杆菌BL21 Star

在工程细胞中体内生产含氧倍半萜

(+)-α-檀香萜和(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α-反-香柠檬烯、(+)-表-β-檀香萜或其它相似结构的分子的氧化产物也可直接产自被改造成从比如葡萄糖或甘油的碳源来生产倍半萜的大肠杆菌细胞。制备出包含由P450、CPR和萜类合成酶构成的合成操纵子的pCWori+质粒构成的质粒(Barnes H.J(1996)Method Enzymol.272, 3-14)。作为P450,采用CYP71AV8-P2或CYP71AV8-P2O cDNA，作为萜类合成酶,采用黄皮(Clausena lansium)(+)-α-檀香萜合酶 cDNA(ClASS)(WO2009109597)或编码檀香树(Santalum album)(+)-α-檀香萜/(-)-β-檀香萜合酶(SaSAS)的cDNA (WO2010067309)。采用下述工序来构造出四种质粒。设计并合成出ClASS cDNA的密码子优化版本(SEQ ID NO 19-20)(DNA 2.0)，并且克隆到pETDUET-1质粒(Novagen)的NdeI-KpnI位点以提供质粒pETDuet-Tps2opt。作为SaSAS，设计出优化的全长cDNA (SEQ ID NO 21-22)，合成并克隆到pJexpress414质粒(DNA2.0)以提供质粒pJ414-SaTps8201-1-FLopt。设计出各种结构引物，用于采用In-

将四种质粒中的任一种与带来完整的甲羟戊酸途径的质粒 pACYC-29258-4506共转化到大肠杆菌BL21 Star

在生物转化实验中观察到所有所得的菌株产生出倍半萜烃类以及相应的含氧产物(图6)。该实验显示出使用表达CYP71AV8 的工程细胞，可生产出倍半萜(E)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇和其它相似结构的分子。

使用CYP71AV8变体以生产(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇

根据上述实施例，我们示出了CYP71AV8对(+)-α-檀香萜和 (-)-β-檀香萜的“末端反式碳”具有高度选择性，并且专门生产(E)-α- 檀香醇、(E)-β-檀香醇。在本实施例中，我们描述了一种定点诱变的方法来修饰CYP71AV8酶活性，以便产生(Z)-α-檀香醇和(Z)-β-檀香醇。首先选出L358作为控制酶活性的活性位点残基。 CYP71AV8的一系列变体通过将用作编码L358的密码子替代为用于编码其它氨基酸的密码子从而生产出。通过两步PCR工序来导入突变，该两步PCR工序使用简并寡核苷酸(包含NBT(N＝A,C,G,T； B＝C,G,T)密码子以替代L358编码密码子)和特异性寡核苷酸的组合。此种寡核苷酸的组合允许将L358编码密码子变为编码包括所有具有疏水性侧链的氨基酸的其它12种残基的密码子。采用诱变反向引物AV8-L358-rev (5'-CACGCGGCATCACCAGCGGAVNCGGCGGATGCAGGCGCAGGGTTTCTTTAATC-3')和引物AV8-pcw-fw(5’- CATCGATGCTTAGGAGGTCATATGGCTCTGTTATTAGCAG-3’) 实施第一步PCR以扩增cDNA的5’部分。采用引物AV8-L358-fw (5'-TCCGCTGGTGATGCCGCGTGAGTGC-3')和AV8-CPR-rev(5'- ATATATCTCCTTCTTAAAGTTAGTCGACTCATTAGGTG-3')来扩增第二PCR产物。对于这两步扩增，均采用 pCWori-CYP71AV8-P2-CPRm-ClASS作为模板。第二轮扩增采用上述两种PCR产物作为模板和引物AV8-L358-fw+ AV8-CPR-rev，并且允许扩增全长CYP71AV8变体cDNAs。所有 PCR反应均可按照生产商的指导而采用PfuUltra II融合HS DNA 聚合酶(Stratagene)。可采用Gibson装配预混液(NewEngland Biolabs)，将经修饰的cDNA连接到通过NdeI-SalI消解的 pCWori-CYP71AV8-P2-CPRm-ClASS。最终结构通过测序而被控制，并且可为各种期望的CYP71AV8变体选择一种质粒克隆体。也可通过将Leu358替代为Ala、Phe、Thr、Ser、Val、Gly、Ile、Met、 Pro、Tyr、Trp和Arg来生产出其它12种变体(SEQ ID NO 27～50)。

采用如实施例6所述的体内倍半萜生产方法来进行各种 CYP71AV8变体的评价。简单来说，含有任一种CYP71AV8变体 cDNA、CPRm cDNA和ClASS cDNA的pCWori+质粒与pACYC-29258质粒一起共转化到KRX大肠杆菌细胞(Promega)中。如实施例6所述的那样选择并培养经转化的细胞，并且评价倍半萜的生产。如图7所示，与野生型P450酶相比，生产出除了反式氧化产物的某些变体(Z)-α-檀香醇。对于各变体，通过将所生产的 (Z)-α-檀香醇的总量除以含氧α-檀香萜衍生物的总量来计算顺反式氧化率。各种变体的此种计算的结果示于如下表1：

表1.CYP71AV8野生型酶的区域选择性以及α-檀香萜的氧化的活性位点变体

表1中所示的上述数据表现出，CYP71AV8可被改造并用于生产(Z)-α-檀香醇。特别是L358T、L358S、L358A和L358F变体可被用作以高达46％的顺式末端碳的选择性进行的(+)-α-檀香萜的末端氧化.

在类似方法中，评价了CYP71AV8变体的(Z)-β-檀香醇的生产。通过将上述质粒中的ClASS cDNA替代为SaSAS cDNA来制备新的质粒。因此，可通过限制酶HindIII和EcoRI来消解质粒 pCW-CYP71AV8-L358F-CPRm-ClASS，从而去除ClASS cDNA。同时，可通过相同的酶来消解pCWori-CYP71AV8-P2-CPRm-SaSAS，从而恢复SaSAS的cDNA兼容粘性末端。采用T4DNA连接酶 (NEW England Biolabs)将线性化载体与消解的插入段连接。如上所述，使用如此获得的质粒用于在相同条件下在大肠杆菌细胞中进行的含氧倍半萜的体内生产。图8示出通过CYP71AV8-L358F 形成的产物的分析的GCMS概况，显示出经修饰的CYP71AV8酶也可用于生产(Z)-β-檀香醇。

