用工程化细菌泛素连接酶模拟物进行的广谱蛋白质组编辑

本申请要求2018年3月16日提交的美国临时专利申请序列第62/644,055号的优先权权益，其全部内容特此通过引用并入本文。

技术领域

本申请总体上涉及用工程化细菌泛素连接酶模拟物进行的广谱蛋白质组编辑。

背景技术

传统上已经通过破坏编码蛋白质的靶基因的表达并分析产生的表型结果来研究蛋白质功能。现在通常使用基因沉默和基因组编辑技术如反义寡核苷酸(“ASO”)、RNA干扰(“RNAi”)、锌指核酸酶(“ZFN”)、转录激活因子样效应物核酸酶(“TALEN”)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(“CRISPR”)-Cas系统进行此类功能丧失实验。McManus等人,“GeneSilencing in Mammals by Small Interfering RNAs,”Nat.Rev.Genet.3(10):737-47(2002)；Deleavey等人,“Designing Chemically Modified Oligonucleotides forTargeted Gene Silencing,”Chemistry&Biology 19(8):937-54(2012)；Boettcher等人,“Choosing the Right Tool for the Job:RNAi,TALEN,or CRISPR,”Mol.Cell 58(4):575-85(2015)；和Gaj等人,“TALEN,and CRISPR/Cas-Based Methods for GenomeEngineering,”Trends Biotechnol.31(7):397-405(2013)。这些方法被广泛用于基础研究，并有望用于治疗遗传性障碍。Gaj等人,“TALEN,and CRISPR/Cas-Based Methods forGenome Engineering,”Trends Biotechnol.31(7):397-405(2013)；Cox等人,“Therapeutic Genome Editing:Prospects and Challenges,”Nat.Med.21(2):121-31(2015)；Soutschek等人,“Therapeutic Silencing of an Endogenous Gene by SystemicAdministration of Modified siRNAs,”Nature 432(7014)173-78(2004)；Bumcrot等人,“RNAi Therapeutics:A Potential New Class of Pharmaceutical Drugs,”Nat.Chem.Biol.2(12):711-19(2006)；和Wang等人,“Non-Viral Delivery of Genome-Editing Nucleases for Gene Therapy,”Gene Ther.24(3):144-50(2017)。但是，仍然存在许多挑战，包括：缺乏时间控制，不可预测的脱靶效应；在基因组编辑的情况下，无法去除必需基因以及此类敲除的不可逆性质，和在基因沉默的情况下，无法降低细胞内已经存在的蛋白质水平，因此不会影响稳定的、长寿的蛋白质。

蛋白质组编辑技术代表了用于研究蛋白质功能的正交方法，其在翻译后水平上操作，并且具有以比靶向DNA或RNA的方法更高的分辨率以及以翻译后精度剖析复杂蛋白质功能的潜力。最著名的方法之一涉及“降解抑制”，由此强行控制细胞泛素-蛋白酶体途径(“UPP”)的机制以特异性降解目标蛋白质。规范泛素化级联需要三种酶-泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)-的活性，所述酶通过以能量依赖性方式将聚泛素链共价连接至赖氨酸残基而依次作用于用于降解的标签蛋白。

E3是UPP中最异质的酶种类(在人类中存在大于600的E3)，并且可以根据特征结构域的存在和泛素转移至底物蛋白的机制分类为HECT(与E6AP C-末端同源)、RING(真正有趣的新基因(really interesting new gene))和RBR(RING-between-RING)。Buetow等人,“Structural Insights into the Catalysis and Regulation of E3 UbiquitinLigases,”Nat.Rev.Mol.Cell Biol.17(10):626-42(2016)。因为它们介导底物特异性并且通常表现出显著的可塑性，E3泛素连接酶是迄今描述的蛋白质组编辑策略中最常利用的组分。例如，化学敲低已经使用称为蛋白水解靶向嵌合体的小分子或PROTAC实现(Neklesa等人,“Targeted Protein Degradation by PROTACs,”Pharmacol.Ther.17:4138-144(2017)和Deshaies,R.T,“Protein Degradation:Prime Time for PROTACs,”Nat.Chem.Biol.11(9):634 35(2015))，PROTAC是含有一个E3泛素连接酶的配体、另一个待降解蛋白质的配体和连接两者的接头的异双功能分子。这些分子结合E3和靶标，促进三元复合物的形成，所述三元复合物引发靶标聚泛素化，随后其蛋白酶体降解。已经报道了越来越多的基于肽和小分子的PROTAC，其能够在细胞和小鼠中实现化学敲除。Schneekloth等人,“ChemicalGenetic Control of Protein Levels:Selective In Vivo Targeted Degradation,”J.Am.Chem.Soc.126(12):3748-54(2004)；Hines等人,“Posttranslational ProteinKnockdown Coupled to Receptor Tyrosine Kinase Activation withPhosphoPROTACs,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(22):8942-47(2013)；Schneekloth等人,“Targeted Intracellular Protein Degradation Induced by a Small Molecule:EnRoute to Chemical Proteomics,”Bioorganic Med.Chem.Lett.18(22):5904-08(2008)；Bondeson等人,“Catalytic In Vivo Protein Knockdown by Small-Molecule PROTACs,”Nat.Chem.Biol.11(8):611—17(2015)；和Sakamoto等人,“Protacs:Chimeric Moleculesthat Target Proteins to the Skp1-Cullin-F Box Complex for Ubiquitination andDegradation,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(15):8554-59(2001)。这些化合物的有吸引力的特征是它们的药物样性质，包括细胞渗透性；然而，许多基于肽和小分子的PROTAC的效力低—常常需要高达25μM的浓度以诱导充分的降解(Buckley等人,“Small-MoleculeControl of Intracellular Protein Levels Through Modulation of the UbiquitinProteasome System,”Angew Chem.Int.Ed.Engl.53(9):2312-30(2014))—并且定制PROTAC的产生受到相对缺乏E3泛素连接酶和期望的蛋白质靶的可用配体以及与从头产生此类配体相关的技术挑战的限制(Osherovich,L.,“Degradation From Within,”Science-Business Exchange 7:10-11(2014))。

为了克服这些问题，已经开发了基于蛋白质的嵌合体，其中E3泛素连接酶被遗传融合到结合目标靶的蛋白质。在细胞中异位表达后，工程化的蛋白质嵌合体将E3募集至靶蛋白质，导致其聚泛素化并随后被蛋白酶体降解。在最早的实例中，通过产生F-box嵌合体实现蛋白质敲除，其中β-TrCP与来源于由人乳头瘤病毒16型编码的E7蛋白的肽融合，其已知与成视网膜细胞瘤蛋白pRB相互作用(Zhou等人,“Harnessing the UbiquitinationMachinery to Target the Degradation of Specific Cellular Proteins,”Mol.Cell 6(3):751-56(2000)和Zhang等人,“Exploring the Functional Complexity of CellularProteins by Protein Knockout,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(24):14127-32(2003))。异位表达后，工程化的F-box将pRB募集到Skp1-Cul1-F-box(“SCF”)机构，一种用于泛素化和破坏的来自Cullin-RING连接酶(“CRL”)超家族的多蛋白E3复合物。少数其他研究类似地利用天然蛋白质-蛋白质相互作用，由此一种相互作用蛋白质与E3的融合产生嵌合体，该嵌合体在细胞和小鼠中表达后使相应的结合伴侣沉默。Hatakeyama等人,“TargetedDestruction of C-Myc by an Engineered Ubiquitin Ligase Suppresses CellTransformation and Tumor Formation,”Cancer Res.65(17):7874-79(2005)；Ma等人,“Targeted Degradation of KRAS by an Engineered Ubiquitin Ligase SuppressesPancreatic Cancer Cell Growth In Vitro and In Vivo,”Mol.Cancer Ther.12(3):286-94(2013)；和Kong等人,“Engineering a Single Ubiquitin Ligase for theSelective Degradation of all Activated ErbB Receptor Tyrosine Kinases,”Oncogene 33(8):986-95(2014)。

最近，显示通用蛋白质组编辑技术可以扩展到天然存在的结合对之外。该方法包括将E3融合到合成的结合蛋白，例如单链抗体片段(“scFv”)、设计锚蛋白重复蛋白(“DARPin”)或III型纤连蛋白(“FN3”)抗体类似物(monobody)。Portnoff等人,“Ubiquibodies,Synthetic E3 Ubiquitin Ligases Endowed With Unnatural SubstrateSpecificity for Targeted Protein Silencing,”J.Biol.Chem.289(11):7844-55(2014)。这些双功能嵌合体，称为“ubiquibody”(“uAb”)，结合了人RING/U-box型E3 CHIP(Hsc70-相互作用蛋白的羧基末端)的灵活的泛素标记能力与合成的结合蛋白的可工程化的亲和力和特异性。结果是一种可定制的技术，用于有效地将另外稳定的蛋白导向UPP，以便独立于它们的生物功能或相互作用而进行降解。事实上，uAb的最大优点之一是它们的高度模块化结构-简单地交换合成的结合蛋白可以产生特异性靶向不同底物蛋白的新uAb(Caussinus等人,“Fluorescent Fusion Protein Knockout Mediated by Anti-GFPNanobody,”Nat.Struct.Mol.Biol.19(1):117-21(2011)；Fulcher等人,“TargetingEndogenous Proteins For Degradation Through the Affinity-Directed ProteinMissile System,”Open Biol.7(5):170066(2017)；Fulcher等人,“An Affinity-DirectedProtein Missile System for Targeted Proteolysis,”Open Biol 6(10):160255(2016)；Shin等人,“Nanobody-Targeted E3-Ubiquitin Ligase Complex DegradesNuclear Proteins,”Sci.Rep.5:14269(2015)；和Kanner等人,“Sculpting Ion ChannelFunctional Expression with Engineered Ubiquitin Ligases,”Elife 6:e29744(2017))，同时交换E3结构域可改变泛素转移的动力学或机制。此外，通过掺入识别特定蛋白状态(例如活性相对于无活性构象、突变体相对于野生型、翻译后修饰)的合成结合蛋白，可以排除某些蛋白亚群而不损害其他亚群。Zhang等人,“Exploring the FunctionalComplexity of Cellular Proteins by Protein Knockout,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(24):14127-32(2003)和Baltz等人,“Design and Functional Characterization ofSynthetic E3 Ubiquitin Ligases for Targeted Protein Depletion,”Curr.Prot.Chem.Biol.10(1):72-90(2018)。然而，目前uAb的发展集中在相对窄的一组哺乳动物E3，最值得注意的是“独立的”E3 CHIP或多蛋白E3连接酶复合物的CRL超家族的成员。

本申请结合基于蛋白质的嵌合体的专门知识，由此新的E3泛素连接酶基序遗传融合到结合目标靶的蛋白质，从而解决上述挑战并克服本领域中的这些和其他缺陷。

发明内容

本申请的第一方面涉及一种分离的嵌合分子。分离的嵌合分子包含降解结构域，该降解结构域包含E3泛素连接酶(E3)基序；能够特异性地将降解结构域引导至底物的靶向结构域，其中所述靶向结构域与所述降解结构域异源；以及将降解结构域与靶向结构域偶联的接头。

本申请的第二方面涉及一种形成核糖核蛋白的方法。该方法包括提供编码本文所述的分离的嵌合分子的mRNA；提供一个或多个聚腺苷酸结合蛋白(“PABP”)；和由mRNA和一个或多个PABP组装核糖核蛋白复合物。

本申请的第三方面涉及一种包含本文所述的嵌合分子和药学上可接受的载体的组合物。

本申请的第四方面涉及一种治疗疾病的方法。该方法包括选择患有疾病的受试者，并且向所述受试者施用本文所述的组合物，以使所述受试者具有与未患有所述疾病的受试者相比增加的底物表达水平。

本申请的第五方面涉及一种用于底物沉默的方法。该方法包括选择待沉默的底物；提供本文所述的嵌合分子；和使所述底物与嵌合分子在有效允许形成底物-分子复合物的条件下接触，其中所述复合物介导待沉默的底物的降解。

本申请的第六方面涉及一种筛选对疾病具有治疗功效的试剂的方法。该方法包括提供生物分子，其存在介导疾病状态；提供测试试剂，其包含(i)包含E3泛素连接酶(E3)基序的降解结构域，(ii)能够特异性地将所述降解结构域导向所述生物分子的靶向结构域，其中所述靶向结构域与所述降解结构域异源，和(iii)将所述降解结构域偶联至所述靶向结构域的接头；使所述生物分子在有效使所述测试试剂促进所述生物分子降解的条件下与所述测试试剂接触；确定作为接触的结果的生物分子的水平；以及基于所述确定，将降低所述生物分子水平的所述测试试剂鉴定为对所述疾病具有治疗功效的候选物。

本申请的第七方面涉及一种筛选疾病生物标志物的方法。该方法包括提供表达一种或多种配体的患病细胞的样品；提供多个嵌合分子，其包含(i)包含E3泛素连接酶(E3)基序的降解结构域，(ii)能够特异性地将所述降解结构域引导至所述一种或多种配体的靶向结构域，其中所述靶向结构域与所述降解结构域异源，和(iii)将所述降解结构域与所述靶向结构域偶联的接头；使样品在有效使患病细胞在不存在嵌合分子的情况下不能增殖的条件下与多个嵌合分子接触；确定哪些嵌合分子允许患病细胞增殖；和基于所述确定将与嵌合分子结合并允许患病细胞增殖的配体鉴定为疾病的生物标志物。

操纵泛素-蛋白酶体途径以实现细胞蛋白质的靶向沉默已成为重塑哺乳动物蛋白质组的可靠且可定制的策略。一种此类方法涉及工程化称为ubiquibody的双功能蛋白，ubiquibody由与E3泛素连接酶融合的合成结合蛋白构成，因此能够进行翻译后泛素化和靶蛋白降解，而与其功能无关。在这里，基于来自细菌病原体的E3泛素连接酶模拟物设计了一组新的ubiquibody，该模拟物能够有效地与哺乳动物蛋白酶体降解机制相互作用，以选择性去除目标蛋白质。其中之一是融合至特异性识别绿色荧光蛋白(GFP)的III型纤连蛋白(FN3)抗体类似物的弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)效应蛋白IpaH9.8，观察到其有效地消除GFP及其光谱衍生物以及15种不同的带有FP标签的大小(27-179kDa)和亚细胞定位(细胞质、细胞核、膜相关和跨膜)变化的哺乳动物蛋白。为了证明ubiquibody的治疗相关递送，利用了生物仿生分子组装方法，由此将编码GFP特异性ubiquibody的合成mRNA与聚A结合蛋白共组装，并使用带有阳离子胺侧基的生物相容性、结构明确的多肽包装成纳米尺寸的复合物。所得纳米复合物以导致在稳定表达GFP的培养的哺乳动物细胞以及普遍表达GFP的转基因小鼠中有效靶标耗竭的方式递送ubiquibody mRNA。总体而言，此处给出的结果表明，基于IpaH9.8的ubiquibody是一种具有药理学调节致病蛋白潜力的高度模块化的蛋白质组编辑技术。

因此，本申请涉及基于一类新型嵌合分子的嵌合分子、组合物、治疗、药物组合物、蛋白质沉默技术、治疗剂的阐明和靶标筛选技术。此类嵌合体在本文中称为“ubiquibody”，其导入E3泛素酶的连接酶功能以产生具有靶标特异性的分子。此类工程化的嵌合体有助于特定底物靶标的重定向和蛋白水解降解，所述底物靶标可能不会以其他方式与蛋白酶体结合。

在这方面，靶向清除此类特定底物(例如细胞内蛋白质)可将广泛的科学和临床适应症归因于本文提供的嵌合分子、组合物、治疗、药物组合物、蛋白质沉默技术、治疗剂的阐明和筛选技术。因此，本申请基于通过泛素化对异常表达的基因进行蛋白水解降解而提供了多种有价值的用于采用和开发特定的预后和治疗应用的工具。

在此，寻求扩大可以在功能上重新编程为双功能uAb嵌合体的E3的范围。但是，与以前涉及哺乳动物E3的努力明显不同的是，重点反而是来自微生物病原体的一组效应蛋白，其模拟宿主E3泛素连接酶并强行控制UPP机制以减弱感染过程中的先天免疫应答。Maculins等人,“Bacteria-Host Relationship:Ubiquitin Ligases as Weapons ofInvasion.Cell Res.26(4):499-5l0(2016)和Lin等人,“Exploitation of the Host CellUbiquitin Machinery by Microbial Effector Proteins,”J.Cell Sci.130(12):1985-96(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文。这些酶的固有可塑性使我们假设可以操纵细菌E3进行靶向蛋白水解，就像其哺乳动物对应物一样。实际上，用由弗氏志贺氏菌E3连接酶IpaH9.8构成的uAb实现了强大的靶标沉默，uAb表现出与真核HECT型E3的相似性，但由于缺少与任何真核E3的序列和结构同源性而被归类为新型E3连接酶(“NEL”)。Maculins等人,“Bacteria-Host Relationship:Ubiquitin Ligases as Weapons of Invasion.CellRes.26(4):499-5l0(2016)；Lin等人,“Exploitation of the Host Cell UbiquitinMachinery by Microbial Effector Proteins,”J.Cell Sci.130(12):1985-96(2017)；Zhu等人,“Structure of a Shigella Effector Reveals a New Class of UbiquitinLigases,”Nat.Struct.Mol.Biol.15(12):1302-08(2008)；Singer等人,“A Pathogen TypeIII Effector With a Novel E3 Ubiquitin Ligase Architecture,”PLoS Pathogens 9(1):e1003 121(2013)；和Rohde等人,“Type III Secretion Effectors of the IpaHFamily are E3 Ubiquitin Ligases,”Cell Host Microbe 1(1):77-83(2007)，其全部内容特此通过引用并入本文。当IpaH9.8的C末端催化NEL结构域与特异性识别绿色荧光蛋白(“GFP”)的GFP特异性FN3抗体类似物GS2融合时，观察到在培养的哺乳动物细胞中瞬时和稳定表达后，EGFP有效降解。此外，GS2-IpaH9.8嵌合体还能够加速EGFP的光谱衍生物的降解，包括Emerald、Venus和Cerulean以及15种不同的带有FP标签的大小范围从27至179kDa并且定位于不同亚细胞区室(包括细胞质、细胞核和细胞膜)的哺乳动物蛋白。对于SHP2和Ras这两个靶标，当将IpaH9.8与SHP2或Ras特异性FN3结构域融合时，也实现了有效的沉默，突出了可以重新配置基于IpaH的uAb的便利性。

如前所述，uAb治疗发展的主要障碍是细胞内递送。Osherovich,L.,“DegradationFrom Within,”Science-Business Exchange 7:10-11(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文。与较小的可以设计用于细胞渗透性的PROTAC不同(Buckley等人,“Small-MoleculeControl of Intracellular Protein Levels Through Modulation of the UbiquitinProteasome System,”Angew Chem.Int.Ed.Engl.53(9):2312-30(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文)，uAb是较大的蛋白质，不能有效地穿透细胞膜。为了解决该问题，实施了生物仿生性mRNA递送策略，由此将以另外的3'-末端聚腺苷(“聚A”)尾编码GS2-IpaH的mRNA与聚A结合蛋白(“PABP”)化学计量络合，从而用于改善mRNA稳定性并且还刺激真核细胞中的mRNA翻译(Li等人,“Polyamine-Mediated Stoichiometric Assembly ofRibonucleoproteins for Enhanced mRNA Delivery,”Angew Chem.Int.Ed.Engl.56(44):13709-12(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文)。所得的核糖核蛋白(“RNP”)用阳离子多肽稳定化，以保护mRNA免于降解，使其能够被细胞摄取，并促进其内体逃逸。重要地是，这些共组装的纳米复合物以下述方式递送GS2-IpaH9.8 mRNA：导致在导入稳定表达GFP的培养的哺乳动物细胞后和向普遍表达GFP的转基因小鼠施用后引起有效的GFP沉默。总体而言，本文描述的结果表明，uAb介导的蛋白质组编辑是用于靶向降解细胞和小鼠中的蛋白质的有效策略，从而为将uAb作为药物发现工具和作为有可能在药理学上命中所谓的“无成药性”靶标的治疗候选物做好准备。

附图说明

图1A-1C描绘了将细菌E3连接酶IpaH9.8工程化为GFP特异性ubiquibody。图1A显示了IpaH9.8、IpaH9.8ΔLRR和GS2-IpaH9.8的线性表示。数字是指从N末端(“N”)至C末端(“C”)的氨基酸位置。蛋白质与IpaH9.8的LRR和NEL结构域垂直对齐。IpaH9.8ΔLRR是缺少LRR结构域的IpaH9.8的截短版本。图1B显示了所示的用质粒pcDNA3-EGFP单独转染或用pcDNA3-EGFP和编码一种基于细菌E3的uAb的质粒共转染的HEK293T细胞中EGFP荧光活性的流式细胞术分析，图1C与图1B相同，但在图1C中示出了基于哺乳动物E3的uAb。数据是针对单独表达EGFP的HEK283T细胞测得的MFI标准化的几何平均荧光强度(“MFI”)的一式三份生物学重复。误差棒代表平均值的标准偏差(“SD”)。

图2A-2D说明了IpaH9.8的催化结构域对于ubiquibody功能是必不可少的。图2A显示了通过在用pcDNA3-EGFP单独转染或用pcDNA3-EGFP和编码以下之一：GS2-IpaH9.8

图3A-3B显示GS2-IpaH9.8降解结构多样的荧光蛋白融合体。图3A描绘了用编码所示FP融合体的质粒(深灰色)单独转染或用FP融合质粒和pcDNA3-GS2-IpaH9.8

图4A-4C描绘了针对疾病相关靶标的IpaH9.8 ubiquibody。图4A说明了用pcDNA3-SHP2-EGFP单独转染或用pcDNA3-SHP2-EGFP和编码以下之一：GS2-IpaH9.8、GS2-IpaH9.8

图5A-5D描绘了通过ubiquibody mRNA的纳米复合物递送在小鼠中进行的蛋白质组编辑。图5A是多胺(TEP(N4))-介导的用于增强mRNA递送的mRNA/PABP核糖核蛋白的化学计量组装的示意图。在细胞内化后(灰色圆圈)，纳米复合物解体导致释放mRNA/PABP，其被降解或翻译以产生uAb蛋白。图5B描绘了在用编码GS2-IpaH9.8、GS2-IpaH9.8

图6A-6B描绘了带有细菌和哺乳动物E3泛素连接酶结构域的uAb导致的GFP沉默。通过在所示的用pcDNA3-EGFP单独转染或用pcDNA3-EGFP和编码由与(如图6A所示)细菌或(如图6B所示)哺乳动物E3泛素连接酶之一融合的GS2构成的uAb的质粒共转染的HEK293T细胞中EGFP荧光活性的流式细胞术分析获得的代表性荧光直方图。显示了几何平均荧光强度(“MFI”)的值。

图7A-7B显示了GS2-IpaH9.8结合活性和表达的表征。在图7A中，显示了与所示的单独的GS2、缺少LRR结构域的IpaH9.8(“IpaH9.8 LRR”)或催化惰性的GS2-IpaH9.8

图8A-8B描绘了uAb介导的FP变体和另外的FP融合蛋白靶标的沉默。图8A显示了所示的用编码FP变体和pcDNA3-GS2-IpaH9.8C337A(白色)或pcDNA3-GS2-IpaH9.8(灰色)的质粒共转染的HEK293T细胞中荧光活性的流式细胞术定量。mCherry用作阴性对照。数据是针对单独表达相应FP的HEK283T细胞测得的MFI标准化的几何MFI的一式三份生物学重复。误差棒代表平均值的标准偏差(SD)。图8B显示了用编码所示FP融合体(深灰色)的质粒单独转染或用FP融合质粒和pcDNA3-GS2-IpaH9.8C337A(白色)或pcDNA3-GS2-IpaH9.8(浅灰色)共转染的HEK293T细胞中荧光活性的流式细胞术定量。数据是针对单独表达相应FP的HEK283T细胞测得的MFI标准化的几何MFI的一式三份生物学重复。误差棒代表平均值的标准偏差(SD)。

图9A-9C示出了uAb平台的模块化。图9A显示了用编码EGFP的质粒DNA转染或用编码由与不同的所示GFP导向结合蛋白融合的IpaH9.8构成的uAb嵌合体的质粒共转染的HEK293T细胞中EGFP荧光活性的流式细胞术定量。图9B显示了HEK293T细胞中EGFP荧光活性的流式细胞术定量，所述HEK293T细胞瞬时或稳定表达所示EGFP、ERK2-EGFP、H2B-EGFP或EGFPHRasG12V。在所有情况下，均用编码pcDNA3-GS2-IpaH9.8C337A(白色)或pcDNA3-GS2-IpaH9.8(灰色)的质粒DNA瞬时转染细胞。图9C显示了稳定地整合有仅编码EGFP-HRasG12V、EGFP-HRasG12V和GS2-IpaH9.8、EGFPHRasG12V和GS2-IpaH9.8C337A或单独的GS2-IpaH9.8的DNA的MCF10a细胞中EGFP荧光活性的流式细胞术定量。所有数据是针对单独表达EGFP的HEK283T细胞测得的MFI标准化的几何MFI的一式三份生物学重复。误差棒代表平均值的标准偏差(SD)。

具体实施方式

应当理解，以下以各种详细程度描述本申请的某些方面、模式、实施例、变化和特征，以便提供对本技术的实质理解。下面提供了本说明书中使用的某些术语的定义。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语通常具有与本申请所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

在实践本申请的主题时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的多种常规技术。这些技术是众所周知的并且例如分别解释于Current Protocols in Molecular Biology,Vols.I—III,Ausubel编辑(1997)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约(1989))；DNA Cloning:A PracticalApproach,Vols.I and II,Glover编辑(1985)；Oligonucleotide Synthesis,Gait编辑(1984)；Nucleic Acid Hybridization,Hames&Higgins编辑(1985)；Transcription andTranslation,Hames&Higgins编辑(1984)；Animal Cell Culture,Freshney编辑(1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986)；Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning,the series,Meth.Enzymol.,(学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.),1984)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells,Miller&Calos编辑(冷泉港实验室，纽约(1987))；和Meth.Enzymol,Vols.154and 155,Wu&Grossman,和Wu编辑中，其所有的全部内容均通过引用并入本文。检测和测量多肽基因表达产物水平，即基因翻译水平的方法是本领域众所周知的，并且包括使用多肽检测方法，例如抗体检测和定量技术。还参见Strachan&Read,Human Molecular Genetics，第2版(约翰威利父子公司(JohnWiley and Sons,Inc.)，纽约(1999))，其全部内容特此通过引用并入本文。

本申请的第一方面涉及一种分离的嵌合分子。分离的嵌合分子包含降解结构域，该降解结构域包含E3泛素连接酶(E3)基序；能够特异性地将降解结构域引导至底物的靶向结构域，其中靶向结构域与降解结构域异源；以及将降解结构域与靶向结构域偶联的接头。

如本文所用，术语“嵌合分子”、“嵌合多肽”和“嵌合蛋白”涵盖具有如下序列的分子，该序列包括第一蛋白或多肽序列的全长序列的至少一部分和第二蛋白或多肽序列的全长序列的至少一部分，其中第一和第二蛋白或多肽是不同的蛋白或多肽。嵌合分子还涵盖蛋白质或多肽，该蛋白质或多肽包括两个或更多个衍生自相同蛋白或多肽的不连续部分。嵌合分子还涵盖具有至少一个取代的蛋白质或多肽，其中所述嵌合分子包括第一蛋白或多肽序列，其中第一蛋白或多肽序列的一部分已被第二蛋白或多肽序列的一部分替代。如本文所用，术语“嵌合分子”进一步指具有降解结构域和靶向区域的分子，如本文所例示的。降解结构域和靶向区域可以以本领域已知的方式连接。例如，它们可以经由本文所例示的接头分子连接、融合、共价连接、非共价连接等。此外，降解结构域和靶向区域可以不直接连接和/或连接可以是瞬时的，例如如果使用接头，则该接头可以是可裂解的或不可裂解的。

如本文所用，术语“泛素化”是指蛋白质泛素与其他分子的赖氨酸残基的连接。分子如肽或蛋白质的泛素化可以充当其快速细胞降解以及靶向蛋白酶体复合物的信号。

如本文所用，术语“ubiquibody”和“嵌合分子”可互换使用，并且是指至少具有通过接头区域连接的降解结构域和靶区域的分子，如本文所例示的。

如本文所用，术语“靶结构域”或“靶向结构域”或“靶向部分”是指与嵌合分子内的第二区域共价或非共价结合的多肽区域，与周围位置、细胞和/或组织相比，其增强了嵌合分子或组合物在靶亚细胞位置、细胞或相关组织中的浓度。

一致地，本申请的嵌合分子具有新的E3连接酶基序(在本文中称为例如“E3连接酶(EL)”)泛素区域，该泛素区域连接至可用于底物结合的靶向结构域。在一些实施例中，底物是细胞内底物。然而，为了促进多功能性，靶向结构域衍生自抗体类似物(例如，III型纤连蛋白结构域(“FN3”))、抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、抗体片段、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、tascFvs、bis-scFvs、sdAb、V

技术人员将容易地理解，在一些实施例中，此类靶向结构域具有与本文所述的新型E3连接酶基序区一致的细胞/组织特异性。在一个实施例中，靶向结构域结合至非天然底物。

如本文所用，术语抗体类似物可包括非免疫球蛋白分子的任何结合部分，包括例如FN3和DARPins，或含有结合位点的多肽，其特异性结合底物或与底物反应等。根据本申请的抗体类似物包括使用III型纤连蛋白结构域(“FN3”)作为分子支架构建的合成结合蛋白。抗体类似物是抗体的简单和强大的替代物，用于创建靶结合蛋白。抗体类似物属于一类分子，统称为抗体模拟物(或抗体类似物)和替代支架，旨在克服天然抗体分子的缺点。抗体类似物相对于常规抗体的主要优点是抗体类似物可以容易地用作遗传编码的细胞内抑制剂，即抗体类似物可以通过用抗体类似物表达载体转染细胞来在所选细胞中表达。这归因于FN3支架的基本特征：小(约90个残基)、稳定、易于生产并且其缺乏二硫键，这使得不管细胞环境的氧化还原电位(包括细胞质和细胞核的还原环境)如何，都能够生产功能性抗体类似物。在一个实施例中，靶向结构域是抗体类似物。所述抗体类似物可以是选自由GS2、Nsa5和RasInII组成的群组的III型纤连蛋白结构域(FN3)抗体类似物。GS2抗体类似物可以例如识别绿色荧光蛋白(“GFP”)。NSa5抗体类似物可能例如对SHP2的Src同源序列2(SH2)结构域具有特异性(Sha等人,“Dissection of the BCR-ABL Signaling Network Using HighlySpecific Monobody Inhibitors to the SHP2 SH2 Domains,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA110(37):14924-29(2013)，其全部内容特此通过引用并入本文)和对HRas、KRas和G12V突变体中的每一个具有特异性的RasInII(Cetin等人,“Raslns:Genetically EncodedIntrabodies of Activated Ras Proteins,”J.Mol.Biol.429(4):562-573(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文)。

作为抗体类似物的靶向结构域可以是例如III型纤连蛋白结构域(FN3)抗体类似物。FN3抗体类似物的实例包括但不限于(括号中为靶抗原)：GS2(GFP)、Nsa5(SHP2)、RasInI(HRas/KRas)和RasInII(HRas/KRas)、1D10(CDC34)、1D7(COPS5)、1C4(MAP2K5)、2C12(MAP2K5)、1E2(SF3A1)、1C2(USP11)、1A9(USP11)、Ubi4(泛素)、EI1.4.1(EGFR)、EI2.4.6(EGFR)、EI3.4.3(EGFR)、EI4.2.1(EGFR)、EI4.4.2(EGFR)、EI6.2.6(EGFR)、EI6.2.10(EGFR)、E246(EGFR)、C743(CEA)、IIIa8.2.6(FcγIIa)、IIIa6.2.6(FcγIIIa)、hA2.2.1(hA33)、hA2.2.2(hA33)、hA3.2.1(hA33)、hA3.2.3(hA33)、mA3.2.1(mA33)、mA3.2.2(mA33)、mA3.2.3(mA33)、mA3.2.4(mA33)、mA3.2.5(mA33)、Alb3.2.1(hAlb)、mI2.2.1(mIgG)、HA4(AblSH2)、HA10(AblSH2)、HA16(AblSH2)、HA18(AblSH2)、159(vEGFR)、MUC16(MSLN)、E2#3(ERα/EF)、E2#4(ERα/EF)、E2#5(ERα/EF)、E2#6(ERα/EF)、E2#7(ERα/EF)、E2#8(ERα/EF)、E2#9(ERα/EF)、E2#10(ERα/EF)、E2#11(ERα/EF)、E2#23(ERα/EF)、E3#2(ERα/EF)、E3#6(ERα/EF)、OHT#31(ERα/EF)、OHT#32(ERα/EF)、OHT#33(ERα/EF)、AB7-A1(ERα/EF)、AB7-B1(ERα/EF)、MBP-74(MBP)、MBP-76(MBP)、MBP-79(MBP)、hSUM04-33(hSUM04)、hSUMO-39(hSUM04)、ySUMO-53(ySUMO)、ySUMO-56(ySUMO)、ySUMO-57(ySUMO)、T14.25(TNFα)、T14.20(TNFα)、FNfn10-3JCL14(avβ3整联蛋白)、1C9(Src SH3)、1F11(Src SH3)、1F10(Src SH3)、2G10(SrcSH3)、2B2(Src SH3)、1E3(Src SH3)、E18(VEGFR2)、E19(VEGFR2)、E26(VEGFR2)、E29(VEGFR2)、FG4.2(溶菌酶)、FG4.1(溶菌酶)、2L4.1(溶菌酶)、BF4.1(溶菌酶)、BF4.9(溶菌酶)、BF4.4(溶菌酶)、BFs1c4.01(溶菌酶)、BFs1c4.07(溶菌酶)、BFs3_4.02(溶菌酶)、BFs3_4.06(溶菌酶)、BFs3_8.01(溶菌酶)、10C17C25(含磷IκBα)、Fn-N22(SARS N)、Fn-N17(SARSN)、FN-N10(SARS N)、gI2.5.3T88I(山羊IgG)、gI2.5.2(山羊IgG)、gI2.5.4(山羊IgG)、rI4.5.4(兔IgG)、rI4.3.1(兔IgG)、rI3.6.6(兔IgG)、rI4.3.4(兔IgG)、rI3.6.4(兔IgG)和rI4.3.3(兔IgG)。

如本文所用，术语抗体可包括免疫球蛋白和免疫球蛋白的任何抗原结合部分，例如IgG、IgD、IgA、IgM和IgE，或含有抗原结合位点的多肽，其与免疫原、抗原、底物等特异性或“免疫特异性结合”或“免疫相互作用”。抗体可包含通过至少一个二硫键相互连接的至少一条重(H)链和至少一条轻(L)链。术语“V

可用作本申请的靶向结构域的抗体相关分子、结构域、片段、部分等包括例如但不限于Fab、Fab'和F(ab')

如本文所用，术语“单克隆抗体”可以包括从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，包含该群体的各个抗体是相同的。然而，根据本申请使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，该杂交瘤方法首先由Kohler等人,“Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody ofPredefined Specificity,”Nature 256:495(1975)(其全部内容特此通过引用并入本文)描述，或可以通过重组DNA方法制备。参见，例如，美国专利第4,816,567号，其全部内容特此通过引用并入本文。也可以使用Clackson等人,“Making Antibody Fragments UsingPhage Display Libraries,”Nature 352:624-28(1991)和Marks等人,“By-PassingImmunization.Human Antibodies From V-Gene Libraries Displayed on Phage,”J.Mol.Biol.222:581-97(1991)(例如，其全部内容特此通过引用并入本文)描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。