CYP71AV族的其它成员的评价

通过具有檀香萜骨架的倍半萜的氧化来评价CYP71AV1 (NCBI登录号ABB82944.1)。制备出结构类似于实施例5的质粒的质粒:设计出包含用于编码N-末端经修饰的CYP71AV1蛋白质 (SEQ ID NO 53和54)的优化的cDNA和aaCPR cDNA(实施例5) 的双顺反子操纵子，并且进行体内合成(DNA2.0)，并作为双顺反子操纵子而克隆至pCWori+质粒。上述质粒用于转化KRX大肠杆菌细胞(Promega)。如实施例3那样培养经转化的细胞并且引起蛋白质表达。如实施例4那样进行使用(+)-α-檀香萜作为底物的生物转化实验。如图9所示，可获得与CYP71AV8相同的产物(即(E)-α- 檀香醇和(E)-α-檀香醛)，这显示出CYP71AVP450族的其它成员也可被用于檀香萜的末端氧化。

使用CYP71AV1，制备出包含CYP71AV1 cDNA、aaCPR和 (+)-α-檀香萜合酶cDNA(ClASS)的合成操纵子。通过NdeI和 HindIII来消解包含CYP71AV8-P2-CPRm-ClASS操纵子的 pCWori+质粒(实施例6)，从而切除P450编码cDNA。同时,如上一段中所述的那样，以相同的酶来消解从而从双顺反子操纵子恢复出CYP71AV1 cDNA，采用T4 DNA连接酶(NEWEngland Biolabs)而连接至经消解的上述pCWori质粒，产生质粒 pCWori-CYP71AV1-CPRm-ClASS。该质粒与质粒 pACYC-29258-4506被用于共转化大肠杆菌BL21 Star

P450-BM3(CYP102A1)突变体库的构建

通过将五种疏水性氨基酸(丙氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸和异亮氨酸)系统地合并到靠近P450-BM3的血红素的中心的两个位置，从而构建出24种变种的P450-BM3突变体库。改变这两个氨基酸的侧链大小已经显示出可显著改变紧靠在血红素基团的底物结合腔的形状(Appl Microbiol Biotechnol 2006,70:53；Adv Synth Catal 2006,348:763)。已知晓第一热点(Phe 87)改变底物的特异性和区域选择性，同时，也已预测到第二位置(Ala328)在氧化时与所有底物相互作用(ChemBiochem 2009,10:853)。可采用 QuickChange

α-檀香萜:P450-BM3库的体外筛查

如先前报道的那样，将24种P450-BM3突变体和酶的野生型版本异源表达到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中(Adv.Synth.Catal.2003, 345:802)。简单来说,将经转化细胞的单菌落用于接种到2毫升的添加了30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，并且伴随着轨道振荡(150rpm)在37℃下生长，直至OD

如实施例4所述，制备在生物转化实验中用作底物的α-檀香萜。转化在包含～0.5μM CYP酶、2％(v/v)DMSO和0.2mMμ-檀香萜底物的1ml的50mM磷酸钾缓冲液中进行。通过加入0.1mM NADPH开始反应，并且伴随着温和摇动在室温下进行22小时.

然后，在装有FS-Supreme-5色柱(30m×0.25mm×0.25μm)的 GC/MS QP-2010仪器(Shimadzu,Japan)上分析样品,氦作为载气 (流速：0.68毫升/分钟；线速度：30厘米/秒)。使用电喷雾离子化来收集质谱。注射器温度设定为250℃。色柱烘箱设为50℃ 1min, 然后以30℃/min的速度升温到170℃，随后以5℃/min的速度升温到185℃，维持等温3min，然后以5℃/min的速度升温到200℃，然后以30℃/min的速度升温到300℃，最后维持等温1min。

P450-BM3库的α-檀香萜体内筛查

同样使用被改造成从简单碳源生产(+)-α-檀香萜的细菌菌株以在体内筛查P450-BM3突变体库。为此,将实施例4的FPP-高产菌株用含有源于黄皮(Clausena lansium)(ClASS)(WO2009109597) (SEQ ID No 19和20)的密码子优化版本(+)-α-檀香萜合酶的pETDuet-1质粒进行转化，并且分别将各P450-BM3变体克隆到载体的第一和第二多克隆位点(MCS)。或者，将(+)-α-檀香萜合酶 cDNA克隆至pET101表达质粒(Novagen)中，并且将来自库的各 P450-BM3突变体克隆到pCDFDuet-1载体(Novagen)中。所得到的重组载体被共转化到FPP-高产菌株中。

将经转化细胞的单菌落用于接种到5毫升的添加了合适抗生素的LB培养基中。以250rpm在37℃下过夜温育培养物。第二天，将200μl的过夜培养物接种到添加了3％甘油、1mM盐酸硫胺素(Sigma-Aldrich,St Louis,MI)和75μg/Lδ-氨基乙酰丙酸 (Sigma-Aldrich)的2mL的极品肉汤(TB)培养基中，并且以250rpm 在37℃下温育。在4～6小时的培养后(或当培养物在600nm的光密度达到2～3的值时)，将培养物冷却到28℃，并且通过0.1mM IPTG来引起蛋白质表达。在此时，将10％(v/v)的十二烷加入到生长培养基。在伴随轨道振荡(250rpm)温育48h后，通过1体积的甲基叔丁基醚(MTBE)来对细胞培养基进行两次萃取，并且通过 GC/MS分析溶剂萃取物。在装有DB1色柱(30m x 0.25mm x 0.25mm膜厚；Agilent)以及5975系列质谱仪的Agilent 6890系列 GC系统中进行GC/MS。载气为恒定流速1毫升/分钟的氦气。注射处于无分流模式，并且将进样口温度设定在250℃，烘箱温度设定为以10℃/min的速度从50℃到225℃，然后以20℃/min的速度升到320℃。基于保留指数的一致性和可信标准的质谱来确认产物的身份。

P450-BM3突变体库的体外(实施例10)与体内筛查提供了可比较的结果，将该结果归纳于表2。P450-BM3野生型(SEQ ID No 55和56)没有显示出(+)-α-檀香萜有任何可检测到的活性，而6种P450-BM3变体能将α-檀香萜转换为所期望的α-檀香醇。这些变体揭示出对于(+)-α-檀香萜的顺式末端碳的氧化的45％～96％的优选性。单一突变体#23(A328V)(SEQID No 67和68)和双突变体#7 (F87I/A328I)(SEQ ID No 57和58)、#17(F87V/A328I)(SEQID No 59和60)和#18(F87V/A328L)(SEQ ID No 61和62)显示出在 72％～96％范围内的最高的区域选择性(表2和图10)。两种附属变体#19(F87V/A328V)(SEQ ID No 63和64)和#20(F87V/A328F)(SEQ ID No 65和66)对于顺式羟基化的选择性较差 (45％～50％的范围)，并且会生成附属氧化产物。