如本文所用，术语“多克隆抗体”包括例如衍生自至少两(2)种不同的产生抗体的细胞系的抗体制剂。该术语的使用包括至少两(2)种抗体的制剂，其含有与抗原的不同表位或区域特异性结合的抗体。

如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”可以指Fv片段的两个结构域V

如本文所用，术语“可变的”可以例如是指在抗体之间可变结构域的某些区段的序列差异大的事实。V结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。但是，变异性并非在可变结构域的氨基酸范围内均匀分布。相反，V区由相对不变的15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的延伸组成，构架区被称为“高变区”的极端可变性的较短区域分开，高变区各自为9-12个氨基酸长。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，其主要采取β-折叠构型，通过三个高变区连接，所述高变区形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成。参见Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，公共卫生署(Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，贝塞斯达，马里兰州(1991)，其全部内容特此通过引用并入本文。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒效应(“ADCC”)。

本申请的靶向结构域可以是例如单特异性、双特异性、三特异性或具有更大的多特异性。多特异性靶向结构域可以对底物的不同表位具有特异性，或者可以对本申请的底物多肽以及异源组合物如异源多肽或固体支持物质具有特异性。参见例如WO 93/17715；WO92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,“Trispecific F(ab')3DerivativesThat Use Cooperative Signaling Via the TCR/CD3 Complex and CD2 to Activateand Redirect Resting Cytotoxic T Cells,”J Immunol.147:60-69(1991)；美国专利第5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648和6,106,835号；Kostelny等人,“Formation of a Bispecific Antibody by the Use of Leucine Zippers,”J.Immunol.148:1547-53(1992)，其全部内容特此通过引用并入本文。本申请的靶向结构域可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。例如，靶向结构域可以来自人、海洋、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。

产生针对靶底物的靶向结构域的技术是本领域技术人员众所周知的。此类技术的实例包括但不限于，例如涉及展示文库、xeno或humab小鼠、杂交瘤等的那些。在本申请范围内的靶多肽(从其衍生靶向结构域)包括能够显示抗原性的任何多肽或多肽衍生物。实例包括但不限于底物及其片段。在一些实施例中，靶向结构域是单链抗体。

单链抗体(“scFv”)是基因工程抗体，其由通过柔性区域在氨基末端与轻链的可变结构域连接的重链的可变结构域组成。在一些实施例中，scFv通过PCR从表达具有已知靶特异性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系产生，或者它们通过噬菌体展示从分离自脾细胞或淋巴细胞的文库中选择，并保持亲本抗体的亲和力。采用鉴定细胞内底物的方案，酵母双杂交技术用于鉴定候选scFv-蛋白质相互作用。此类系统可用于预测scFv是否能够在体内识别其靶底物。参见

通常，可以针对适当的抗原选择克隆到展示载体中的scFv、杂合抗体或杂合抗体片段，以鉴定保持良好结合活性的变体，因为抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒颗粒的表面上。参见例如Barbas III等人,Phage Display,A Laboratory Manual(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约2001)，其全部内容特此通过引用并入本文。然而，其他载体形式也可用于该方法，例如将抗体片段文库克隆到裂解噬菌体载体(修饰的T7或λZAP系统)中用于选择和/或筛选。

通常，可用于重组DNA技术的表达载体常常是质粒的形式。然而，本申请旨在包括在技术上不是质粒的表达载体的此类其他形式，例如病毒载体，如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒，其提供等同的功能。此类病毒载体允许感染受试者并在该受试者中表达化合物。表达控制序列通常是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体被整合到合适的宿主中，宿主就被维持在适于高水平表达编码靶结构域的核苷酸序列以及收集和纯化底物结合剂例如交叉反应性抗底物抗体的条件下。通常参见美国专利公开第2002/0199213号，其全部内容特此通过引用并入本文。载体也可编码信号肽，例如果胶酸裂解酶，可用于指导细胞外抗体片段的分泌。参见美国专利第5,576,195号，其全部内容特此通过引用并入本文。

如本文所用，术语“降解结构域”或“降解区”包括能够促进底物泛素化的嵌合分子的一部分。降解结构域可以具有用于与天然结合蛋白相互作用的第二“结合”区。结合区可以被修饰以具有一个或多个突变、取代、缺失，或者可以被完全缺失。

降解结构域可含有具有类似于真核生物E3的折叠的E3模拟物，例如HECT型、RING或U-box(RING/U-box)型和F-box结构域，以及具有不同于任何其他真核生物E3的折叠的非常规E3，例如NEL、含XL-box和SidC。降解结构域涉及能够通过将一个或多个泛素分子和/或泛素样分子连接至底物而修饰底物的多肽或多肽区。在这方面，此类区域与众所周知的泛素化级联(涉及El、E2和E3酶的协调作用)一致，其作用是激活泛素并伴随地将泛素缀合到底物上。在一些实施例中，基序是由新E3连接酶构成的泛素区或其片段，其以底物特异性方式催化泛素的转移。参见Qian等人.,“Engineering a Ubiquitin Ligase RevealsConformational Flexibility Required for Ubiquitin Transfer,”J.Biol.Chem.284(39):26797-802(2009)，其全部内容特此通过引用并入本文。

如本文所用，术语多肽、蛋白质、区域、结构域等的“修饰”或“氨基酸修饰”是指天然序列的改变，例如所需残基的缺失、添加或取代。通过将适当的核苷酸改变引入抗体核酸或通过肽合成来制备此类修饰的多肽。只要获得的抗体具有所需的特性，就可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得目标抗体。修饰还包括蛋白质糖基化模式的改变。识别诱变优选位置的可用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells,“High-ResolutionEpitope Mapping of hGH-Receptor Interactions by Alanine-ScanningMutagenesis,”Science 244:1081-85(1989)所述，其全部内容特此通过引用并入本文。然后针对所需的活性筛选突变的抗体。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用，是指其中氨基酸残基通过肽键或修饰的肽键连接的氨基酸链。氨基酸链可以具有大于两个氨基酸的任何长度。除非另有说明，否则术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”也涵盖其各种修饰形式。此类修饰形式可以是天然存在的修饰形式或化学修饰形式。修饰形式的实例包括但不限于糖基化形式、磷酸化形式、肉豆蔻酰化形式、棕榈酰化形式、核糖基化形式、乙酰化形式、泛素化形式等。修饰还包括分子内交联和共价连接至各种部分，例如脂质、黄素、生物素、聚乙二醇或其衍生物等。此外，修饰还可以包括环化、支化和交联。进一步地，多肽还可以包括除基因编码的常规二十个氨基酸以外的氨基酸。在一个实施例中，E3泛素连接酶基序(E3)，在本文中也称为EL或NEL，包含修饰的结合区，与没有修饰的结合区的所述E3基序相比，该结合区抑制或降低与所述底物的结合。在另一个实施例中，修饰是结合区中的突变或缺失。

如本文所用，术语“变体”或“突变体”用于指通过对天然存在的蛋白质或肽进行修饰但保留天然存在形式的基本蛋白质和侧链结构而与天然存在的蛋白质或肽(即“原型”或“野生型”蛋白质)不同的蛋白质或肽。此类变化包括但不限于：一个、几个或甚至若干个氨基酸侧链的变化；一个、几个或若干个氨基酸的变化，包括缺失，例如蛋白质或肽的截短形式、插入和/或取代；一个或几个原子的立体化学变化；和/或次要衍生化，包括但不限于：甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。与天然存在的蛋白质或肽相比，“变体”或“突变体”可以具有增强、降低、改变或基本相似的特性。

在一些实施例中，嵌合分子的降解结构域缺乏内源底物识别区，即与自然或天然结合伴侣相互作用的多肽的部分。与没有修饰结合区的E3基序相比，降解结构域的E3基序可以具有修饰的结合结构域，其抑制或减少与底物的结合。然而，在一些实施例中，E3基序允许底物的蛋白水解。在一些实施例中，修饰是结合区的突变、取代或缺失。该取代可以是氨基酸取代，例如保守或非保守氨基酸取代。

E3基序的非保守氨基酸取代是如下取代，其中烷基氨基酸被序列中的烷基氨基酸以外的氨基酸取代，芳族氨基酸被E3基序中的芳族氨基以外的氨基酸取代，含硫氨基酸被E3基序中的含硫氨基酸以外的氨基酸取代，含羟基氨基酸被E3基序中的含羟基氨基酸以外的氨基酸取代，酸性氨基酸被E3基序中的酸性氨基酸以外的氨基酸取代，碱性氨基酸被E3基序中的碱性氨基酸以外的氨基酸取代，或者二元一元羧氨基酸被E3基序中的二元一元羧氨基酸以外的氨基酸取代。

在常见氨基酸中，例如，“非保守氨基酸取代”由将以下组之一的氨基酸替换为来自不同组的氨基酸说明，如下所示：(1)甘氨酸、丙氨酸、(2)缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸、(3)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、(4)半胱氨酸和蛋氨酸、(5)丝氨酸和苏氨酸、(6)天冬氨酸和谷氨酸、(7)谷氨酰胺和天冬酰胺以及(8)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

可以通过用适当的核苷酸代替编码此类区域的核苷酸来引入例如E3基序中的保守或非保守氨基酸变化。这些修饰可通过例如寡核苷酸定向诱变、接头扫描诱变、使用聚合酶链反应的诱变等来获得。Ausubel等人(编辑),Short Protocols in MolecularBiology，第5版，约翰威利父子公司(2002)；通常参见，McPherson(编辑),DirectedMutagenesis:A Practical Approach,IRL Press(1991)，其全部内容特此通过引用并入本文。鉴定序列变异位置的可用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，由Cunningham和Wells“ProteinEngineering of Antibody Binding Sites:Recovery of Specific Activity in anAnti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli,”Science244:1081-85(1989)(其全部内容特此通过引用并入本文)描述。

泛素连接酶家族包括但不限于与以下的同源物：E6相关蛋白C末端(“HECT”)结构域连接酶，其涉及泛素从E2结合酶转移到底物，真正有趣的新基因(“RING”)结构域连接酶，其结合E2，可介导E2-E3复合物的酶促活性，以及U-box泛素连接酶家族(“UUL”)，其构成了修饰的RING基序连接酶家族，而没有完整的Zn

U-box泛素连接酶(“ULL”)的特征在于具有蛋白质结构域U-box，其与RING指在结构上相关，这是许多其他泛素连接酶的典型特征。在人类中，编码UUL的基因包括但不限于UBE4A和UBE4B基因(也分别称为UFD2b和UFD2a)、CHIP(也称为STUB1)、UIP5(也称为UBOX5)、PRP19(也称为PRPF19或SNEV)、CYC4(也称为PPIL2或Cyp-60)、WDSUB1和ACT1(也称为TRAF3IP2)。参见Marin,I,“Ancient Origin of Animal U-box Ubiquitin Ligases.”BMCEvolutionary Biology 10:331,pp.1-15(2010)，其全部内容特此通过引用并入本文。

尽管HECT E3连接酶在泛素化过程中具有直接的催化作用，但RING和U-box E3蛋白通过充当募集E2和底物分子以促进底物泛素化的接合体分子来促进蛋白质泛素化。尽管多种RING型E3连接酶如MDM2(鼠类双微体克隆2癌基因)和c-Cbl可能单独发挥作用，但发现其他一些则是更大的多蛋白复合物如后期促进复合物(“APC”)的组分。综上所述，这些多方面的特性和相互作用使E3酶能够为真核生物的所有细胞内的蛋白质清除提供强大和特定的机制。Ardley等人,“E3 Ubiquitin Ligases.”Essays Biochem.41:15-30(2005)，其全部内容特此通过引用并入本文。

尽管如此，有关E3基因产物的功能信息是可变的。U-box蛋白CHIP既充当辅助伴侣蛋白以及伴侣蛋白，例如Hsc70、Hsp70和Hsp90，也充当泛素连接酶，单独或作为可能包括其他E3蛋白的复合物的部分。参见上文。然而，泛素蛋白酶体系统对特定底物的选择性取决于泛素缀合酶如E2和泛素蛋白连接酶之间的相互作用。在泛素化之前，常常需要对蛋白质底物进行翻译后修饰，如例如磷酸化或羟基化。这样，可以实现特定底物的精确时空靶向和降解。

本文公开的降解结构域的E3基序具有功能性E3连接酶，其能够泛素化底物而不产生来自天然结合伴侣的空间破坏。在一些实施例中，除E3基序外，降解结构域还具有连接酶，该连接酶是具有类似于真核生物E3的折叠的E3模拟物，例如HECT型、RING或U-box(RING/U-box)型和F-box结构域，和具有不同于任何其他真核生物E3的折叠的非常规E3，例如NEL、含XL-box和SidC。此类结构域可以具有细胞或组织特异性。

在一个实施例中，嵌合分子的E3基序可以具有细胞类型特异性或组织特异性连接酶功能，包括但不限于皮肤细胞、肌肉细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞、脐带血管细胞、角膜细胞、心肌细胞、主动脉细胞、角膜上皮细胞、体细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、脂肪细胞、骨细胞、成骨细胞、气道细胞、微血管细胞、乳腺细胞、血管细胞、软骨细胞、胎盘细胞、肝细胞、神经胶质细胞、表皮细胞、角膜缘干细胞、牙周干细胞、骨髓基质细胞、杂交瘤细胞、肾细胞、胰岛、关节软骨细胞、成神经细胞、淋巴细胞和红细胞和/或其任何组合。

在一个实施例中，降解结构域来自细菌病原体，该病原体任选地选自志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、巴尔通氏体属(Bartonella)、博代氏杆菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)和嗜衣体属(Chlamydophila)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体(Mycoplasma)、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次体(Rickettsia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、脲原体属(Ureaplasma)、弧菌属(Vibrio)和耶尔森菌属(Yersinia)。更特别地，在另一个实施例中，细菌病原体是弗氏志贺氏菌。可以源自任何细菌的降解结构域可以来自例如弗氏志贺氏菌E3连接酶、SspH1、SspH2、SlrP、AvrPtoB、LubX、NleG5-1、NleG2-3、LegU1、LegAU13、NIeL、SopA、SidC、XopL、GobX、VirF、GALA、AnkB和/或SidE。

在一个实施例中，降解结构域是志贺氏菌属IpaH蛋白家族的成员，并且可以是IpaH9.8、IpaH1.4、IpaH2.5、IpaH4.5、IpaH7.8、IpaH0887、IpaH1389、IpaH2022、IpaH2202、IpaH2610和/或IpaH0722。志贺氏菌物种是高度适应的人类病原体，其引起细菌性痢疾(志贺氏菌病)。志贺氏菌通过III型分泌系统(T3SS)递送负责发病机理的致毒蛋白(效应子)子集，其功能包括细胞焦亡、上皮细胞入侵、细胞内存活以及逃避宿主免疫应答。

志贺氏菌拥有12个ipaH基因，它们位于大质粒和染色体上。参见例如，Ashida&Sasakawa,“Shigella IpaH Family Effectors as a Versatile Model for StudyingPathogenic Bacteria,”Front.Cell.Infect.Microbiol.5:100(2016)，其全部内容特此通过引用并入本文。IpaH家族蛋白含有N末端富亮氨酸重复序列(LRR)，并且在其保守的C末端区域具有E3泛素连接酶活性(Rohde等人,“Type III Secretion Effectors of the IpaHFamily are E3 Ubiquitin Ligase,”Cell Host Microbe.1:77-83(2007)和Ashida等人,“Exploitation of the Host Ubiquitin System by Human Bacterial Pathogens,”Nat.Rev.Microbiol.12:399 413(2014)，其两者的全部内容特此通过引用并入本文)。泛素化通过多酶级联催化的一系列反应完成：E1(泛素激活酶)、E2(泛素结合酶)和E3(泛素连接酶)。Ashida&Sasakawa,“Shigella IpaH Family Effectors as a Versatile Model forStudying Pathogenic Bacteria,”Front.Cell.Infect.Microbiol.5:100(2016)，其全部内容特此通过引用并入本文。泛素化级联通过在泛素的羧基末端Gly和E1的Cys之间形成硫酯键而从ATP依赖性泛素活化开始。同上。活化的泛素被转移到E2的活性位点Cys，并且最后E3连接酶介导泛素从E2到特定底物蛋白的转移(主要通过底物Lys残基进行)。同上。E3连接酶可根据其结构和功能分为两组：HECT(与E6-AP羧基末端同源)型和RING(真正有趣的新基因)/U-box型。同上。HECT型E3连接酶通过与其催化半胱氨酸残基形成硫酯键接受来自E2的泛素来催化泛素转移，然后将泛素转移至其靶底物。同上。另一方面，RING/U-box型E3连接酶通过充当支架分子来结合和募集E2-泛素复合物，然后直接将泛素从E2转移到E3结合的底物上，来催化直接的泛素转移。同上。

在动物和植物病原体中广泛保有IpaH家族蛋白，包括志贺氏菌(IpaH)、沙门氏菌(SspH1、SspH2和SlrP)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)和某些假单胞菌属物种，这说明了这些效应子在细菌感染中的重要性。同上。尽管IpaH家族蛋白具有E3泛素连接酶活性，并且其C末端结构域含有单一保守Cys，其形成类似于HECT型连接酶的Cys-泛素中间体，但IpaH家族成员的催化结构域在序列和结构水平上与真核生物E3泛素连接酶有所不同。同上。因此，现在认为IpaH家族蛋白构成了一类新的E3泛素连接酶NEL(新型E3连接酶)，其不同于典型的RING和HECT类型的E3泛素连接酶(Singer等人,“Structure of the Shigella T3SS effector IpaH Defines a NewClass of E3 Ubiquitin Ligases,”Nat.Struct.Mol.Biol.15:1293-1301(2008)；Zhu等人,“Structure of a Shigella Effector Reveals a New Class of UbiquitinLigases,”Nat.Struct.Mol.Biol.15:1302-08(2008)；Quezada等人,“A Family ofSalmonella Virulence Factors Functions as a Distinct Class of AutoregulatedE3 Ubiquitin Ligases,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:4864-69(2009)，其所有的全部内容均特此通过引用并入本文)。尽管IpaH家族蛋白彼此高度相似，但是其LRR区的序列(被视为底物识别位点)和亚细胞定位(例如，核、细胞质或质膜)是不同的。Ashida&Sasakawa,“Shigella IpaH Family Effectors as a Versatile Model for Studying PathogenicBacteria,”Front.Cell.Infect.Microbiol.5:100(2016)，其全部内容特此通过引用并入本文。

泛素连接酶家族也包括如Skp1-Cullin1-F-box(“SCF”)蛋白复合物中的“F-box”连接酶，其与泛素化的底物如例如Cdc 4结合，随后与靶蛋白如例如Sic1或Grr1相互作用，然后结合Cln。参见Bai等人,“SKP1 Connects Cell Cycle Regulators to the UbiquitinProteolysis Machinery through a Novel Motif,the F-Box,”Cell 86(2):263-74(1997)，其全部内容特此通过引用并入本文。

F-box是约50个氨基酸的蛋白质基序，其充当蛋白质-蛋白质相互作用的位点。参见例如Kipreos等人,“The F-box Protein family.”Genome Biol.1(5)(2000)，其全部内容特此通过引用并入本文。F-box蛋白首先被表征为SCF泛素-连接酶复合物的组分，其中它们结合底物以进行泛素介导的蛋白水解。F-box基序通过结合核心SCF组分Skp I将F-box蛋白与SCF复合物的其他组分连接。最近发现F-box蛋白通过非SCF蛋白复合物在多种细胞功能中发挥作用。参见上文。F-box蛋白常常包括能够进行蛋白质-蛋白质相互作用的其他羧基末端基序；酵母和人F-box蛋白中最常见的次级基序是WD重复序列和富亮氨酸重复序列，发现这两者都将磷酸化的底物与SCF复合物结合。参见上文。大多数F-box蛋白具有其他相关的基序，并且大多数这些蛋白的功能尚未被定义。参见上文。

F-box基序内最少的变异位置包括位置8(用于共识的234个F-box蛋白中的92％具有亮氨酸或蛋氨酸)、9(92％脯氨酸)、16(86％异亮氨酸或缬氨酸)、20(81％亮氨酸或蛋氨酸)和32(92％丝氨酸或半胱氨酸)。同上。缺乏严格的共识，使得技术人员采用多种搜索算法来检测F-box序列。例如，可以在Prosite和Pfam数据库中找到两种算法。有时候，一个数据库将对给定蛋白质中的F-box给出有效得分，而另一个数据库却没有检测到它，因此应搜索两个数据库。同上。

本申请的嵌合分子在原核生物中的表达最通常在具有含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体的大肠杆菌中进行。融合载体将多个氨基酸添加至其中编码的多肽，通常添加至重组多肽的氨基末端。此类融合载体通常服务于三个目的：(i)增加表达；(ii)增加溶解度；和(iii)通过在亲和纯化中充当配体来帮助纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解裂解位点，以使得在纯化融合多肽之后能够从融合部分分离重组多肽。此类酶及其内源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Smith和Johnson,“Single-StepPurification of Polypeptides Expressed in Escherichia coli as Fusions WithGlutathione S-Transferase,”Gene 67:31-40(1988)，其全部内容特此通过引用并入本文)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia，皮斯卡塔韦，新泽西州)，其将谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)、麦芽糖E结合多肽或多肽A分别与靶重组多肽融合。

合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann等人,“TightlyRegulated tac Promoter Vectors Useful for the Expression of Unfused and FusedProteins in Escherichia coli,”Gene 69:301-15(1988))和pET 1Id(Studier等人,GeneExpression Technology:Methods In Enzymology 185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，加利福尼亚州60-89(1990))，其全部内容特此通过引用并入本文。Pack等人，美国专利第6,294,353号；第6,692,935号(其全部内容特此通过引用并入本文)描述了通过多肽融合靶向组装不同的活性肽或蛋白质结构域以产生多功能多肽的方法。使重组多肽表达例如大肠杆菌中的本申请的嵌合分子最大化的一个策略是在宿主细菌中表达该多肽，其蛋白水解裂解重组嵌合体的能力受损。参见例如Gottesman,Gene Expression Technology:Methods In Enzymology 185，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州119-128(1990)，其全部内容特此通过引用并入本文。

在一些实施例中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达编码本申请的嵌合分子的核酸，包括降解结构域和靶向区。哺乳动物表达载体的实例包括，例如但不限于，pcDNA3、pCDM8(参见“An LFA-3cDNA Encodes a Phospholipid-Linked Membrane ProteinHomologous to its Receptor CD2,”Nature 329:840(1987)，其全部内容特此通过引用并入本文)和pMT2PC。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如，常用的启动子衍生自多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于用于原核和真核细胞两者的其他合适的表达系统，其可用于嵌合分子的靶向结构域、降解结构域的表达。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual的第16和17章，第2版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约,(1989)，其全部内容特此通过引用并入本文。

尽管嵌合分子E3降解结构域和靶向结构域表达，但此类结构域/区域的功能赋予了本申请的特异性。已知或未知的底物与靶向结构域结合，以通过降解结构域进行后续泛素化。在一些实施例中，底物包括但不限于细胞内底物、细胞外底物、修饰的底物、糖基化的底物、法尼基化的底物、翻译后修饰的底物、磷酸化的底物和本领域已知的其他修饰。

在一些实施例中，底物包括但不限于荧光蛋白、组蛋白、核定位信号(NLS)、H-Ras蛋白、含Src同源2结构域磷酸酶2(SHP2)、β-半乳糖苷酶、gpD、Hsp70、MBP、CDC34、COPS5、MAP2K5、SF3A1、USP11、泛素、EGFR、CEA、FcγIIa、FcγIIIa、hA33、mA33、hAlb、mIgG、AblSH2、vEGFR、MSLN、ERα/EF、hSUMO4、ySUMO、TNFα、avβ3整联蛋白、Src SH3、溶菌酶、含磷IκBα、SARSN、山羊IgG、兔IgG、翻译后修饰的蛋白、原纤蛋白、亨廷顿蛋白、致瘤蛋白、p53、Rb、粘附蛋白、受体、细胞周期蛋白、检查点蛋白、HFE、ATP7B、朊病毒蛋白、病毒蛋白、细菌蛋白、寄生蛋白、真菌蛋白、DNA结合蛋白、代谢蛋白、调节蛋白、结构蛋白、酶、免疫原性蛋白、自身免疫原性蛋白、免疫原、抗原、病原性蛋白等。在一个实施例中，底物是荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白、翠绿荧光蛋白、金星荧光蛋白、天蓝色荧光蛋白和增强的蓝绿色荧光蛋白。

如本文所用，术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸、L-氨基酸、D-氨基酸和合成氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团，例如正亮氨酸或修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以用它们众所周知的三个字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母符号来指代。

可用作根据本申请的降解结构域的示例性E3连接酶包括来自丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的E3泛素连接酶AvrPtoB，其是U-box基序，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列：

MAGINRAGPSGAYFVGHTDPEPVSGQAHGSGSGASSSNSPQVQPRPSNTPPSNAPAPPPTGRERLSRSTALSRQTREWLEQGMPTAEDASVRRRPQVTADAATPRAEARRTPEATADASAPRRGAVAHANSIVQQLVSEGADISHTRNMLRNAMNGDAVAFSRVEQNIFRQHFPNMPMHGISRDSELAIELRGALRRAVHQQAASAPVRSPTPTPASPAASSSGSSQRSLFGRFARLMAPNQGRSSNTAASQTPVDRSPPRVNQRPIRVDRAAMRNRGNDEADAALRGLVQQGVNLEHLRTALERHVMQRLPIPLDIGSALQNVGINPSIDLGESLVQHPLLNLNVALNRMLGLRPSAERAPRPAVPVAPATASRRPDGTRATRLRVMPEREDYENNVAYGVRLLNLNPGVGVRQAVAAFVTDRAERPAVVANIRAALDPIASQFSQLRTISKADAESEELGFKDAADHHTDDVTHCLFGGELSLSNPDQQVIGLAGNPTDTSQPYSQEGNKDLAFMDMKKLAQFLAGKPEHPMTRETLNAENIAKYAFRIVP

来自丁香假单胞菌的E3泛素连接酶AvrPtoB具有如下所示的SEQ ID NO：2的核苷酸序列：

ATGGCGGGTATCAATAGAGCGGGACCATCGGGCGCTTATTTTGTTGGCCACACAGACCCCGAGCCAGTATCGGGGCAAGCACACGGATCCGGCAGCGGCGCCAGCTCCTCGAACAGTCCGCAGGTTCAGCCGCGACCCTCGAATACTCCCCCGTCGAACGCGCCCGCACCGCCGCCAACCGGACGTGAGAGGCTTTCACGATCCACGGCGCTGTCGCGCCAAACCAGGGAGTGGCTGGAGCAGGGTATGCCTACAGCGGAGGATGCCAGCGTGCGTCGTAGGCCACAGGTGACTGCCGATGCCGCAACGCCGCGTGCAGAGGCAAGACGCACGCCGGAGGCAACTGCCGATGCCAGCGCACCGCGTAGAGGGGCGGTTGCACACGCCAACAGTATCGTTCAGCAATTGGTCAGTGAGGGCGCTGATATTTCGCATACTCGTAACATGCTCCGCAATGCAATGAATGGCGACGCAGTCGCTTTTTCTCGAGTAGAACAGAACATATTTCGCCAGCATTTCCCGAACATGCCCATGCATGGAATCAGCCGAGATTCGGAACTCGCTATCGAGCTCCGTGGGGCGCTTCGTCGAGCGGTTCACCAACAGGCGGCGTCAGCGCCAGTGAGGTCGCCCACGCCAACACCGGCCAGCCCTGCGGCATCATCATCGGGCAGCAGTCAGCGTTCTTTATTTGGACGGTTTGCCCGTTTGATGGCGCCAAACCAGGGACGGTCGTCGAACACTGCCGCCTCTCAGACGCCGGTCGACAGGAGCCCGCCACGCGTCAACCAAAGACCCATACGCGTCGACAGGGCTGCGATGCGTAATCGTGGCAATGACGAGGCGGACGCCGCGCTGCGGGGGTTAGTACAACAGGGGGTCAATTTAGAGCACCTGCGCACGGCCCTTGAAAGACATGTAATGCAGCGCCTCCCTATCCCCCTCGATATAGGCAGCGCGTTGCAGAATGTGGGAATTAACCCAAGTATCGACTTGGGGGAAAGCCTTGTGCAACATCCCCTGCTGAATTTGAATGTAGCGTTGAATCGCATGCTGGGGCTGCGTCCCAGCGCTGAAAGAGCGCCTCGTCCAGCCGTCCCCGTGGCTCCCGCGACCGCCTCCAGGCGACCGGATGGTACGCGTGCAACACGATTGCGGGTGATGCCGGAGCGGGAGGATTACGAAAATAATGTGGCTTATGGAGTGCGCTTGCTTAACCTGAACCCGGGGGTGGGGGTAAGGCAGGCTGTTGCGGCCTTTGTAACCGACCGGGCTGAGCGGCCAGCAGTGGTGGCTAATATCCGGGCAGCCCTGGACCCTATCGCGTCACAATTCAGTCAGCTGCGCACAATTTCGAAGGCCGATGCTGAATCTGAAGAGCTGGGTTTTAAGGATGCGGCAGATCATCACACGGATGACGTGACGCACTGTCTTTTTGGCGGAGAATTGTCGCTGAGTAATCCGGATCAGCAGGTGATCGGTTTGGCGGGTAATCCGACGGACACGTCGCAGCCTTACAGCCAAGAGGGAAATAAGGACCTGGCGTTCATGGATATGAAAAAACTTGCCCAATTCCTCGCAGGCAAGCCTGAGCATCCGATGACCAGAGAAACGCTTAACGCCGAAAATATCGCCAAGTATGCTTTTAGAATAGTCCCC

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH0722，其是新型E3连接酶(本文也称为NEL或EL)，具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列：

MKPAHNPSFFRSFCGLGCISRLSVEEQNITDYHRIWDNWAKEGAATEDRTQAVRLLKICLAFQEPALNLSLLRLRSLPYLPPHIQELNISSNELRSLPELPPSLTVLKASDNRLSRLPALPPHLVALDVSLNRVLTCLPSLPSSLQSLSALLNSLETLPDLPPALQKLSVGNNQLTALPELPCELQELSAFDNRLQELPPLPQNLRLLNVGENQLHRLPELPQRLQSLYIPNNQLNTLPDSIMNLHIYADVNIYNNPLSTRTLQALQRLTSSPDYHGPRIYFSMSDGQQNTLHRPLADAVTAWFPENKQSDVSQIWHAFEHEEHANTFSAFLDRLSDTVSARNTSGFREQVAAWLEKLSASAELRQQSFAVAADATESCEDRVALTWNNLRKTLLVHQASEGLFDNDTGALLSLGREMFRLEILEDIARDKVRTLHFVDEIEVYLAFQTMLAEKLQLSTAVKEMRFYGVSGVTANDLRTAEAMVRSREENEFTDWFSLWGPWHAVLKRTEADRWALAEEQKYEMLENEYPQRVADRLKASGLSGDADAEREAGAQVMRETEQQIYRQLTDEVLALRLPENGSQLHHS

来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH0722，其是新型E3连接酶，具有如下所示的SEQ ID NO：4的核苷酸序列：

ATGAAACCTGCCCACAATCCTTCTTTTTTCCGCTCCTTTTGTGGTTTAGGATGTATATCCCGTTTATCCGTAGAAGAGCAAAATATCACGGATTATCACCGCATCTGGGATAACTGGGCCAAGGAAGGTGCTGCAACAGAAGACCGAACACAGGCAGTTCGATTACTGAAAATATGTCTGGCTTTTCAAGAGCCAGCCCTCAATTTAAGTTTACTCAGATTACGCTCTCTCCCATACCTGCCCCCGCACATACAAGAACTTAACATCTCTAGCAATGAGCTACGCTCTCTGCCAGAACTCCCTCCGTCCTTAACTGTACTTAAAGCCAGCGATAACAGACTGAGCAGGCTCCCGGCTCTTCCGCCTCACCTGGTCGCTCTTGATGTTTCACTTAACAGAGTTTTAACATGTTTGCCTTCTCTTCCATCTTCCTTGCAGTCACTCTCAGCCCTTCTCAATAGCCTGGAGACGCTACCTGATCTTCCCCCGGCTCTACAAAAACTTTCTGTTGGCAACAACCAGCTTACTGCCTTACCAGAATTACCATGTGAACTACAGGAACTAAGTGCTTTTGATAACAGATTACAAGAGCTACCGCCCCTTCCTCAAAATCTGAGGCTTTTAAACGTTGGGGAAAACCAACTACACAGACTGCCCGAACTTCCACAACGTCTGCAATCACTATATATCCCTAACAATCAGCTGAACACATTGCCAGACAGTATCATGAATCTGCACATTTATGCAGATGTTAATATTTATAACAATCCATTGTCGACTCGCACTCTGCAAGCCCTGCAAAGATTAACCTCTTCGCCGGACTACCACGGCCCACGGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATACACTCCATCGCCCCCTGGCTGATGCCGTGACAGCATGGTTCCCGGAAAACAAACAATCTGATGTATCACAGATATGGCATGCTTTTGAACATGAAGAGCATGCCAACACCTTTTCCGCGTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCACGCAATACCTCCGGATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTGCGGAGCTTCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGAGAGCTGTGAGGACCGTGTCGCGCTCACATGGAACAATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTCCATCAGGCATCAGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCTACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCATGGCATGCTGTACTGAAGCGTACGGAAGCTGACCGCTGGGCGCTGGCAGAAGAGCAGAAATATGAGATGCTGGAGAATGAGTACCCTCAGAGGGTGGCTGACCGGCTGAAAGCATCAGGTCTGAGCGGTGATGCGGATGCGGAGAGGGAAGCCGGTGCACAGGTGATGCGTGAGACTGAACAGCAGATTTACCGTCAGCTGACTGACGAGGTACTGGCCCTGCGATTGCCTGAAAACGGCTCACAACTGCACCATTCATAA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3连接酶包括来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH1.4，其是新型E3连接酶，具有如下所示的SEQ ID NO：5的氨基酸序列：

MIKSTNIQAIGSGIMHQINNIYSLTPFPLPMELTPSCNEFYLKAWSEWEKNGTPGEQRNIAFNRLKICLQNQEAELNLSELDLKTLPDLPPQITTLEIRKNLLTHLPDLPPMLKVIHAQFNQLESLPALPETLEELNAGDNKIKELPFLPENLTHLRVHNNRLHILPLLPPELKLLVVSGNRLDSIPPFPDKLEGLAMANNFIEQLPELPFSMNRAVLMNNNLTTLPESVLRLAQNAFVNVAGNPLSGHTMRTLQQITTGPDYSGPRIFFSMGNSATISAPEHSLADAVTAWFPENKQSDVSQIWHAFEHEEHANTFSAFLDRLSDTVSARNTSGFREQVAAWLEKLSASAELRQQSFAVAADATESCEDRVALTWNNLRKTLLVHQASEGLFDNDTGALLSLGREMFRLEILEDIARDKVRTLHFVDEIEVYLAFQTMLAEKLQLSTAVKEMRFYGVSGVTANDLRTAEAMVRSREENEFKDWFSLWGPWHAVLKRTEADRWAQAEEQKYEMLENEYSQRVADRLKASGLSGDTDAEREAGAQVMRETEQQIYRQLTDEVLALRLSENGSNHIA