表2.通过P450-BM3变体的α-檀香萜向α-檀香醇的转化

上述结果表明：P450-BM3活性位点突变能够使非天然底物 (+)-α-檀香萜结合。选定的P450-BM3变体引入了这些突变体表明：有选择地使(+)-α-檀香萜的顺式末端碳羟基化，从而生产嗅觉明显的化合物(Z)-α-檀香醇(图10)。

使用P450-BM3双突变体的(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、 (Z)-α-反-香柠檬醇和(Z)-表-β-檀香醇的体内生产

测试在α-檀香萜筛查中确定的一种P450-BM3变体(变体#17；表2)的氧化由(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α-反-香柠檬烯和(+)- 表-β-檀香萜构成的倍半萜烃的檀香油状混合物的能力。为此，将实施例4所述的FPP-高产细菌菌株用包含编码檀香树(Santalumalbum)(+)-α-檀香萜/(-)-β-檀香萜合酶(WO2010067309)(SEQ ID No 21和22)的密码子优化cDNA的重组pETDuet-1表达载体转化到第一MCS中，并且将P450-BM3变体#17转化到第二MCS中。细胞生长、引发条件、培养物提取和产物分析基本上如实施例11 中记载的那样进行。

如图11所示，可通过P450-BM3双突变体将(+)-α-檀香萜、 (-)-β-檀香萜、(-)-α-反-香柠檬烯和(+)-表-β-檀香萜高效地氧化，从而生产(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(Z)-α-反-香柠檬醇和(Z)-表-β- 檀香醇。值得一提的是，在该实验条件下，只能检测到倍半萜醇的所期望的顺式异构体。这些数据显示出巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CYP102A1(P450-BM3)可高效地改造以选择性地使 (+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜以及其它结构相关的萜烯(比如香柠檬烯倍半萜)的顺式末端碳羟基化，从而生产出发现于檀香油中的关键的倍半萜醇。

从B&T World Seeds(Aigues-Vives,France)和Sandeman Seeds (Lalongue,France)获得檀香树的种子。通过2.5％的次氯酸(HCIO)对种子进行120分钟的第一次表面灭菌，并且在灭菌超纯水中洗涤三次。然后将种子去壳并置于添加了15克/升的蔗糖和7.8g/L 的琼脂、pH值5.7的MS基础培养基上(Murashige&Skoog,1962, PhysiologiaPlantarum 15,473-497)。在9～18天后，通常观察到大约40％的发芽率。在发芽后5～10周，将从无菌发芽的种子中获得的檀香幼苗转移到土壤中。由于檀香品种是根半寄生物，因此土壤适于近距离接触6个月～1岁龄的柑桔(甜橙Citrus sinensis)植物。收获檀香植物的根，并且将其转移至土壤中2-3年后，从宿主植物的根处分离。这些根的提取物的GC-MS分析显示出檀香油所特有的倍半萜的存在。采用Concert

采用Illumina总RNA测序技术和Illumina HiSeq 2000测序仪来对整体转录物进行测序。产生出108.7百万个配对read 2×100 bp。采用CLC-生物基因组工作平台的DeNovo整合应用程序 (CLCBo,Denmark)来整合测定序列。总共将平均长度683bp的 82’479个contig整合。采用tBlastn algorithm来检索这些contig (Altschul et al,J.Mol.Biol.215,403-410,1990)，并且用例如CYP71AV1 序列(NCBI登录号ABB82944.1)的已知P450氨基酸序列作为查询序列。本方式允许识别编码有特征性细胞色素P450基序的蛋白质的数个contig。某个选定的contig SCH37-Ct816(SED ID NO 69) 包含编码500个氨基酸的蛋白SaCP816(SEQ ID NO 71)的1503bp 长度的开放阅读框架(ORF)(SEQ ID NO 70)。该氨基酸显示出与已知的细胞色素P450序列(最为接近的源自欧亚种葡萄(Vitisvinifera) 的P450，CYP71D 10(NCBI登录号AAB94588.1))具有同源性，具有62％的氨基酸序列同一性。

作为通过SCH37-Ct816编码的蛋白质的功能特性，该蛋白质在大肠杆菌细胞中异源表达。对ORF序列进行修饰来提高在大肠杆菌内的表达:用编码MALLLAVFWSALIILV肽的密码子来代替前17个密码子，并且对整个ORF序列的密码子使用进行修饰以便匹配大肠杆菌密码子使用。用于编码经修饰的SaCP816(SEQ ID NO 73)的本cDNA SaCP120293(SEQ ID NO72)在体外合成 (DNA2.0)并克隆到pJExpress404质粒(DNA2.0)中。如实施例2所述那样进行异源表达。

双顺反子操纵子被设计为在独特的启动子的控制下从单一的质粒中表达P450酶和CPR。优化的SaCP120293cDNA与CPRm cDNA(SEQ ID No 9,实施例3)结合以便制备顺序包含P450 cDNA、包括核糖体结合位点(RBS)的接头序列和CPRm cDNA的双顺反子结构(SEQ IDNO 74)。该结构是通过用PCR分别扩增 P450和CPR cDNAs来制备的，并具有5’和3’突出端，其适于在 pCWori+质粒(Barnes H.J(1996)Method Enzymol.272,3-14)的 NdeI-HindIII位点中采用In-

JM109大肠杆菌细胞用SaCP816-CPRm-pCWori表达质粒进行转化。经转化的细胞进行生长，并且如实施例2所述那样制备包含重组蛋白的无细胞提取物。该蛋白组分用于倍半萜分子的酶促转化的评价(实施例16)。

如实施例4所述那样制备在生物转化实验中用作底物的不同倍半萜烃。

将提取自表达重组SaCP816和CPRm蛋白(实施例15)的大肠杆菌细胞的粗蛋白用于这些倍半萜分子的体外氧化。在包含20～50 微升蛋白质提取物、500微M NADPH(还原了的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、5微M FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)、5微M FMN (黄素单核苷酸)和300微M倍半萜(即(α)-檀香萜或(+)-α-檀香萜、 (-)-β-檀香萜、(-)-α-反-香柠檬烯和(+)-表-β-檀香萜的混合物)的1 mL的100mM Tris-HCL pH 7.4缓冲液中进行该实验。在聚四氟乙烯密封玻璃管中伴随温和搅拌温育2个小时后，在冰上停止反应，并通过1体积MTBE(甲基叔丁基醚，Sigma)来萃取。如实施例4所述那样通过GCMS来分析提取物。