来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH1.4，其是新型E3连接酶，具有如下所示的SEQ ID NO：6的核苷酸序列：

ATGATTAAATCAACCAATATACAGGCAATCGGTTCTGGTATTATGCATCAAATAAACAATATATACTCGTTAACTCCATTTCCTTTACCTATGGAACTGACTCCATCTTGTAATGAATTTTATTTAAAAGCCTGGAGTGAATGGGAAAAGAACGGTACCCCAGGCGAGCAACGCAATATCGCCTTCAATAGGCTGAAAATATGTTTACAAAATCAAGAGGCAGAATTAAATTTATCTGAGTTAGATTTAAAAACATTACCAGATTTACCGCCTCAGATAACAACACTGGAAATAAGAAAAAACCTATTAACACATCTCCCTGATTTACCACCAATGCTTAAGGTAATACATGCTCAATTTAATCAACTGGAAAGCTTACCTGCCTTACCCGAGACGTTAGAAGAGCTTAATGCGGGTGATAACAAGATAAAAGAATTACCATTTCTTCCTGAAAATCTAACTCATTTACGGGTTCATAATAACCGATTGCATATTCTGCCACTATTGCCACCGGAACTAAAATTACTGGTAGTTTCTGGAAACAGATTAGACAGCATTCCCCCCTTTCCAGATAAGCTTGAAGGGCTGGCTATGGCTAATAATTTTATAGAACAACTACCGGAATTACCTTTTAGTATGAACAGGGCTGTGCTAATGAATAATAATCTGACAACACTTCCGGAAAGTGTCCTGAGATTAGCTCAGAATGCCTTCGTAAATGTTGCAGGTAATCCACTGTCTGGCCATACCATGCGTACACTACAACAAATAACCACCGGACCAGATTATTCTGGTCCTCGAATATTTTTCTCTATGGGAAATTCTGCCACAATTTCCGCTCCAGAACACTCCCTGGCTGATGCCGTGACAGCATGGTTCCCGGAAAACAAACAATCTGATGTATCACAGATATGGCATGCTTTTGAACATGAAGAGCACGCCAACACCTTTTCCGCGTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCACGCAATACCTCCGGATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTGCGGAGCTTCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGAGAGCTGTGAGGACCGTGTCGCGCTCACATGGAACAATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTCCATCAGGCATCAGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGAATTTAAGGACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCATGGCATGCTGTACTGAAGCGTACGGAAGCTGACCGCTGGGCGCAGGCAGAAGAGCAGAAGTATGAGATGCTGGAGAATGAGTACTCTCAGAGGGTGGCTGACCGGCTGAAAGCATCAGGTCTGAGCGGTGATACGGATGCGGAGAGGGAAGCCGGTGCACAGGTGATGCGTGAGACTGAACAGCAGATTTACCGTCAGTTGACTGACGAGGTACTGGCCCTGCGATTGTCTGAAAACGGCTCAAATCATATCGCATAA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH2.5，其是新型E3连接酶，具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列：

MLIRILVIMIKSTNIQAIGSGIMHQINNVYSLTPLSLPMELTPSCNEFYLKTWSEWEKNGTPGEQRNIAFNRLKICLQNQEAELNLSELDLKTLPDLPPQITTLEIRKNLLTHLPDLPPMLKVIHAQFNQLESLPALPETLEELNAGDNKIKELPFLPENLTHLRVHNNRLHILPLLPPELKLLVVSGNRLDSIPPFPDKLEGLALANNFIEQLPELPFSMNRAVLMNNNLTTLPESVLRLAQNAFVNVAGNPLSGHTMRTLQQITTGPDYSGPRIFFSMGNSATISAPEHSLADAVTAWFPENKQSDVSQIWHAFEHEEHANTFSAFLDRLSDTVSARNTSGFREQVAAWLEKLSASAELRQQSFAVAADATESCEDRVALTWNNLRKTLLVHQASEGLFDNDTGALLSLGREMFRLEILEDIARDKVRTLHFVDEIEVYLAFQTMLAEKLQLSTAVKEMRFYGVSGVTANDLRTAEAMVRSREENEFTDWFSLWGPWHAVLKRTEADRWAQAEEQKYEMLENEYSQRVADRLKASGLSGDADAEREAGAQVMRETEQQIYRQLTDEVLA

来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH2.5，其是新型E3连接酶，具有如下所示的SEQ ID NO：8的核苷酸序列：

ATGTTGATAAGAATTCTAGTTATAATGATTAAATCAACCAATATACAGGCAATCGGTTCTGGCATTATGCATCAAATAAACAATGTATACTCGTTAACTCCATTATCTTTACCTATGGAACTGACTCCATCTTGTAATGAATTTTATTTAAAAACCTGGAGCGAATGGGAAAAGAACGGTACCCCAGGCGAGCAACGCAATATCGCCTTCAATAGGCTGAAAATATGTTTACAAAATCAAGAGGCAGAATTAAATTTATCTGAGTTAGATTTAAAAACATTACCAGATTTACCGCCTCAGATAACAACACTGGAAATAAGAAAAAACCTATTAACACATCTCCCTGATTTACCACCAATGCTTAAGGTAATACATGCTCAATTTAATCAACTGGAAAGCTTACCTGCCTTACCCGAGACGTTAGAAGAGCTTAATGCGGGTGATAACAAGATAAAAGAATTACCATTTCTTCCTGAAAATCTAACTCATTTACGGGTTCATAATAACCGATTGCATATTCTGCCACTATTGCCACCGGAACTAAAATTACTGGTAGTTTCTGGAAACAGATTAGACAGCATTCCCCCCTTTCCAGATAAGCTTGAAGGGCTGGCTCTGGCTAATAATTTTATAGAACAACTACCGGAATTACCTTTTAGTATGAACAGGGCTGTGCTAATGAATAATAATCTGACAACACTTCCGGAAAGTGTCCTGAGATTAGCTCAGAATGCCTTCGTAAATGTTGCAGGTAATCCATTGTCTGGCCATACCATGCGTACACTACAACAAATAACCACCGGACCAGATTATTCTGGTCCTCGAATATTTTTCTCTATGGGAAATTCTGCCACAATTTCCGCTCCAGAACACTCCCTGGCTGATGCCGTGACAGCATGGTTCCCGGAAAACAAACAATCTGATGTATCACAGATATGGCATGCTTTTGAACATGAAGAGCATGCCAACACCTTTTCCGCGTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCACGCAATACCTCCGGATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTGCGGAGCTTCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGAGAGCTGTGAGGACCGTGTCGCGCTCACATGGAACAATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTCCATCAGGCATCAGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGATATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCTACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCATGGCATGCTGTACTGAAGCGTACGGAAGCTGACCGCTGGGCGCAGGCAGAAGAGCAGAAGTATGAGATGCTGGAGAATGAGTACTCTCAGAGGGTGGCTGACCGGCTGAAAGCATCAGGTCTGAGCGGTGATGCGGATGCGGAGAGGGAAGCCGGTGCACAGGTGATGCGTGAGACTGAACAGCAGATTTACCGTCAGTTGACTGACGAGGTACTGGCCTGA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH4.5，其是新型E3连接酶，并且具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列：

MKPINNHSFFRSLCGLSCISRLSVEEQCTRDYHRIWDDWAREGTTTENRIQAVRLLKICLDTREPVLNLSLLKLRSLPPLPLHIRELNISNNELISLPENSPLLTELHVNGNNLNILPTLPSQLIKLNISFNRNLSCLPSLPPYLQSLSARFNSLETLPELPSTLTILRIEGNRLTVLPELPHRLQELFVSGNRLQELPEFPQSLKYLKVGENQLRRLSRLPQELLALDVSNNLLTSLPENIITLPICTNVNISGNPLSTRVLQSLQRLTSSPDYHGPQIYFSMSDGQQNTLHRPLADAVTAWFPENKQSDVSQIWHAFEHEEHANTFSAFLDRLSDTVSARNTSGFREQVAAWLEKLSASAELRQQSFAVAADATESCEDRVALTWNNLRKTLLVHQASEGLFDNDTGALLSLGREMFRLEILEDIARDKVRTLHFVDEIEVYLAFQTMLAEKLQLSTAVKEMRFYGVSGVTANDLRTAEAMVRSREENEFTDWFSLWGPWHAVLKRTEADRWAQAEEQKYEMLENEYSQRVADRLKASGLSGDADAQREAGAQVMRETEQQIYRQLTDEVLA

来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH4.5，其是新型E3连接酶，具有如下所示的SEQ ID NO：10的核苷酸序列：

ATGAAACCGATCAACAATCATTCTTTTTTTCGTTCCCTTTGTGGCTTATCATGTATATCTCGTTTATCGGTAGAAGAACAGTGTACCAGAGATTACCACCGCATCTGGGATGACTGGGCTAGGGAAGGAACAACAACAGAAAATCGCATCCAGGCGGTTCGATTATTGAAAATATGTCTGGATACCCGGGAGCCTGTTCTCAATTTAAGCTTACTGAAACTACGTTCTTTACCACCACTCCCTTTGCATATACGTGAACTTAATATTTCCAACAATGAGTTAATCTCCCTACCTGAAAATTCTCCGCTTTTGACAGAACTTCATGTAAATGGTAACAACTTGAATATACTCCCGACACTTCCATCTCAACTGATTAAGCTTAATATTTCATTCAATCGAAATTTGTCATGTCTGCCATCATTACCACCATATTTACAATCACTCTCGGCACGTTTTAATAGTCTGGAGACGTTACCAGAGCTTCCATCAACGCTAACAATATTACGTATTGAAGGTAATCGCCTTACTGTCTTGCCTGAATTGCCTCATAGACTACAAGAACTCTTTGTTTCCGGCAACAGACTACAGGAACTACCAGAATTTCCTCAGAGCTTAAAATATTTGAAGGTAGGTGAAAATCAACTACGCAGATTATCCAGATTACCGCAAGAACTATTGGCTCTGGATGTTTCCAATAACCTACTAACTTCATTACCCGAAAATATAATCACATTGCCCATTTGTACGAATGTTAACATTTCAGGGAATCCATTGTCGACTCGCGTTCTGCAATCCCTGCAAAGATTAACCTCTTCGCCGGACTACCACGGCCCGCAGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATACACTCCATCGCCCCCTGGCTGATGCCGTGACAGCATGGTTCCCGGAAAACAAACAATCTGATGTATCACAGATATGGCATGCTTTTGAACATGAAGAGCATGCCAACACCTTTTCCGCGTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCACGCAATACCTCCGGATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTGCGGAGCTTCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGAGAGCTGTGAGGACCGTGTCGCGCTCACATGGAACAATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTCCATCAGGCATCAGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCATGGCATGCTGTACTGAAGCGTACGGAAGCTGACCGCTGGGCGCAGGCAGAAGAGCAGAAGTATGAGATGCTGGAGAATGAGTACTCTCAGAGGGTGGCTGACCGGCTGAAAGCATCAGGTCTGAGCGGTGATGCGGATGCGCAGAGGGAAGCCGGTGCACAGGTGATGCGTGAGACTGAACAGCAGATTTACCGTCAGCTGACTGACGAGGTACTGGCCTGA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH7.8，其是新型E3连接酶，并且具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列：

MFSVNNTHSSVSCSPSINSNSTSNEHYLRILTEWEKNSSPGEERGIAFNRLSQCFQNQEAVLNLSDLNLTSLPELPKHISALIVENNKLTSLPKLPAFLKELNADNNRLSVIPELPESLTTLSVRSNQLENLPVLPNHLTSLFVENNRLYNLPALPEKLKFLHVYYNRLTTLPDLPDKLEILCAQRNNLVTFPQFSDRNNIRQKEYYFHFNQITTLPESFSQLDSSYRINISGNPLSTRVLQSLQRLTSSPDYHGPQIYFSMSDGQQNTLHRPLADAVTAWFPENKQSDVSQIWHAFEHEEHANTFSAFLDRLSDTVSARNTSGFREQVAAWLEKLSASAELRQQSFAVAADATESCEDRVALTWNNLRKTLLVHQASEGLFDNDTGALLSLGREMFRLEILEDIARDKVRTLHFVDEIEVYLAFQTMLAEKLQLSTAVKEMRFYGVSGVTANDLRTAEAMVRSREENEFTDWFSLWGPWHAVLKRTEADRWAQAEEQKYEMLENEYSQRVADRLKASGLSGDADAEREAGAQVMRETEQQIYRQLTDEVLALRLSENGSRLHHS

来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH7.8，其是新型E3连接酶，具有如下所示的SEQ ID NO：12的核苷酸序列：

ATGTTCTCTGTAAATAATACACACTCATCAGTTTCTTGCTCCCCCTCTATTAACTCAAACTCAACCAGTAATGAACATTATCTGAGAATCCTGACTGAATGGGAAAAGAACTCTTCTCCCGGGGAAGAGCGAGGCATTGCTTTTAACAGACTCTCCCAGTGCTTTCAGAATCAAGAAGCAGTATTAAATTTATCAGACCTAAATTTGACGTCTCTTCCCGAATTACCAAAGCATATTTCTGCTTTGATTGTAGAAAATAATAAATTAACATCATTGCCAAAGCTGCCTGCATTTCTTAAAGAACTTAATGCTGATAATAACAGGCTTTCTGTGATACCAGAACTTCCTGAGTCATTAACAACTTTAAGTGTTCGTTCTAATCAACTGGAAAACCTTCCTGTTTTGCCAAACCATTTAACATCATTATTTGTTGAAAATAACAGGCTATATAACTTACCGGCTCTTCCCGAAAAATTGAAATTTTTACATGTTTATTATAACAGGCTGACAACATTACCCGACTTACCGGATAAACTGGAAATTCTCTGTGCTCAGCGCAATAATCTGGTTACTTTTCCTCAATTTTCTGATAGAAACAATATCAGACAAAAGGAATATTATTTTCATTTTAATCAGATAACCACTCTTCCGGAGAGTTTTTCACAATTAGATTCAAGTTACAGGATTAATATTTCAGGGAATCCATTGTCGACTCGCGTTCTGCAATCCCTGCAAAGATTAACCTCTTCGCCGGACTACCACGGCCCACAGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATACACTCCATCGCCCCCTGGCTGATGCCGTGACAGCATGGTTCCCGGAAAACAAACAATCTGATGTATCACAGATATGGCATGCTTTTGAACATGAAGAGCATGCCAACACCTTTTCCGCGTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCACGCAATACCTCCGGATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTGCGGAGCTTCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGAGAGCTGTGAGGACCGTGTCGCGCTCACATGGAACAATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTCCATCAGGCATCAGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCTACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCATGGCATGCTGTACTGAAGCGTACGGAAGCTGACCGCTGGGCGCAGGCAGAAGAGCAGAAGTATGAGATGCTGGAGAATGAGTACTCTCAGAGGGTGGCTGACCGGCTGAAAGCATCAGGTCTGAGCGGTGATGCGGATGCGGAGAGGGAAGCCGGTGCACAGGTGATGCGTGAGACTGAACAGCAGATTTACCGTCAGTTGACTGACGAGGTACTGGCCCTGCGATTGTCTGAAAACGGCTCACGACTGCACCATTCATAA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH9.8，其是新型E3连接酶，并且具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列：

MLPINNNFSLPQNSFYNTISGTYADYFSAWDKWEKQALPGEERDEAVSRLKECLINNSDELRLDRLNLSSLPDNLPAQITLLNVSYNQLTNLPELPVTLKKLYSASNKLSELPVLPPALESLQVQHNELENLPALPDSLLTMNISYNEIVSLPSLPQALKNLRATRNFLTELPAFSEGNNPVVREYFFDRNQISHIPESILNLRNECSIHISDNPLSSHALQALQRLTSSPDYHGPRIYFSMSDGQQNTLHRPLADAVTAWFPENKQSDVSQIWHAFEHEEHANTFSAFLDRLSDTVSARNTSGFREQVAAWLEKLSASAELRQQSFAVAADATESCEDRVALTWNNLRKTLLVHQASEGLFDNDTGALLSLGREMFRLEILEDIARDKVRTLHFVDEIEVYLAFQTMLAEKLQLSTAVKEMRFYGVSGVTANDLRTAEAMVRSREENEFTDWFSLWGPWHAVLKRTEADRWAQAEEQKYEMLENEYPQRVADRLKASGLSGDADAEREAGAQVMRETEQQIYRQLTDEVLALRLSENGSQLHHS

来自弗氏志贺氏菌的E3泛素连接酶IpaH9.8，其是新型E3连接酶，具有如下所示的SEQ ID NO：14的核苷酸序列：

ATGTTACCGATAAATAATAACTTTTCATTGCCCCAAAATTCTTTTTATAACACTATTTCCGGTACATATGCTGATTACTTTTCAGCATGGGATAAATGGGAAAAACAAGCGCTCCCCGGTGAAGAGCGTGATGAGGCTGTCTCCCGACTTAAAGAATGTCTTATCAATAATTCCGATGAACTTCGACTGGACCGTTTAAATCTGTCCTCGCTACCTGACAACTTACCAGCTCAGATAACGCTGCTCAATGTATCATATAATCAATTAACTAACCTACCTGAACTGCCTGTTACGCTAAAAAAATTATATTCCGCCAGCAATAAATTATCAGAATTGCCCGTGCTACCTCCTGCGCTGGAGTCACTTCAGGTACAACACAATGAGCTGGAAAACCTGCCAGCTTTACCCGATTCGTTATTGACTATGAATATCAGCTATAACGAAATAGTCTCCTTACCATCGCTCCCACAGGCTCTTAAAAATCTCAGAGCGACCCGTAATTTCCTCACTGAGCTACCAGCATTTTCTGAGGGAAATAATCCCGTTGTCAGAGAGTATTTTTTTGATAGAAATCAGATAAGTCATATCCCGGAAAGCATTCTTAATCTGAGGAATGAATGTTCAATACATATTAGTGATAACCCATTATCATCCCATGCTCTGCAAGCCCTGCAAAGATTAACCTCTTCGCCGGACTACCACGGCCCACGGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATACACTCCATCGCCCCCTGGCTGATGCCGTGACAGCATGGTTCCCGGAAAACAAACAATCTGATGTATCACAGATATGGCATGCTTTTGAACATGAAGAGCATGCCAACACCTTTTCCGCGTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCACGCAATACCTCCGGATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTGCGGAGCTTCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGAGAGCTGTGAGGACCGTGTCGCGCTCACATGGAACAATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTCCATCAGGCATCAGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGATATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCATGGCATGCTGTACTGAAGCGTACGGAAGCTGACCGCTGGGCGCAGGCAGAAGAGCAGAAATATGAGATGCTGGAGAATGAGTACCCTCAGAGGGTGGCTGACCGGCTGAAAGCATCAGGTCTGAGCGGTGATGCGGATGCGGAGAGGGAAGCCGGTGCACAGGTGATGCGTGAGACTGAACAGCAGATTTACCGTCAGCTGACTGACGAGGTACTGGCCCTGCGATTGTCTGAAAACGGCTCACAACTGCACCATTCATAA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的E3泛素连接酶LegAU13，其是F-box基序，并且具有SEQ IDNO：15的氨基酸序列：

MKKNFFSDLPEETIVNTLSFLKANTLARIAQTCQFFNRLANDKHLELHQLRQQHIKRELWGNLMVAARSNNLEEVKKILKKGIDPTQTNSYHLNRTPLLAAIEGKAYQTANYLWRKYTFDPNFKDNYGDSPISLLKKQLANPAFKDKEKKQIRALIRGMQEEKIAQSKCLVC

来自嗜肺军团菌的E3泛素连接酶LegAU13，其是F-box基序，具有如下所示的SEQID NO：16的核苷酸序列：

ATGAAAAAGAATTTTTTTTCTGATCTTCCTGAGGAAACAATTGTCAATACATTGAGTTTCTTAAAAGCAAACACACTAGCTCGTATAGCTCAGACATGTCAATTTTTTAATCGCTTGGCTAATGATAAACATCTGGAGCTGCATCAACTAAGACAACAGCATATAAAGCGAGAGCTATGGGGAAATCTTATGGTGGCGGCAAGAAGCAATAACCTGGAAGAGGTCAAAAAGATTCTAAAAAAAGGAATCGATCCAACCCAGACCAATAGCTACCACTTAAATAGAACGCCTTTACTTGCAGCTATCGAAGGAAAAGCATATCAAACTGCAAATTACCTCTGGAGAAAATACACTTTCGATCCCAATTTTAAAGATAACTATGGTGATTCACCTATCTCTCTTCTTAAAAAGCAACTGGCAAATCCAGCCTTCAAGGATAAGGAAAAAAAACAAATACGCGCCTTAATTAGGGGAATGCAAGAAGAAAAAATAGCACAGAGCAAGTGCCTTGTTTGTTAA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自嗜肺军团菌的E3泛素连接酶LegU1，其是F-box基序，并且具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列：

MKAKYDPTKPGLQKLPPEIKVMILEFLDAKSKLALSQTNYGWRDLILDRPEYTKEITNTLFRLDKKRHRQAIAQMMSGRVTASSMAKLFEELLCFSIPSSYVFLIFFASQKSVALIEVLTVILVFAAITSLAHDLVDYFIESDTKAEKQHAHRRAFQFFAQPSQSAAQQNLEEENLSADPKACQCEPL

来自嗜肺军团菌的E3泛素连接酶LegU1，其是F-box基序，具有如下所示的SEQ IDNO：18的核苷酸序列：

ATGAAAGCAAAATACGACCCCACAAAGCCTGGACTCCAAAAGTTACCTCCTGAAATCAAGGTAATGATTCTTGAGTTTCTTGATGCCAAATCAAAACTAGCTCTTTCACAGACAAATTATGGTTGGCGTGATTTAATTCTAGACCGGCCAGAATATACCAAAGAAATAACGAATACATTATTTCGTCTTGATAAAAAACGCCATCGTCAAGCAATAGCACAAATGATGTCAGGAAGAGTTACAGCAAGTTCTATGGCTAAGCTATTTGAAGAATTACTATGTTTTAGCATACCTTCGTCCTATGTGTTTTTAATCTTTTTCGCATCGCAAAAATCTGTGGCGCTTATAGAAGTCTTAACCGTAATCCTTGTGTTTGCTGCAATAACCTCTCTCGCCCATGATCTGGTGGATTATTTTATTGAAAGTGATACAAAAGCTGAGAAACAGCATGCACATCGCCGTGCTTTTCAATTCTTTGCCCAACCCAGTCAAAGCGCTGCACAACAAAACTTGGAGGAAGAGAATTTAAGTGCTGATCCCAAGGCCTGCCAATGTGAGCCATTGTAG

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自嗜肺军团菌的E3泛素连接酶LubX，其是U-box基序，并且具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列：

MATRNPFDIDHKSKYLREAALEANLSHPETTPTMLTCPIDSGFLKDPVITPEGFVYNKSSILKWLETKKEDPQSRKPLTAKDLQPFPELLIIVNRFVETQTNYEKLKNRLVQNARVAARQKEYTEIPDIFLCPISKTLIKTPVITAQGKVYDQEALSNFLIATGNKDETGKKLSIDDVVVFDELYQQIKVYNFYRKREVQKNQIQPSVSNGFGFFSLNFLTSWLWGTEEKKEKTSSDMTY

来自嗜肺军团菌的E3泛素连接酶LubX，其是U-box基序，具有如下所示的SEQ IDNO：20的核苷酸序列：

ATGGCGACGCGAAATCCTTTTGATATTGATCATAAAAGTAAATACTTAAGAGAAGCAGCATTAGAAGCCAATTTATCTCATCCAGAAACAACACCAACAATGCTGACTTGCCCTATTGACAGCGGATTTCTAAAAGATCCCGTGATCACACCTGAAGGTTTTGTTTATAATAAATCCTCTATTTTAAAATGGTTAGAAACGAAAAAAGAAGACCCACAAAGCCGTAAACCCTTAACGGCTAAAGATTTGCAACCATTCCCCGAGTTATTGATTATAGTCAATAGATTTGTTGAGACACAAACGAACTATGAAAAATTAAAAAACAGATTAGTGCAAAATGCTCGGGTTGCTGCACGCCAAAAAGAATACACTGAAATTCCGGATATATTTCTTTGCCCAATAAGTAAAACGCTTATCAAAACACCTGTCATTACTGCCCAAGGGAAAGTATATGATCAAGAAGCATTAAGTAACTTTCTTATCGCAACGGGTAATAAAGATGAAACAGGCAAAAAATTATCCATTGATGATGTAGTGGTGTTTGATGAACTCTATCAACAGATAAAAGTTTATAATTTTTACCGCAAACGCGAAGTGCAAAAAAATCAAATTCAACCTTCAGTAAGTAATGGTTTTGGCTTTTTTAGCTTGAATTTTCTCACCTCATGGTTATGGGGAACTGAGGAGAAAAAAGAAAAGACATCATCTGATATGACGTACTAA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的E3泛素连接酶NleG2-3，其是U-box基序，并且具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列：

MPLTSDIRSHSFNLGVEVVRARIVANGRGDITVGGETVSIVYDSTNGRFSSSGGNGGLLSELLLLGFNSGPRALGERMLSMLSDSGEAQSQESIQNKISQCKFSVCPERLQCPLEAIQCPITLEQPEKGIFVKNSDGSDVCTLFDAAAFSRLVGEGLPHPLTREPITASIIVKHEECIYDDTRGNFIIKGN

来自肠出血性大肠杆菌(“EHEC”)O157:H7的E3泛素连接酶NleG2-3，其是U-box基序，具有如下所示的SEQ ID NO：22的核苷酸序列：

ATGCCATTAACCTCAGATATTAGATCACATTCATTTAATCTTGGGGTGGAGGTTGTTCGTGCCCGAATTGTAGCCAATGGGCGCGGAGATATTACAGTCGGTGGTGAAACTGTCAGTATTGTGTATGATTCTACTAATGGGCGCTTTTCATCCAGTGGCGGTAATGGCGGATTGCTTTCTGAGTTATTGCTTTTGGGATTTAATAGTGGTCCTCGAGCCCTTGGTGAGAGAATGCTAAGTATGCTTTCGGACTCAGGTGAAGCACAATCGCAAGAGAGTATTCAGAACAAAATATCTCAATGTAAGTTTTCTGTTTGTCCAGAGAGACTTCAGTGCCCGCTTGAGGCTATTCAGTGTCCAATTACACTGGAGCAGCCTGAAAAAGGTATTTTTGTGAAGAATTCAGATGGTTCAGATGTATGTACTTTATTTGATGCCGCTGCATTTTCTCGTTTGGTTGGTGAAGGCTTACCCCACCCACTGACCCGGGAACCAATAACGGCATCAATAATTGTAAAACATGAAGAATGCATTTATGACGATACCAGAGGAAACTTCATTATAAAGGGTAATTGA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自肠出血性大肠杆菌(“EHEC”)O157:H7的E3泛素连接酶NleG5-1，其是U-box基序，并且具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列：

MPVDLTPYILPGVSFLSDIPQETLSEIRNQTIRGEAQIRLGELMVSIRPMQVNGYFMGSLNQDGLSNDNIQIGLQYIEHIERTLNHGSLTSREVTVLREIEMLENMDLLSNYQLEELLDKIEVCAFNVEHAQLQVPESLRTCPVTLCEPEDGVFMRNSMNSNVCMLYDKMALIHLVKTRAAHPLSRESIAVSMIVGRDNCAFDPDRGNFVLKN

来自肠出血性大肠杆菌(“EHEC”)O157:H7的E3泛素连接酶NleG5-1，其是U-box基序，具有如下所示的SEQ ID NO：24的核苷酸序列：

ATGCCTGTAGATTTAACGCCTTATATTTTACCTGGGGTTAGTTTTTTGTCTGACATTCCTCAAGAAACCTTGTCTGAGATACGTAATCAGACTATTCGTGGAGAAGCTCAAATAAGACTGGGTGAGTTGATGGTGTCAATACGACCTATGCAGGTAAATGGATATTTTATGGGAAGTCTTAACCAGGATGGTTTATCGAATGATAATATCCAGATTGGCCTTCAATATATAGAACATATTGAACGTACACTTAATCATGGTAGTTTGACAAGCCGTGAAGTTACAGTACTGCGTGAAATTGAGATGCTCGAAAATATGGATTTGCTTTCTAACTACCAGTTAGAGGAGTTGTTAGATAAAATTGAAGTATGTGCATTTAATGTGGAGCATGCACAATTGCAAGTGCCAGAGAGCTTACGAACATGCCCTGTTACATTATGTGAACCAGAAGATGGGGTATTTATGAGGAATTCAATGAATTCAAATGTTTGTATGTTGTATGATAAAATGGCATTAATACATCTTGTTAAAACAAGGGCGGCTCATCCTTTGAGCAGGGAATCAATCGCAGTTTCAATGATTGTAGGAAGAGATAATTGTGCTTTTGACCCTGACAGAGGTAACTTCGTTTTAAAAAATTAA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自肠出血性大肠杆菌(“EHEC”)O157:H7的E3泛素连接酶NleL，其是HECT基序，并且具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列：

MLPTTNISVNSGVISFESPVDSPSNEDVEVALEKWCAEGEFSENRHEVASKILDVISTNGETLSISEPITTLPDLLPGSLKELVLNGCTELKSINCLPPNLSSLSMVGCSSLEVINCSIPENVINLSLCHCSSLKHIEGSFPEALRNSVYLNGCNSLNESQCQFLAYDVSQGRACLSKAELTADLIWLSANRTGEESAEELNYSGCDLSGLSLVGLNLSSVNFSGAVLDDTDLRMSDLSQAVLENCSFKNSILNECNFCYANLSNCIIRALFENSNFSNSNLKNASFKGSSYIQYPPILNEADLTGAIIIPGMVLSGAILGDVKELFSEKSNTINLGGCYIDLSDIQENILSVLDNYTKSNKSILLTMNTSDDKYNHDKVRAAEELIKKISLDELAAFRPYVKMSLADSFSIHPYLNNANIQQWLEPICDDFFDTIMSWFNNSIMMYMENGSLLQAGMYFERHPGAMVSYNSSFIQIVMNGSRRDGMQERFRELYEVYLKNEKVYPVTQQSDFGLCDGSGKPDWDDDSDLAYNWVLLSSQDDGMAMMCSLSHMVDMLSPNTSTNWMSFFLYKDGEVQNTFGYSLSNLFSESFPIFSIPYHKAFSQNFVSGILDILISDNELKERFIEALNSNKSDYKMIADDQQRKLACVWNPFLDGWELNAQHVDMIMGSHVLKDMPLRKQAEILFCLGGVFCKYSSSDMFGTEYDSPEILRRYANGLIEQAYKTDPQVFGSVYYYNDILDRLQGRNNVFTCTAVLTDMLTEHAKESFPEIFSLYYPVAWR

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自肠出血性大肠杆菌(“EHEC”)O157:H7的E3泛素连接酶NleL，其是HECT基序，并且具有SEQ ID NO：26的核苷酸序列：

ATGCTGCCCACTACAAATATCTCTGTAAATTCTGGAGTAATATCTTTTGAAAGTCCTGTAGATTCACCATCTAACGAGGATGTTGAAGTTGCCCTCGAAAAGTGGTGTGCTGAGGGAGAATTTAGCGAAAATCGTCATGAGGTTGCATCAAAAATACTTGATGTTATAAGTACTAATGGAGAGACTTTATCAATCAGTGAGCCAATAACAACATTACCAGACTTGCTTCCAGGTTCTCTGAAAGAACTGGTTTTGAATGGATGTACAGAGCTTAAATCAATAAACTGCTTACCCCCCAACTTATCTTCATTAAGTATGGTTGGATGCTCATCATTAGAGGTTATAAATTGCAGCATACCTGAAAATGTCATTAATTTATCTTTATGCCATTGTAGTTCTTTGAAACATATAGAAGGTTCCTTTCCTGAGGCACTCAGAAATTCCGTATATTTAAATGGCTGTAATTCATTAAATGAATCGCAATGTCAATTCCTTGCATATGATGTCAGTCAAGGCCGTGCCTGCCTGAGCAAAGCTGAGCTTACTGCTGACTTAATTTGGTTGTCAGCTAACCGAACGGGTGAAGAGTCTGCTGAAGAATTGAATTACTCTGGATGTGACTTGTCAGGTCTAAGTCTTGTAGGGCTGAATTTATCATCAGTAAATTTTTCTGGAGCAGTGCTTGATGATACAGATCTCAGGATGAGTGATTTGTCTCAGGCTGTATTGGAAAACTGTTCTTTTAAAAACTCGATTTTGAATGAATGTAATTTTTGTTATGCTAATTTATCTAATTGTATTATTAGGGCTTTGTTTGAAAACTCTAATTTCAGCAATTCCAATCTTAAAAATGCATCATTTAAAGGATCTTCATATATACAATATCCTCCAATTTTGAACGAGGCTGATTTAACAGGAGCTATTATAATTCCTGGAATGGTTTTAAGTGGTGCTATCTTAGGTGATGTAAAGGAGCTCTTTAGTGAAAAAAGTAATACCATTAATCTAGGAGGGTGTTACATAGATCTATCTGACATACAGGAAAATATATTATCTGTGTTGGATAACTATACAAAATCAAATAAATCAATTTTATTGACTATGAATACATCTGATGATAAGTATAACCATGATAAAGTAAGGGCCGCTGAAGAACTTATCAAAAAAATATCTCTTGACGAATTAGCGGCGTTCCGGCCCTATGTTAAGATGTCTTTGGCTGATTCATTTAGTATTCATCCTTATTTGAACAACGCAAATATACAGCAATGGCTCGAGCCTATATGTGATGACTTTTTTGATACTATAATGTCTTGGTTTAATAATTCAATAATGATGTATATGGAGAATGGTAGTTTATTGCAGGCAGGGATGTATTTTGAGCGACATCCAGGTGCGATGGTATCTTATAATAGTTCCTTTATACAAATTGTAATGAATGGTTCACGGCGTGATGGAATGCAGGAACGATTTAGGGAACTCTATGAAGTATATTTAAAAAATGAAAAAGTTTATCCTGTCACACAGCAGAGTGATTTTGGATTGTGCGATGGCTCTGGGAAGCCTGACTGGGATGATGATTCCGATTTGGCTTATAACTGGGTTTTGTTATCATCACAGGATGATGGTATGGCAATGATGTGTTCTTTGAGTCATATGGTTGATATGTTATCTCCTAATACATCAACTAATTGGATGTCCTTTTTTTTATATAAGGATGGAGAAGTTCAAAATACATTTGGGTATTCATTGAGCAATCTTTTTTCTGAATCATTTCCAATTTTCAGTATTCCTTATCATAAAGCTTTTTCCCAGAATTTCGTTTCTGGTATTCTGGATATACTCATTTCTGATAATGAACTCAAAGAGAGATTTATTGAGGCACTTAATTCCAATAAATCAGATTATAAAATGATTGCTGATGATCAGCAAAGGAAACTTGCCTGTGTCTGGAATCCCTTTCTTGATGGTTGGGAACTGAACGCTCAGCATGTAGATATGATTATGGGGAGCCATGTATTGAAAGATATGCCACTAAGAAAACAGGCTGAAATATTATTTTGTTTAGGGGGGGTTTTCTGTAAATACTCATCGAGTGATATGTTTGGTACAGAGTATGATTCTCCTGAGATTCTACGGAGATATGCAAATGGATTGATTGAACAAGCTTATAAAACAGATCCTCAGGTATTTGGCTCAGTTTATTATTACAATGATATTTTAGACAGGCTACAAGGAAGAAATAATGTTTTTACTTGTACCGCTGTGCTGACTGATATGCTAACGGAGCATGCAAAAGAATCTTTTCCTGAAATATTTTCATTGTATTATCCTGTTGCGTGGCGTTGA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自嗜肺军团菌的E3泛素连接酶SidC，其是非常规基序，并且具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列：