在这些条件下，观察到了(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α- 反-香柠檬烯和(+)-表-β-檀香萜的氧化。图12表示通过SaCP816 对(+)-α-檀香萜进行氧化来提供(Z)-α-檀香醇的情况。图13表示通过SaCP816来氧化(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α-反-香柠檬烯和(+)-表-β-檀香萜生成(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(Z)-α-反-香柠檬醇和(Z)-表-β-檀香醇的情况。在所有实验中，均没有观测到可检测量的倍半萜醇的相应反式异构体(每种倍半萜醇的反式和顺式异构体在用于这些实验的色谱条件下均很容易被分离)。

本实验显示出，从檀香树(Santalum album)分离的细胞色素 P450酶SaCP816可用于选择性羟基化(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜和相似倍半萜结构的顺式末端碳。

(+)-α-檀香萜以及(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α-反-香柠檬烯、(+)-表-β-檀香萜或其它相似结构的分子的氧化产物均可直接产自被改造成从比如葡萄糖或甘油的碳源来生产倍半萜的大肠杆菌细胞。制备由包含合成操纵子的pCWori+质粒构成的质粒，该合成操纵子由SaCP120293cDNA(SEQ ID No 72)、CPRm cDNA (SEQ ID No 9)、萜类合成酶编码cDNA构成。作为萜类合成酶,使用黄皮(Clausena lansium)(+)-α-檀香萜合酶cDNA(ClASS) (WO2009109597)或用于编码檀香树(Santalum album)(+)-α-檀香萜 /(-)-β-檀香萜合酶(SaSAS)(WO2010067309)的cDNA。

通过与如实施例6所述的工序相似的工序来构建出两种质粒。如实施例6那样扩增密码子优化的(+)-α-檀香萜合酶cDNA(SEQ ID NO 19)和(+)-α-檀香萜/(-)-β-檀香萜合酶cDNA(SEQ ID NO 21)，并采用In-

将这两种质粒中任一种与带来完整的甲羟戊酸途径的质粒 pACYC-29258-4506共转化到大肠杆菌XRX细胞(Promega)中进行这些操纵子的性能评价(实施例4)。从羧苄青霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的LB-琼脂糖平板上选出经转化的细胞。使用单个菌落接种到补充有合适的抗生素的5毫升LB培养基中。将培养物以250rpm在37℃下温育过夜。第二天，将在玻璃培养管中包含 100μg/L羧苄青霉素和17μg/l氯霉素的2mL TB培养基接种到200μl LB预培养物，并且以250rpm并在37℃下温育。在6个小时的培养后(或当培养物在600nm的光密度达到值3时)，将培养物冷却至20℃，并且通过添加0.1mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)、δ-氨基乙酰丙酸(Sigma)和2％(v/v)的癸烷来引起蛋白质的表达。在伴随250rpm的摇动的温育48小时后,如实施例4所述，通过1体积的MTBE来提取整个培养液并通过GCMS 进行分析。

在体外实验中，也发现了所有所得的菌株生产出倍半萜烃和相应的含氧产物(图14)。该实验显示出使用表达SaCP816的工程细胞，可生产出倍半萜(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇和其它相似结构的分子。

如实施例13所述,在转录自檀香树(Santalum album)根中确认多种P450-编码contig序列。除SCH37-Ct816以外，选出另一 contig序列:SCH37-

作为通过SCH37-Ct10374编码的蛋白质的功能特性，该蛋白质在大肠杆菌细胞中异源表达。对ORF序列进行修饰来提高在大肠杆菌内的表达:用编码MALLLAVFWSALII肽的密码子来代替前18个密码子，并且对整个ORF序列的密码子使用进行修饰以便匹配大肠杆菌密码子使用。用于编码经修饰的SaCP10374(SEQ ID NO 81)的新型cDNA SaCP120292(SEQID NO 80)在体外合成 (DNA2.0)并克隆到pJExpress404质粒(DNA2.0)中。

如实施例2所述那样进行异源表达。按照此步骤，测定新型重组檀香树(S.abum)P450在450nm处具有最大吸光度的典型的CO 光谱，验证了正确折叠形成有功能P450酶。

为了重新构建该P450酶的活性,共表达P450还原酶。为此目的，以如实施例15所述的类似方式设计双顺反子操纵子，以便在独特的启动子的控制下从单个质粒中表达SaCP10374和CPRm (薄荷P450还原酶)。优化的SaCP12092 cDNA与CPRm cDNA 结合以便制备顺序包含P450 cDNA、包括核糖体结合位点(RBS) 的接头序列和CPRm cDNA的双顺反子结构(SEQ ID NO 82)。该结构是通过如实施例15所述的PCR制备的。并且将其克隆到 pCWori+质粒(Barnes H.J(1996)Method Enzymol.272,3-14)中以提供质粒SaCP10374-CPRm-pCWori。

JM109大肠杆菌细胞用这些双顺反子表达质粒进行转化。经转化的细胞进行生长，并且如实施例2所述那样制备包含重组蛋白的无细胞提取物。这些膜蛋白组分用于倍半萜分子的酶促转化的评价(实施例21)。

如实施例4所述那样制备在生物转化实验中用作底物的不同的倍半萜烃(即(α)-檀香萜或(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α-反- 香柠檬烯和(+)-表-β-檀香萜的混合物)。

将提取自表达重组SaCP10374和CPRm蛋白(实施例20)的大肠杆菌细胞的粗蛋白用于倍半萜分子的体外氧化，如实施例16所述那样进行实验。在聚四氟乙烯密封玻璃管中伴随温和搅拌而温育2个小时后，在冰上停止反应并通过1体积MTBE(甲基叔丁基醚，Sigma)来萃取。如实施例4所述那样通过GCMS来分析提取物。

在这些条件下，观察到了通过SaCP10374进行的(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α-反-香柠檬烯和(+)-表-β-檀香萜的氧化。图 15、16表示通过SaCP10374对(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α- 反-香柠檬烯和(+)-表-β-檀香萜进行氧化来提供(E)-α-檀香醇、 (E)-β-檀香醇、(E)-α-反-香柠檬醇和(E)-表-β-檀香醇的情况。在所有实验中，均没有观察到可检测量的倍半萜醇的相应的反式异构体(每种倍半萜醇的反式和顺式异构体在用于这些实验的色谱条件下均很容易被分离)。