MVINMVDVIKFKEPERCDYLYVDENNKVHILLPIVGGDEIGLDNTCQTAVELITFFYGSAHSGVTKYSAEHQLSEYKRQLEEDIKAINSQKKISPHAYDDLLKEKIERLQQIEKYIELIQVLKKQYDEQNDIRQLRTGGIPQLPSGVKEIIKSSENAFAVRLSPYDNDKFTRFDDPLFNVKRNISKYDTPSRQAPIPIYEGLGYRLRSTLFPEDKTPTPINKKSLRDKVKSTVLSHYKDEDRIDGEKKDEKLNELITNLQNELVKELVKSDPQYSKLSLSKDPRGKEINYDYLVNSLMLVDNDSEIGDWIDTILDATVDSTVWVAQASSPFYDGAKEISSDRDADKISIRVQYLLAEANIYCKTNKLSDANFGEFFDKEPHATEIAKRVKEGFTQGADIEPIIYDYINSNHAELGLKSPLTGKQQQEITDKFTKHYNTIKESPHFDEFFVADPDKKGNIFSHQGRISCHFLDFFTRQTKGKHPLGDLASHQEALQEGTSNRLHHKNEVVAQGYEKLDQFKKEVVKLLAENKPKELLDYLVATSPTGVPNYSMLSKETQNYIAYNRNWPAIQKELEKATSIPESQKQDLSRLLSRDNLQHDNLSAITWSKYSSKPLLDVELNKIAEGLELTAKIYNEKRGREWWFKGSRNEARKTQCEELQRVSKEINTLLQSESLTKSQVLEKVLNSIETLDKIDRDISAESNWFQSTLQKEVRLFRDQLKDICQLDKYAFKSTKLDEIISLEMEEQFQKIQDPAVQQIVRDLPSHCHNDEAIEFFKTLNPEEAAKVASYLSLEYREINKSTDKKTLLEQDIPRLFKEVNTQLLSKLKEEKAIDEQVHEKLSQLADKIAPEHFTRNNIIKWSTNPEKLEESNLNEPIKSVQSPTTKQTSKQFREAMGEITGRNEPPTDTLYTGIIKK

来自嗜肺军团菌的E3泛素连接酶SidC，其是非常规基序，具有如下所示的SEQ IDNO：28的核苷酸序列：

ATGGTGATAAACATGGTTGACGTAATCAAATTCAAAGAGCCGGAACGTTGTGATTATCTATATGTTGATGAAAACAACAAAGTTCATATCCTTTTACCGATTGTAGGAGGAGATGAAATAGGCCTGGATAATACCTGTCAAACAGCAGTTGAGTTGATCACATTTTTCTATGGTAGTGCGCACAGTGGTGTGACTAAATATTCTGCTGAACACCAACTCAGTGAATACAAAAGGCAATTGGAAGAAGACATCAAAGCCATCAATAGTCAAAAGAAAATTTCACCTCATGCTTATGACGATTTATTAAAAGAGAAAATAGAACGCTTACAGCAAATTGAAAAATACATTGAATTAATTCAAGTACTAAAAAAACAATATGATGAACAAAATGATATCAGGCAACTTCGTACTGGAGGGATTCCGCAATTACCCTCTGGGGTAAAGGAAATCATTAAATCCTCTGAAAATGCTTTCGCTGTGAGACTTTCTCCATATGACAACGATAAATTCACTCGCTTTGATGACCCTTTATTCAATGTCAAAAGAAACATCTCAAAATATGACACGCCCTCAAGACAAGCTCCTATTCCAATATACGAGGGATTAGGTTATCGCCTGCGTTCAACACTGTTCCCGGAAGATAAAACACCAACTCCAATTAATAAAAAATCACTTAGGGATAAAGTTAAAAGCACTGTTCTTAGTCATTATAAAGATGAAGATAGAATTGATGGAGAAAAAAAAGATGAAAAATTAAACGAACTAATTACTAATCTTCAAAACGAACTTGTAAAAGAGTTAGTAAAAAGTGATCCTCAATATTCGAAACTATCTTTATCTAAAGATCCAAGAGGAAAAGAAATAAATTACGATTATTTAGTAAATAGTTTGATGCTTGTAGATAACGACTCTGAAATTGGTGATTGGATTGATACTATTCTCGACGCTACAGTAGATTCCACTGTCTGGGTAGCTCAGGCATCCAGCCCTTTCTATGATGGTGCTAAAGAAATATCATCAGACCGCGATGCGGACAAGATATCCATCAGAGTTCAGTACCTGTTGGCCGAAGCCAATATTTACTGTAAAACAAACAAATTATCGGATGCTAACTTTGGAGAATTTTTCGACAAAGAGCCTCATGCTACTGAAATTGCGAAAAGAGTAAAGGAAGGATTTACGCAAGGTGCAGATATAGAACCAATTATATACGACTATATTAACAGCAACCATGCCGAGCTGGGATTAAAATCTCCGTTAACCGGCAAACAACAACAAGAAATCACTGATAAATTTACAAAACATTATAATACGATTAAAGAATCTCCACATTTTGATGAGTTTTTTGTCGCTGATCCGGATAAAAAAGGCAATATCTTTTCTCATCAAGGCAGAATCAGTTGTCATTTTCTGGATTTCTTTACTCGACAAACCAAAGGCAAACATCCTCTTGGTGATCTTGCAAGTCATCAGGAAGCTCTCCAGGAAGGAACCTCCAATCGCTTACATCACAAGAATGAGGTAGTAGCCCAGGGGTACGAAAAACTGGATCAATTCAAGAAAGAGGTTGTCAAACTGCTGGCTGAGAATAAACCAAAAGAATTATTGGATTATTTGGTTGCTACCTCACCTACAGGTGTTCCAAATTACTCCATGCTTTCGAAGGAAACTCAAAATTACATTGCTTATAATCGTAACTGGCCAGCCATTCAAAAAGAGCTGGAAAAGGCTACCAGCATCCCGGAGAGTCAAAAACAAGATCTTTCAAGATTGCTTTCTCGTGATAATTTACAACACGATAATCTAAGCGCAATTACCTGGTCAAAATATTCCTCCAAGCCATTATTGGATGTGGAATTAAATAAAATCGCTGAAGGATTAGAACTCACTGCAAAAATTTACAATGAAAAGAGAGGACGCGAATGGTGGTTTAAAGGTTCAAGAAATGAAGCTCGTAAGACCCAATGTGAAGAATTGCAAAGAGTATCCAAAGAAATCAATACTCTTCTGCAAAGTGAATCTTTAACGAAAAGCCAGGTACTTGAAAAGGTTTTAAATTCTATAGAAACATTAGATAAAATTGACAGAGACATTTCTGCCGAATCCAATTGGTTTCAAAGTACTCTGCAAAAGGAAGTCAGGTTATTTCGAGATCAATTGAAAGATATTTGCCAATTGGACAAGTATGCCTTTAAATCAACAAAACTTGATGAAATCATCTCTCTGGAAATGGAAGAACAATTTCAAAAGATACAAGATCCTGCTGTTCAACAAATTGTCAGGGACTTGCCTTCTCATTGCCACAATGATGAAGCAATTGAATTCTTTAAGACATTGAACCCTGAAGAGGCAGCAAAAGTAGCTAGCTATTTAAGCCTGGAATACAGGGAAATTAATAAATCAACCGATAAGAAAACTCTCCTAGAACAAGATATTCCCAGACTGTTTAAAGAAGTCAATACGCAGTTACTCTCCAAACTCAAAGAAGAAAAAGCTATTGATGAGCAAGTTCATGAAAAACTCAGTCAACTGGCTGACAAAATTGCCCCTGAGCATTTTACAAGAAATAACATTATAAAATGGTCTACCAACCCTGAAAAGCTTGAGGAATCAAATCTTAATGAGCCAATCAAATCAGTCCAAAGCCCTACTACTAAACAAACATCAAAACAATTCAGGGAAGCGATGGGTGAAATCACTGGAAGAAATGAGCCTCCTACAGACACTTTGTACACGGGAATTATAAAGAAATAG

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自EHECO157:H7的E3泛素连接酶SlrP，其是NEL基序，并且具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列：

MFNITNIQSTARHQSISNEASTEVPLKEEIWNKISAFFSSEHQVEAQNCIAYLCHPPETASPEEIKSKFECLRMLAFPAYADNIQYSRGGADQYCILSENSQEILSIVFNTEGYTVEGGGKSVTYTRVTESEQASSASGSKDAVNYELIWSEWVKEAPAKEAANREEPVQRMRDCLKNNKTELRLKILGLTTIPAYIPEQITTLILDNNELKSLPENLQGNIKTLYANSNQLTSIPATLPDTIQEMELSINRITELPERLPSALQSLDLFHNKISCLPENLPEELRYLSVYDNSIRTLPAHLPSEITHLNVQSNSLTALPETLPPGLKTLEAGENALTSLPASLPPELQVLDVSKNQITVLPETLPPTITTLDVSRNALTNLPENLPAALQIMQASRNNLVRLPESLPHFRGEGPQPTRIIVEYNPFSERTIQNMQRLMSSVDYQGPRVLVAMGDFSIVRVTRPLHQAVQGWLTSLEEEDVNQWRAFEAEANAAAFSGFLDYLGDTQNTRHPDFKEQVSAWLMRLAEDSALRETVFIIAMNATISCEDRVTLAYHQMQEATLVHDAERGAFDSHLAELIMAGREIFRLEQIESLAREKVKRLFFIDEVEVFLGFQNQLRESLSLTTMTRDMRFYNVSGITESDLDEAEIRIKMAENRDFHKWFALWGPWHKVLERIAPEEWREMMAKRDECIETDEYQSRVNAELEDLRIADDSDAERTTEVQMDAERAIGIKIMEEINQTLFTEIMENILLKKEVSSLMSAYWR

来自EHEC O157:H7的E3泛素连接酶SlrP，其是NEL基序，具有如下所示的SEQ IDNO：30的核苷酸序列：

ATGTTTAATATTACTAATATACAATCTACGGCAAGGCATCAAAGTATTAGCAATGAGGCCTCAACAGAGGTGCCTTTAAAAGAAGAGATATGGAATAAAATAAGTGCCTTTTTCTCTTCAGAACATCAGGTTGAAGCACAAAACTGCATCGCTTATCTTTGTCATCCACCTGAAACCGCCTCGCCAGAAGAGATCAAAAGCAAGTTTGAATGTTTAAGGATGTTAGCTTTCCCGGCGTATGCGGATAATATTCAGTATAGTAGAGGAGGGGCAGACCAATACTGTATTTTGAGTGAAAATAGTCAGGAAATTCTGTCTATAGTTTTTAATACAGAGGGCTATACCGTTGAGGGAGGGGGAAAGTCAGTCACCTATACCCGTGTGACAGAAAGCGAGCAGGCGAGTAGCGCTTCCGGCTCCAAAGATGCTGTGAATTATGAGTTAATCTGGTCTGAGTGGGTAAAAGAGGCGCCAGCGAAAGAGGCAGCAAATCGTGAAGAACCCGTACAACGGATGCGTGACTGCCTGAAAAATAATAAGACGGAACTTCGTCTGAAAATATTAGGACTTACCACTATACCTGCCTATATTCCTGAGCAGATAACTACTCTGATACTCGATAACAATGAACTGAAAAGTTTGCCGGAAAATTTACAGGGAAATATAAAGACCCTGTATGCCAACAGTAATCAGCTAACCAGTATCCCTGCCACGTTACCGGATACCATACAGGAAATGGAGCTGAGCATTAACCGTATTACTGAATTGCCGGAACGTTTGCCTTCAGCGCTTCAATCGCTGGATCTTTTCCATAATAAAATTAGTTGCTTACCTGAAAATCTACCTGAGGAACTTCGGTACCTGAGCGTTTATGATAACAGCATAAGGACACTGCCAGCACATCTTCCGTCAGAGATTACCCATTTGAATGTGCAGAGTAATTCGTTAACCGCTTTGCCTGAAACATTGCCGCCGGGCCTGAAGACTCTGGAGGCCGGCGAAAATGCCTTAACCAGTCTGCCCGCATCGTTACCACCAGAATTACAGGTCCTGGATGTAAGTAAAAATCAGATTACGGTTCTGCCTGAAACACTTCCTCCCACGATAACAACGCTGGATGTTTCCCGTAACGCATTGACTAATCTACCGGAAAACCTCCCGGCGGCATTACAAATAATGCAGGCCTCTCGCAATAACCTGGTCCGTCTCCCGGAGTCGTTACCCCATTTTCGTGGTGAAGGACCTCAACCTACAAGAATAATCGTAGAATATAATCCTTTTTCAGAACGAACAATACAGAATATGCAGCGGCTAATGTCCTCTGTAGATTATCAGGGACCCCGGGTATTGGTTGCCATGGGCGACTTTTCAATTGTTCGGGTAACTCGACCACTGCATCAAGCTGTCCAGGGGTGGCTAACCAGTCTCGAGGAGGAAGACGTCAACCAATGGCGGGCGTTTGAGGCAGAGGCAAACGCGGCGGCTTTCAGCGGATTCCTGGACTATCTTGGTGATACGCAGAATACCCGACACCCGGATTTTAAGGAACAAGTCTCCGCCTGGCTAATGCGCCTGGCTGAAGATAGCGCACTAAGAGAAACCGTATTTATTATAGCGATGAATGCAACGATAAGCTGTGAAGATCGGGTCACACTGGCATACCACCAAATGCAGGAAGCGACGTTGGTTCATGATGCTGAAAGAGGCGCCTTTGATAGCCACTTAGCGGAACTGATTATGGCGGGGCGTGAAATCTTTCGGCTGGAGCAAATAGAATCGCTCGCCAGAGAAAAGGTAAAACGGCTGTTTTTTATTGACGAAGTCGAAGTATTTCTGGGGTTTCAGAATCAGTTACGAGAGTCGCTGTCGCTGACAACAATGACCCGGGATATGCGATTTTATAACGTTTCGGGTATCACTGAGTCTGACCTGGACGAGGCGGAAATAAGGATAAAAATGGCTGAAAATAGGGATTTTCACAAATGGTTTGCGCTGTGGGGGCCGTGGCATAAAGTGCTGGAGCGCATAGCGCCAGAAGAGTGGCGTGAAATGATGGCTAAAAGGGATGAGTGTATTGAAACGGATGAGTATCAGAGCCGGGTCAATGCTGAACTGGAAGATTTAAGAATAGCAGACGACTCTGACGCAGAGCGTACTACTGAGGTACAGATGGATGCAGAGCGTGCTATTGGGATAAAAATAATGGAAGAGATCAATCAGACCCTCTTTACTGAGATCATGGAGAATATATTGCTGAAAAAAGAGGTGAGCTCGCTCATGAGCGCCTACTGGCGATAG

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的E3泛素连接酶SopA，其是HECT基序，并且具有SEQ IDNO：31的氨基酸序列：

MKISSGAINFSTIPNQVKKLITSIREHTKNGLTSKITSVKNTHTSLNEKFKTGKDSPIEFALPQKIKDFFQPKDKNTLNKTLITVKNIKDTNNAGKKNISAEDVSKMNAAFMRKHIANQTCDYNYRMTGAAPLPGGVSVSANNRPTVSEGRTPPVSPSLSLQATSSPSSPADWAKKLTDAVLRQKAGETLTAADRDFSNADFRNITFSKILPPSFMERDGDIIKGFNFSNSKFTYSDISHLHFDECRFTYSTLSDVVCSNTKFSNSDMNEVFLQYSITTQQQPSFIDTTLKNTLIRHKANLSGVILNEPDNSSPPSVSGGGNFIRLGDIWLQMPLLWTENAVDGFLNHEHNNGKSILMTIDSLPDKYSQEKVQAMEDLVKSLRGGRLTEACIRPVESSLVSVLAHPPYTQSALISEWLGPVQERFFAHQCQTYNDVPLPAPDTYYQQRILPVLLDSFDRNSAAMTTHSGLFNQVILHCMTGVDCTDGTRQKAAALYEQYLAHPAVSPHIHNGLFGNYDGSPDWTTRAADNFLLLSSQDSDTAMMLSTDTLLTMLNPTPDTAWDNFYLLRAGENVSTAQISPVELFRHDFPVFLAAFNQQATQRRFGELIDIILSTEEHGELNQQFLAATNQKHSTVKLIDDASVSRLATIFDPLLPEGKLSPAHYQHILSAYHLTDATPQKQAETLFCLSTAFARYSSSAIFGTEHDSPPALRGYAEALMQKAWELSPAIFPSSEQFTEWSDRFHGLHGAFTCTSVVADSMQRHARKYFPSVLSSILPLAWA