本实验显示出，从檀香树(Santalum album)分离的细胞色素 P450酶SaCP10374可用于选择性羟基化(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜和相似倍半萜结构的顺式末端碳。

采用如实施例4的方法，制备出类似于檀香萜的多种倍半萜烃。采用包含编码檀香树(Santalum album)(-)-倍半香桧烯B合酶 (NCBI登录号ADP37190.1)SaTps647的cDNA或编码檀香树 (Santalum album)(-)-β-甜没药烯合酶(NCBI登录号ADP37189.1) SaTps30的cDNA中任一种的pETDuet表达质粒与如实施例4所述的pACYC-29258-4506质粒的结合，来生产(-)-倍半香桧烯B和 (-)-β-甜没药烯。从Bedoukian(Dambury,Ct,USA)获得β-法呢烯，从Treatt(Suffolk,UK)获得α-法呢烯，并且从柑橘油中提纯出(-)-α- 反-香柠檬烯。

将提取自表达重组SaCP816或SaCP10374的大肠杆菌细胞的粗蛋白连同CPRm蛋白(实施例15和20)用于倍半萜分子的体外氧化。如实施例16所述那样进行通过GCMS分析的实验和产物确定。

在这些条件下，观察到了(E)-β-法呢烯、(E)-α-法呢烯、(-)-倍半香桧烯B、(-)-β-甜没药烯和(-)-α-反-香柠檬烯的氧化(图17～21)。对于所有这些化合物，檀香树(S.album)P450s对于终端偕二甲基基团(图27中的R1或R2)的两个碳原子中的其中一个具有区域选择性。SaCP816催化在相对于末端双键的顺式位置(图27的R1)的甲基碳原子的选择性氧化,然而SaCP10374仅在相对于末端双键的反式位置(图27中的R2)的甲基基团的碳原子处催化相同底物的氧化。各倍半萜醇的反式和顺式异构体在用于这些实验的色谱条件下均很容易被分离。因大肠杆菌内源乙醇脱氢酶活性，当反式甲基氧化时，那么会形成相应的醛。

这些实验显示出，分离自檀香树(Santalum album)的细胞色素 P450酶、SaCP816和SaCP10374可分别用于选择性羟基化具有类似于β-法呢烯、α-法呢烯、(+)-α-檀香萜、(-)-β-檀香萜、(-)-α-反- 香柠檬烯、(-)-倍半香桧烯B或(-)-β-甜没药烯的结构的各种倍半萜分子的顺式末端和反式末端的碳。

如实施例21和22所述的氧化的倍半萜分子也可使用被改造成从比如葡萄糖或甘油的碳源生产倍半萜的大肠杆菌细胞中直接生产出。制备出由包含合成操纵子的pCWori+质粒构成的质粒，该合成操纵子由SaCP120293cDNA(SEQ ID No 72)或SaCP120292 (SEQ IDNo 80)、CPRm cDNA(SEQ ID No 9)、萜类合成酶编码 cDNA(编码黄花蒿(Artemisia annua)β-法呢烯合酶cDNA(NCBI登录号AAX39387.1.1)、云杉(Picea abies)α-法呢烯合酶(NCBI登录号AAS47697.1)、檀香树(S.album)(-)-倍半香桧烯B(NCBI登录号ADP37190.1)、檀香树(S.album)(-)-β-甜没药烯合酶(NCBI登录号ADP37189.1)、黄皮(Clausena lansium)α-檀香萜合酶(NCBI登录号ADR71055.1)或檀香树(S.album)α-/β-檀香萜合酶(NCBI登录号ADP30867.1))构成。

带有合成操纵子的不同组合的质粒按照如下工序来制备。分别通过(E)-β-法呢烯合酶和(E)-α-法呢烯合酶cDNAs以PCR方式扩增质粒pD444-SR-AaBFS(包含编码黄花蒿(Artemisia annua) (E)-β-法呢烯合酶(NCBI登录号AAX39387.1)AaBFS的优化的 cDNA)、质粒pD444-SR-PaAFS(包含编码云杉(Picea abies)(E)-α- 法呢烯合酶(NCBI登录号AAS47697.1)PaAFS的优化的cDNA)。将质粒pETDuet-SaTps647和pETDuet-SaTps30(实施例22)作为模板，并且分别通过倍半香桧烯B合酶和甜没药烯合酶cDNAs以 PCR的方式扩增。对于每个结构，设计引物用于采用In-

将PCR产物连接到采用HindIII restriction酶消解的质粒 SaCP816-CPRm-pCWori(SEQ ID No 74)或 SaCP10374-CPRm-pCWOri(SEQ ID NO 82)中，并且采用 In-

如实施例17所述那样采用上述质粒在大肠杆菌细胞中进行含氧倍半萜的体内生产。在体外实验中也可观察到，所有用这些质粒转化的重组细菌细胞生产出了所期望的倍半萜烃以及相应的含氧产物(图22～26)。

序列表

<110> 弗门尼舍有限公司

<120> 用于生产芳香醇的方法

<130> P219547WO

<150> US 61880149

<151> 2013-09-19

<160> 104

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 菊苣(Cichorium intybus)

<400> 1

atggagattt ctatccccac tacccttggc cttgccgtca tcatcttcat cattttcaag 60

ttgctaacgc gtaccacatc aaagaaaaac ctactcccag agccatggag actaccaata 120

atcggacaca tgcatcatct gataggtacg atgccacatc gtggtgtcat ggaactagcc 180

aggaagcatg gatctctcat gcatctacaa cttggagaag tgtccactat tgtggtctca 240

tccccacgtt gggcaaaaga ggttctgaca acgtacgata ttacgtttgc aaacagaccg 300

gagactttaa ccggtgagat tgttgcatat cacaataccg atattgtcct tgctccgtat 360

ggtgaatact ggaggcagtt gcgaaagctt tgcaccttgg agcttttaag caacaagaaa 420

gtgaagtcgt ttcagtccct tcgtgaggag gaatgttgga atctggttaa agacattcga 480

tcaactgggc agggatcccc aatcaatctt tcagaaaaca ttttcaagat gattgccacc 540

atacttagta gggcagcatt cggaaaggga atcaaagacc aaatgaaatt tacagaatta 600

gtaaaagaaa tactaaggct tacgggaggt tttgatgtgg cggacatctt tccttctaaa 660

aagttacttc accatctttc aggcaagaga gctaagttaa ccaacataca caataagctt 720

gacaatttga tcaacaatat catcgctgag caccctggaa accgtacaag ctcatcacag 780

gagactctac ttgatgttct gttaagactg aaagaaagcg cagagtttcc attgacagca 840

gacaatgtca aagcagtcat tttggatatg tttggagctg gcacggatac ttcgtcagcc 900

acaattgaat gggcaatctc agaattgata aggtgtccga gagccatgga gaaagttcaa 960

acagaattaa ggcaagcact aaatggaaag gaaaggatcc aagaagaaga tctacaggaa 1020

ctaaattacc taaagctagt gatcaaagaa acattgaggt tgcatccacc actaccgttg 1080

gttatgccta gagagtgtag ggagccatgt gtgttggggg gatacgatat acccagcaag 1140

acgaaactta ttgtcaacgt gtttgccata aacagggatc ctgaatactg gaaagatgct 1200

gaaactttca tgccagagag atttgaaaac agccccatca ctgtaatggg ttcagagtat 1260

gagtatctcc cgtttggtgc aggaagaaga atgtgtccag gcgctgccct tggtttagcc 1320

aacgtggaac ttcctcttgc tcatatactt tactacttca attggaagct cccaaatgga 1380

aaaacatttg aagacttgga catgactgag agctttggag ccactgtcca aagaaagacg 1440

gagttgttac tagttccaac ggatttccaa acacttacgg catctactta atgactcgag 1500

<210> 2

<211> 496

<212> PRT

<213> 菊苣(Cichorium intybus)

<400> 2

Met Glu Ile Ser Ile Pro Thr Thr Leu Gly Leu Ala Val Ile Ile Phe

1 5 10 15

Ile Ile Phe Lys Leu Leu Thr Arg Thr Thr Ser Lys Lys Asn Leu Leu

20 25 30

Pro Glu Pro Trp Arg Leu Pro Ile Ile Gly His Met His His Leu Ile

35 40 45

Gly Thr Met Pro His Arg Gly Val Met Glu Leu Ala Arg Lys His Gly

50 55 60

Ser Leu Met His Leu Gln Leu Gly Glu Val Ser Thr Ile Val Val Ser

65 70 75 80

Ser Pro Arg Trp Ala Lys Glu Val Leu Thr Thr Tyr Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Ala Asn Arg Pro Glu Thr Leu Thr Gly Glu Ile Val Ala Tyr His Asn

100 105 110

Thr Asp Ile Val Leu Ala Pro Tyr Gly Glu Tyr Trp Arg Gln Leu Arg

115 120 125

Lys Leu Cys Thr Leu Glu Leu Leu Ser Asn Lys Lys Val Lys Ser Phe

130 135 140

Gln Ser Leu Arg Glu Glu Glu Cys Trp Asn Leu Val Lys Asp Ile Arg

145 150 155 160

Ser Thr Gly Gln Gly Ser Pro Ile Asn Leu Ser Glu Asn Ile Phe Lys

165 170 175

Met Ile Ala Thr Ile Leu Ser Arg Ala Ala Phe Gly Lys Gly Ile Lys

180 185 190

Asp Gln Met Lys Phe Thr Glu Leu Val Lys Glu Ile Leu Arg Leu Thr

195 200 205

Gly Gly Phe Asp Val Ala Asp Ile Phe Pro Ser Lys Lys Leu Leu His

210 215 220

His Leu Ser Gly Lys Arg Ala Lys Leu Thr Asn Ile His Asn Lys Leu

225 230 235 240

Asp Asn Leu Ile Asn Asn Ile Ile Ala Glu His Pro Gly Asn Arg Thr

245 250 255

Ser Ser Ser Gln Glu Thr Leu Leu Asp Val Leu Leu Arg Leu Lys Glu

260 265 270

Ser Ala Glu Phe Pro Leu Thr Ala Asp Asn Val Lys Ala Val Ile Leu

275 280 285

Asp Met Phe Gly Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ala Thr Ile Glu Trp

290 295 300

Ala Ile Ser Glu Leu Ile Arg Cys Pro Arg Ala Met Glu Lys Val Gln

305 310 315 320

Thr Glu Leu Arg Gln Ala Leu Asn Gly Lys Glu Arg Ile Gln Glu Glu

325 330 335

Asp Leu Gln Glu Leu Asn Tyr Leu Lys Leu Val Ile Lys Glu Thr Leu

340 345 350

Arg Leu His Pro Pro Leu Pro Leu Val Met Pro Arg Glu Cys Arg Glu

355 360 365

Pro Cys Val Leu Gly Gly Tyr Asp Ile Pro Ser Lys Thr Lys Leu Ile

370 375 380

Val Asn Val Phe Ala Ile Asn Arg Asp Pro Glu Tyr Trp Lys Asp Ala

385 390 395 400

Glu Thr Phe Met Pro Glu Arg Phe Glu Asn Ser Pro Ile Thr Val Met

405 410 415

Gly Ser Glu Tyr Glu Tyr Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Met Cys

420 425 430

Pro Gly Ala Ala Leu Gly Leu Ala Asn Val Glu Leu Pro Leu Ala His

435 440 445

Ile Leu Tyr Tyr Phe Asn Trp Lys Leu Pro Asn Gly Lys Thr Phe Glu

450 455 460

Asp Leu Asp Met Thr Glu Ser Phe Gly Ala Thr Val Gln Arg Lys Thr

465 470 475 480

Glu Leu Leu Leu Val Pro Thr Asp Phe Gln Thr Leu Thr Ala Ser Thr

485 490 495

<210> 3

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV8-65188 DNA 序列

<400> 3

atggcactct tactggcagt attctggtcc gccctgatca ttcttgtaac ccgcacgact 60

agcaaaaaga atctgttgcc ggagccatgg cgtctgccga ttatcggtca catgcaccat 120

ttgatcggca ccatgccgca tcgtggtgtt atggaactgg cccgtaagca tggcagcctg 180

atgcacctgc aactgggtga agtctctacg attgttgtca gcagcccgcg ttgggcgaaa 240

gaggtcttga ccacctatga tatcaccttc gccaatcgcc cggaaaccct gactggcgag 300

atcgtcgcat accacaacac ggatatcgtc ctggcgccgt atggtgagta ttggcgtcaa 360

ctgcgtaaac tgtgcacgct ggagctgctg agcaacaaga aagtgaagag cttccagagc 420

ctgcgcgaag aagagtgttg gaacctggtc aaggacatcc gcagcaccgg ccaaggtagc 480

ccaatcaatc tgtcggagaa cattttcaag atgattgcga cgattctgag ccgtgctgcg 540

ttcggtaagg gtattaagga tcaaatgaag tttaccgaac tggtgaaaga aatcctgcgt 600

ctgaccggcg gttttgatgt cgctgacatc ttccctagca agaagttgct gcaccacctg 660

agcggcaagc gtgcaaaact gaccaatatc cataacaagc tggataatct gatcaataac 720

atcatcgcag agcacccggg caaccgtacc tcgtcctccc aggaaacgct gctggacgtt 780

ctgctgcgcc tgaaagagtc tgcggagttt ccgctgaccg ccgacaacgt taaagcagtg 840

atcctggata tgttcggcgc tggtacggat accagcagcg cgacgatcga gtgggcgatt 900

agcgagctga ttcgctgccc tcgcgcgatg gagaaagtgc agacggaatt gcgtcaggca 960

ctgaatggca aagagcgtat tcaggaagag gatttgcagg agctgaatta tctgaagctg 1020

gtgattaaag aaaccctgcg cctgcatccg ccgttgccgc tggtgatgcc gcgtgagtgc 1080

cgtgaaccgt gtgttttggg cggttacgac attccgagca aaacgaagct gatcgttaat 1140

gttttcgcga ttaaccgtga cccggaatac tggaaagacg cggaaacgtt tatgccggag 1200

cgttttgaga atagcccgat taccgttatg ggttccgagt acgaatacct gccatttggt 1260

gctggtcgtc gtatgtgtcc tggtgcagcg ctgggtctgg ccaacgtgga actgccgctg 1320

gcgcacattc tgtactattt caactggaaa ctgccgaacg gcaagacctt cgaagatttg 1380

gacatgaccg agagctttgg tgccactgtg cagcgcaaaa ccgagctgct gctggttccg 1440

accgactttc aaacgctgac tgcgagcacc taa 1473

<210> 4

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV8-65188 氨基酸序列

<400> 4

Met Ala Leu Leu Leu Ala Val Phe Trp Ser Ala Leu Ile Ile Leu Val

1 5 10 15

Thr Arg Thr Thr Ser Lys Lys Asn Leu Leu Pro Glu Pro Trp Arg Leu

20 25 30

Pro Ile Ile Gly His Met His His Leu Ile Gly Thr Met Pro His Arg

35 40 45

Gly Val Met Glu Leu Ala Arg Lys His Gly Ser Leu Met His Leu Gln

50 55 60

Leu Gly Glu Val Ser Thr Ile Val Val Ser Ser Pro Arg Trp Ala Lys

65 70 75 80

Glu Val Leu Thr Thr Tyr Asp Ile Thr Phe Ala Asn Arg Pro Glu Thr

85 90 95

Leu Thr Gly Glu Ile Val Ala Tyr His Asn Thr Asp Ile Val Leu Ala

100 105 110

Pro Tyr Gly Glu Tyr Trp Arg Gln Leu Arg Lys Leu Cys Thr Leu Glu

115 120 125

Leu Leu Ser Asn Lys Lys Val Lys Ser Phe Gln Ser Leu Arg Glu Glu

130 135 140

Glu Cys Trp Asn Leu Val Lys Asp Ile Arg Ser Thr Gly Gln Gly Ser

145 150 155 160

Pro Ile Asn Leu Ser Glu Asn Ile Phe Lys Met Ile Ala Thr Ile Leu

165 170 175

Ser Arg Ala Ala Phe Gly Lys Gly Ile Lys Asp Gln Met Lys Phe Thr

180 185 190

Glu Leu Val Lys Glu Ile Leu Arg Leu Thr Gly Gly Phe Asp Val Ala

195 200 205

Asp Ile Phe Pro Ser Lys Lys Leu Leu His His Leu Ser Gly Lys Arg

210 215 220

Ala Lys Leu Thr Asn Ile His Asn Lys Leu Asp Asn Leu Ile Asn Asn

225 230 235 240

Ile Ile Ala Glu His Pro Gly Asn Arg Thr Ser Ser Ser Gln Glu Thr

245 250 255

Leu Leu Asp Val Leu Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ala Glu Phe Pro Leu

260 265 270

Thr Ala Asp Asn Val Lys Ala Val Ile Leu Asp Met Phe Gly Ala Gly

275 280 285

Thr Asp Thr Ser Ser Ala Thr Ile Glu Trp Ala Ile Ser Glu Leu Ile

290 295 300

Arg Cys Pro Arg Ala Met Glu Lys Val Gln Thr Glu Leu Arg Gln Ala

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Arg Ile Gln Glu Glu Asp Leu Gln Glu Leu Asn

325 330 335

Tyr Leu Lys Leu Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Leu

340 345 350

Pro Leu Val Met Pro Arg Glu Cys Arg Glu Pro Cys Val Leu Gly Gly

355 360 365

Tyr Asp Ile Pro Ser Lys Thr Lys Leu Ile Val Asn Val Phe Ala Ile

370 375 380

Asn Arg Asp Pro Glu Tyr Trp Lys Asp Ala Glu Thr Phe Met Pro Glu

385 390 395 400

Arg Phe Glu Asn Ser Pro Ile Thr Val Met Gly Ser Glu Tyr Glu Tyr

405 410 415

Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Met Cys Pro Gly Ala Ala Leu Gly

420 425 430

Leu Ala Asn Val Glu Leu Pro Leu Ala His Ile Leu Tyr Tyr Phe Asn

435 440 445

Trp Lys Leu Pro Asn Gly Lys Thr Phe Glu Asp Leu Asp Met Thr Glu

450 455 460

Ser Phe Gly Ala Thr Val Gln Arg Lys Thr Glu Leu Leu Leu Val Pro

465 470 475 480

Thr Asp Phe Gln Thr Leu Thr Ala Ser Thr

485 490

<210> 5

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV8-P2 DNA 序列

<400> 5

atggctctgt tattagcagt tttttggtcg gcgcttataa tcctcgtagt aacctacacc 60

atatccctcc taatcaacca atggcgaaaa ccgaaacccc aagggaagtt ccccccgggc 120

ccatggcgtc tgccgattat cggtcacatg caccatttga tcggcaccat gccgcatcgt 180

ggtgttatgg aactggcccg taagcatggc agcctgatgc acctgcaact gggtgaagtc 240

tctacgattg ttgtcagcag cccgcgttgg gcgaaagagg tcttgaccac ctatgatatc 300

accttcgcca atcgcccgga aaccctgact ggcgagatcg tcgcatacca caacacggat 360

atcgtcctgg cgccgtatgg tgagtattgg cgtcaactgc gtaaactgtg cacgctggag 420

ctgctgagca acaagaaagt gaagagcttc cagagcctgc gcgaagaaga gtgttggaac 480

ctggtcaagg acatccgcag caccggccaa ggtagcccaa tcaatctgtc ggagaacatt 540

ttcaagatga ttgcgacgat tctgagccgt gctgcgttcg gtaagggtat taaggatcaa 600

atgaagttta ccgaactggt gaaagaaatc ctgcgtctga ccggcggttt tgatgtcgct 660

gacatcttcc ctagcaagaa gttgctgcac cacctgagcg gcaagcgtgc aaaactgacc 720

aatatccata acaagctgga taatctgatc aataacatca tcgcagagca cccgggcaac 780

cgtacctcgt cctcccagga aacgctgctg gacgttctgc tgcgcctgaa agagtctgcg 840

gagtttccgc tgaccgccga caacgttaaa gcagtgatcc tggatatgtt cggcgctggt 900

acggatacca gcagcgcgac gatcgagtgg gcgattagcg agctgattcg ctgccctcgc 960

gcgatggaga aagtgcagac ggaattgcgt caggcactga atggcaaaga gcgtattcag 1020

gaagaggatt tgcaggagct gaattatctg aagctggtga ttaaagaaac cctgcgcctg 1080

catccgccgt tgccgctggt gatgccgcgt gagtgccgtg aaccgtgtgt tttgggcggt 1140

tacgacattc cgagcaaaac gaagctgatc gttaatgttt tcgcgattaa ccgtgacccg 1200

gaatactgga aagacgcgga aacgtttatg ccggagcgtt ttgagaatag cccgattacc 1260

gttatgggtt ccgagtacga atacctgcca tttggtgctg gtcgtcgtat gtgtcctggt 1320

gcagcgctgg gtctggccaa cgtggaactg ccgctggcgc acattctgta ctatttcaac 1380

tggaaactgc cgaacggcaa gaccttcgaa gatttggaca tgaccgagag ctttggtgcc 1440

actgtgcagc gcaaaaccga gctgctgctg gttccgaccg actttcaaac gctgactgcg 1500

agcacctaa 1509

<210> 6

<211> 502

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV8-P2 氨基酸序列

<400> 6

Met Ala Leu Leu Leu Ala Val Phe Trp Ser Ala Leu Ile Ile Leu Val

1 5 10 15

Val Thr Tyr Thr Ile Ser Leu Leu Ile Asn Gln Trp Arg Lys Pro Lys

20 25 30

Pro Gln Gly Lys Phe Pro Pro Gly Pro Trp Arg Leu Pro Ile Ile Gly

35 40 45

His Met His His Leu Ile Gly Thr Met Pro His Arg Gly Val Met Glu

50 55 60

Leu Ala Arg Lys His Gly Ser Leu Met His Leu Gln Leu Gly Glu Val

65 70 75 80

Ser Thr Ile Val Val Ser Ser Pro Arg Trp Ala Lys Glu Val Leu Thr

85 90 95

Thr Tyr Asp Ile Thr Phe Ala Asn Arg Pro Glu Thr Leu Thr Gly Glu

100 105 110

Ile Val Ala Tyr His Asn Thr Asp Ile Val Leu Ala Pro Tyr Gly Glu

115 120 125

Tyr Trp Arg Gln Leu Arg Lys Leu Cys Thr Leu Glu Leu Leu Ser Asn

130 135 140

Lys Lys Val Lys Ser Phe Gln Ser Leu Arg Glu Glu Glu Cys Trp Asn

145 150 155 160

Leu Val Lys Asp Ile Arg Ser Thr Gly Gln Gly Ser Pro Ile Asn Leu

165 170 175

Ser Glu Asn Ile Phe Lys Met Ile Ala Thr Ile Leu Ser Arg Ala Ala

180 185 190

Phe Gly Lys Gly Ile Lys Asp Gln Met Lys Phe Thr Glu Leu Val Lys

195 200 205

Glu Ile Leu Arg Leu Thr Gly Gly Phe Asp Val Ala Asp Ile Phe Pro

210 215 220

Ser Lys Lys Leu Leu His His Leu Ser Gly Lys Arg Ala Lys Leu Thr

225 230 235 240

Asn Ile His Asn Lys Leu Asp Asn Leu Ile Asn Asn Ile Ile Ala Glu

245 250 255

His Pro Gly Asn Arg Thr Ser Ser Ser Gln Glu Thr Leu Leu Asp Val

260 265 270

Leu Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ala Glu Phe Pro Leu Thr Ala Asp Asn

275 280 285

Val Lys Ala Val Ile Leu Asp Met Phe Gly Ala Gly Thr Asp Thr Ser

290 295 300

Ser Ala Thr Ile Glu Trp Ala Ile Ser Glu Leu Ile Arg Cys Pro Arg

305 310 315 320

Ala Met Glu Lys Val Gln Thr Glu Leu Arg Gln Ala Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Arg Ile Gln Glu Glu Asp Leu Gln Glu Leu Asn Tyr Leu Lys Leu

340 345 350

Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Leu Pro Leu Val Met

355 360 365

Pro Arg Glu Cys Arg Glu Pro Cys Val Leu Gly Gly Tyr Asp Ile Pro

370 375 380

Ser Lys Thr Lys Leu Ile Val Asn Val Phe Ala Ile Asn Arg Asp Pro

385 390 395 400

Glu Tyr Trp Lys Asp Ala Glu Thr Phe Met Pro Glu Arg Phe Glu Asn

405 410 415

Ser Pro Ile Thr Val Met Gly Ser Glu Tyr Glu Tyr Leu Pro Phe Gly

420 425 430

Ala Gly Arg Arg Met Cys Pro Gly Ala Ala Leu Gly Leu Ala Asn Val

435 440 445

Glu Leu Pro Leu Ala His Ile Leu Tyr Tyr Phe Asn Trp Lys Leu Pro

450 455 460

Asn Gly Lys Thr Phe Glu Asp Leu Asp Met Thr Glu Ser Phe Gly Ala

465 470 475 480

Thr Val Gln Arg Lys Thr Glu Leu Leu Leu Val Pro Thr Asp Phe Gln

485 490 495

Thr Leu Thr Ala Ser Thr

500

<210> 7

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP71AV8-P2O DNA 序列

<400> 7

atggcactgt tgctggctgt cttttggtct gctctgatta ttttggtggt tacctacacc 60

atctccctgc tgattaacca gtggcgtaaa ccgaaaccac agggtaaatt cccgccgggt 120

ccgtggcgtc tgccgattat cggtcacatg caccatttga tcggcaccat gccgcatcgt 180