来自鼠伤寒沙门氏菌的E3泛素连接酶SopA，其是HECT基序，具有如下所示的SEQID NO：32的核苷酸序列：

ATGAAGATATCATCAGGCGCAATTAATTTTTCTACTATTCCTAACCAGGTTAAAAAATTAATTACCTCTATTCGTGAACATACGAAAAACGGGCTCACCTCAAAAATAACCAGTGTTAAAAACACGCATACATCTTTAAATGAAAAATTTAAAACAGGAAAGGACTCACCGATTGAGTTCGCGTTACCACAAAAAATAAAAGACTTCTTTCAGCCGAAAGATAAAAACACCTTAAACAAAACATTGATTACTGTTAAAAATATTAAAGATACAAATAATGCAGGCAAGAAAAATATTTCAGCAGAAGATGTCTCAAAAATGAATGCAGCATTCATGCGTAAGCATATTGCAAATCAAACATGTGATTATAATTACAGAATGACAGGTGCGGCCCCGCTCCCCGGTGGAGTCTCTGTATCAGCCAATAACAGGCCCACGGTTTCTGAAGGTAGAACACCACCAGTATCCCCCTCCCTCTCACTTCAGGCTACCTCTTCCCCGTCATCACCTGCCGACTGGGCTAAGAAACTCACGGATGCAGTTTTACGACAGAAAGCCGGAGAAACCCTTACGGCCGCAGATCGCGATTTTTCAAACGCAGATTTCCGTAATATTACATTCAGCAAAATATTGCCCCCCAGCTTCATGGAGCGAGACGGCGATATTATTAAGGGGTTCAACTTTTCAAATTCAAAATTTACTTATTCTGATATATCTCATTTACATTTTGACGAATGCCGATTCACTTATTCGACACTGAGTGATGTAGTCTGCAGTAATACGAAATTTAGTAATTCAGACATGAATGAAGTGTTTTTACAGTATTCAATTACTACACAACAACAGCCCTCGTTTATTGATACAACATTAAAAAATACGCTTATACGTCACAAAGCCAACCTCTCTGGCGTTATTTTAAATGAACCGGATAATTCATCACCTCCGTCAGTGTCAGGGGGCGGAAATTTTATTCGTCTAGGTGATATCTGGCTGCAAATGCCACTCCTTTGGACTGAGAACGCTGTGGATGGATTTTTAAATCATGAGCACAATAATGGTAAAAGTATTCTGATGACCATTGACAGCCTGCCCGATAAATACAGTCAGGAAAAAGTCCAGGCAATGGAAGACCTGGTTAAGTCATTGCGGGGTGGCCGCTTAACAGAGGCATGTATCCGGCCAGTTGAAAGTTCGCTGGTAAGCGTACTGGCCCACCCCCCCTATACGCAAAGTGCGCTTATCAGCGAGTGGCTCGGGCCTGTTCAGGAACGTTTTTTTGCCCACCAGTGCCAGACCTATAATGACGTTCCCCTGCCGGCTCCTGACACATATTATCAGCAGCGCATACTGCCTGTGTTGCTGGATTCGTTTGACAGGAACAGCGCCGCCATGACCACTCACAGCGGACTCTTTAATCAGGTGATTTTACACTGTATGACAGGCGTGGACTGCACTGATGGCACCCGCCAGAAAGCTGCAGCGCTTTATGAACAGTATCTTGCTCACCCGGCGGTGTCTCCCCACATCCATAATGGGCTCTTCGGCAATTATGATGGCAGCCCGGACTGGACAACCCGCGCTGCAGATAATTTCCTGCTGCTTTCCTCCCAAGATTCAGACACGGCGATGATGCTCTCCACTGACACGCTGTTAACAATGCTAAACCCTACTCCTGACACTGCATGGGACAACTTTTACCTGCTGCGAGCCGGAGAGAACGTTTCCACCGCGCAAATCTCTCCGGTAGAGTTATTCCGTCATGACTTTCCGGTGTTTCTCGCCGCATTTAATCAGCAGGCCACGCAGCGACGCTTTGGGGAGCTGATTGATATCATCCTCAGCACTGAAGAGCACGGGGAGCTGAACCAGCAGTTTCTTGCCGCCACGAACCAGAAACATTCCACCGTGAAGTTGATTGATGATGCCTCAGTGTCGCGTCTGGCCACCATTTTTGACCCCTTGCTTCCTGAAGGCAAACTCAGCCCGGCACACTACCAGCACATCCTCAGTGCTTATCACCTGACGGACGCCACCCCACAGAAGCAGGCGGAAACCCTGTTCTGTCTCAGTACCGCATTCGCACGCTATTCCTCCAGCGCCATTTTCGGCACTGAGCATGACTCTCCGCCGGCCCTGAGAGGCTATGCGGAGGCGCTGATGCAGAAAGCCTGGGAGCTGTCTCCGGCGATATTCCCATCCAGCGAACAGTTTACCGAGTGGTCCGACCGTTTTCACGGCCTCCATGGCGCCTTTACCTGTACCAGCGTTGTGGCGGATAGTATGCAACGTCATGCCAGAAAATATTTCCCGAGTGTTCTGTCATCCATCCTGCCACTGGCCTGGGCGTAA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自鼠伤寒沙门氏菌的E3泛素连接酶SspH1，其是新型E3连接酶基序，并且具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列：

MFNIRNTQPSVSMQAIAGAAAPEASPEEIVWEKIQVFFPQENYEEAQQCLAELCHPARGMLPDHISSQFARLKALTFPAWEENIQCNRDGINQFCILDAGSKEILSITLDDAGNYTVNCQGYSEAHDFIMDTEPGEECTEFAEGASGTSLRPATTVSQKAAEYDAVWSKWERDAPAGESPGRAAVVQEMRDCLNNGNPVLNVGASGLTTLPDRLPPHITTLVIPDNNLTSLPELPEGLRELEVSGNLQLTSLPSLPQGLQKLWAYNNWLASLPTLPPGLGDLAVSNNQLTSLPEMPPALRELRVSGNNLTSLPALPSGLQKLWAYNNRLTSLPEMSPGLQELDVSHNQLTRLPQSLTGLSSAARVYLDGNPLSVRTLQALRDIIGHSGIRIHFDMAGPSVPREARALHLAVADWLTSAREGEAAQADRWQAFGLEDNAAAFSLVLDRLRETENFKKDAGFKAQISSWLTQLAEDAALRAKTFAMATEATSTCEDRVTHALHQMNNVQLVHNAEKGEYDNNLQGLVSTGREMFRLATLEQIAREKAGTLALVDDVEVYLAFQNKLKESLELTSVTSEMRFFDVSGVTVSDLQAAELQVKTAENSGFSKWILQWGPLHSVLERKVPERFNALREKQISDYEDTYRKLYDEVLKSSGLVDDTDAERTIGVSAMDSAKKEFLDGLRALVDEVLGSYLTARWRLN

来自鼠伤寒沙门氏菌的E3泛素连接酶SspH1，其是新型E3连接酶基序，具有如下所示的SEQ ID NO：34的核苷酸序列：

ATGTTTAATATCCGCAATACACAACCTTCTGTAAGTATGCAGGCTATTGCTGGTGCAGCGGCACCAGAGGCATCTCCGGAAGAAATTGTATGGGAAAAAATTCAGGTTTTTTTCCCGCAGGAAAATTACGAAGAAGCGCAACAGTGTCTCGCTGAACTTTGCCATCCGGCCCGGGGAATGTTGCCTGATCATATCAGCAGCCAGTTTGCGCGTTTAAAAGCGCTTACCTTCCCCGCGTGGGAGGAGAATATTCAGTGTAACAGGGATGGTATAAATCAGTTTTGTATTCTGGATGCAGGCAGCAAGGAGATATTGTCAATCACTCTTGATGATGCCGGGAACTATACCGTGAATTGTCAGGGGTACAGTGAAGCACATGACTTCATCATGGACACAGAACCGGGAGAGGAATGCACAGAATTCGCGGAGGGGGCATCCGGGACATCCCTCCGCCCTGCCACAACGGTTTCACAGAAGGCAGCAGAGTATGATGCTGTCTGGTCAAAATGGGAAAGGGATGCACCAGCAGGAGAGTCACCCGGCCGCGCAGCAGTGGTACAGGAAATGCGTGATTGCCTGAATAACGGCAATCCAGTGCTTAACGTGGGAGCGTCAGGTCTTACCACCTTACCAGACCGTTTACCACCGCATATTACAACACTGGTTATTCCTGATAATAATCTGACCAGCCTGCCGGAGTTGCCGGAAGGACTACGGGAGCTGGAGGTCTCTGGTAACCTACAACTGACCAGCCTGCCATCGCTGCCGCAGGGACTACAGAAGCTGTGGGCCTATAATAATTGGCTGGCCAGCCTGCCGACGTTGCCGCCAGGACTAGGGGATCTGGCGGTCTCTAATAACCAGCTGACCAGCCTGCCGGAGATGCCGCCAGCACTACGGGAGCTGAGGGTCTCTGGTAACAACCTGACCAGCCTGCCGGCGCTGCCGTCAGGACTACAGAAGCTGTGGGCCTATAATAATCGGCTGACCAGCCTGCCGGAGATGTCGCCAGGACTACAGGAGCTGGATGTCTCTCATAACCAGCTGACCCGCCTGCCGCAAAGCCTCACGGGTCTGTCTTCAGCGGCACGCGTATATCTGGACGGGAATCCACTGTCTGTACGCACTCTGCAGGCTCTGCGGGACATCATTGGCCATTCAGGCATCAGGATACACTTCGATATGGCGGGGCCTTCCGTCCCCCGGGAAGCCCGGGCACTGCACCTGGCGGTCGCTGACTGGCTGACGTCTGCACGGGAGGGGGAAGCGGCCCAGGCAGACAGATGGCAGGCGTTCGGACTGGAAGATAACGCCGCCGCCTTCAGCCTGGTCCTGGACAGACTGCGTGAGACGGAAAACTTCAAAAAAGACGCGGGCTTTAAGGCACAGATATCATCCTGGCTGACACAACTGGCTGAAGATGCTGCGCTGAGAGCAAAAACCTTTGCCATGGCAACAGAGGCAACATCAACCTGCGAGGACCGGGTCACACATGCCCTGCACCAGATGAATAACGTACAACTGGTACATAATGCAGAAAAAGGGGAATACGACAACAATCTCCAGGGGCTGGTTTCCACGGGGCGTGAGATGTTCCGCCTGGCAACACTGGAACAGATTGCCCGGGAAAAAGCCGGAACACTGGCTTTAGTCGATGACGTTGAGGTCTATCTGGCGTTCCAGAATAAGCTGAAGGAATCACTTGAGCTGACCAGCGTGACGTCAGAAATGCGTTTCTTTGACGTTTCCGGCGTGACGGTTTCAGACCTTCAGGCTGCGGAGCTTCAGGTGAAAACCGCTGAAAACAGCGGGTTCAGTAAATGGATACTGCAGTGGGGGCCGTTACACAGCGTGCTGGAACGCAAAGTGCCGGAACGCTTTAACGCGCTTCGTGAAAAGCAAATATCGGATTATGAAGACACGTACCGGAAGCTGTATGACGAAGTGCTGAAATCGTCCGGGCTGGTCGACGATACCGATGCAGAACGTACTATCGGAGTAAGTGCGATGGATAGTGCGAAAAAAGAATTTCTGGATGGCCTGCGCGCTCTTGTGGATGAGGTGCTGGGTAGCTATCTGACAGCCCGGTGGCGTCTTAACTAA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自鼠伤寒沙门氏菌的E3泛素连接酶SspH2，其是新型E3连接酶基序，并且具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列：

MPFHIGSGCLPATISNRRIYRIAWSDTPPEMSSWEKMKEFFCSTHQTEALECIWTICHPPAGTTREDVINRFELLRTLAYAGWEESIHSGQHGENYFCILDEDSQEILSVTLDDAGNYTVNCQGYSETHRLTLDTAQGEEGTGHAEGASGTFRTSFLPATTAPQTPAEYDAVWSAWRRAAPAEESRGRAAVVQKMRACLNNGNAVLNVGESGLTTLPDCLPAHITTLVIPDNNLTSLPALPPELRTLEVSGNQLTSLPVLPPGLLELSIFSNPLTHLPALPSGLCKLWIFGNQLTSLPVLPPGLQELSVSDNQLASLPALPSELCKLWAYNNQLTSLPMLPSGLQELSVSDNQLASLPTLPSELYKLWAYNNRLTSLPALPSGLKELIVSGNRLTSLPVLPSELKELMVSGNRLTSLPMLPSGLLSLSVYRNQLTRLPESLIHLSSETTVNLEGNPLSERTLQALREITSAPGYSGPIIRFDMAGASAPRETRALHLAAADWLVPAREGEPAPADRWHMFGQEDNADAFSLFLDRLSETENFIKDAGFKAQISSWLAQLAEDEALRANTFAMATEATSSCEDRVTFFLHQMKNVQLVHNAEKGQYDNDLAALVATGREMFRLGKLEQIAREKVRTLALVDEIEVWLAYQNKLKKSLGLTSVTSEMRFFDVSGVTVTDLQDAELQVKAAEKSEFREWILQWGPLHRVLERKAPERVNALREKQISDYEETYRMLSDTELRPSGLVGNTDAERTIGARAMESAKKTFLDGLRPLVEEMLGSYLNVQWRRN

来自鼠伤寒沙门氏菌的E3泛素连接酶SspH2，其是新型E3连接酶基序，具有如下所示的SEQ ID NO：36的核苷酸序列：

ATGCCCTTTCATATTGGAAGCGGATGTCTTCCCGCCACCATCAGTAATCGCCGCATTTATCGTATTGCCTGGTCTGATACCCCCCCTGAAATGAGTTCCTGGGAAAAAATGAAGGAATTTTTTTGCTCAACGCACCAGACTGAAGCGCTGGAGTGCATCTGGACGATTTGTCACCCGCCGGCCGGAACGACGCGGGAGGATGTGATCAACAGATTTGAACTGCTCAGGACGCTCGCGTATGCCGGATGGGAGGAAAGCATTCATTCCGGCCAGCACGGGGAAAATTACTTCTGTATTCTGGATGAAGACAGTCAGGAGATATTGTCAGTCACCCTTGATGATGCCGGGAACTATACCGTAAATTGCCAGGGGTACAGTGAAACACATCGCCTCACCCTGGACACAGCACAGGGTGAGGAGGGCACAGGACACGCGGAAGGGGCATCCGGGACATTCAGGACATCCTTCCTCCCTGCCACAACGGCTCCACAGACGCCAGCAGAGTATGATGCTGTCTGGTCAGCGTGGAGAAGGGCTGCACCCGCAGAAGAGTCACGCGGCCGTGCAGCAGTGGTACAGAAAATGCGTGCCTGCCTGAATAATGGCAATGCAGTGCTTAACGTGGGAGAATCAGGTCTTACCACCTTGCCAGACTGTTTACCCGCGCATATTACCACACTGGTTATTCCTGATAATAATCTGACCAGCCTGCCGGCGCTGCCGCCAGAACTGCGGACGCTGGAGGTCTCTGGTAACCAGCTGACTAGCCTGCCGGTGCTGCCGCCAGGACTACTGGAACTGTCGATCTTTAGTAACCCGCTGACCCACCTGCCGGCGCTGCCGTCAGGACTATGTAAGCTGTGGATCTTTGGTAATCAACTGACCAGCCTGCCGGTGTTGCCGCCAGGGCTACAGGAGCTGTCGGTATCTGATAACCAACTGGCCAGCCTGCCGGCGCTGCCGTCAGAATTATGTAAGCTGTGGGCCTATAATAACCAGCTGACCAGCCTGCCGATGTTGCCGTCAGGGCTACAGGAGCTGTCGGTATCTGATAACCAACTGGCCAGCCTGCCGACGCTGCCGTCAGAATTATATAAGCTGTGGGCCTATAATAATCGGCTGACCAGCCTGCCGGCGTTGCCGTCAGGACTGAAGGAGCTGATTGTATCTGGTAACCGGCTGACCAGTCTGCCGGTGCTGCCGTCAGAACTGAAGGAGCTGATGGTATCTGGTAACCGGCTGACCAGCCTGCCGATGCTGCCGTCAGGACTACTGTCGCTGTCGGTCTATCGTAACCAGCTGACCCGCCTGCCGGAAAGTCTCATTCATCTGTCTTCAGAGACAACCGTAAATCTGGAAGGGAACCCACTGTCTGAACGTACTTTGCAGGCGCTGCGGGAGATCACCAGCGCGCCTGGCTATTCAGGCCCCATAATACGATTCGATATGGCGGGAGCCTCCGCCCCCCGGGAAACTCGGGCACTGCACCTGGCGGCCGCTGACTGGCTGGTGCCTGCCCGGGAGGGGGAACCGGCTCCTGCAGACAGATGGCATATGTTCGGACAGGAAGATAACGCCGACGCATTCAGCCTCTTCCTGGACAGACTGAGTGAGACGGAAAACTTCATAAAGGACGCGGGGTTTAAGGCACAGATATCGTCCTGGCTGGCACAACTGGCTGAAGATGAGGCGTTAAGAGCAAACACCTTTGCTATGGCAACAGAGGCAACCTCAAGCTGCGAGGACCGGGTCACATTTTTTTTGCACCAGATGAAGAACGTACAGCTGGTACATAATGCAGAAAAAGGGCAATACGATAACGATCTCGCGGCGCTGGTTGCCACGGGGCGTGAGATGTTCCGTCTGGGAAAACTGGAACAGATTGCCCGGGAAAAGGTCAGAACGCTGGCTCTCGTTGATGAAATTGAGGTCTGGCTGGCGTATCAGAATAAGCTGAAGAAATCACTCGGGCTGACCAGCGTGACGTCAGAAATGCGTTTCTTTGACGTATCCGGCGTGACGGTTACAGACCTTCAGGACGCGGAGCTTCAGGTGAAAGCCGCTGAAAAAAGCGAGTTCAGGGAGTGGATACTGCAGTGGGGGCCGTTACACAGAGTGCTGGAGCGCAAAGCGCCGGAACGCGTTAACGCGCTTCGTGAAAAGCAAATATCGGATTATGAGGAAACGTACCGGATGCTGTCTGACACAGAGCTGAGACCGTCTGGGCTGGTCGGTAATACCGATGCAGAGCGCACTATCGGAGCAAGAGCGATGGAGAGCGCGAAAAAGACATTTTTGGATGGCCTGCGACCTCTTGTGGAGGAGATGCTGGGGAGCTATCTGAACGTTCAGTGGCGTCGTAACTGA

可用作根据本申请的降解结构域的另一示例性E3泛素连接酶包括来自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的E3泛素连接酶XopL，其是非常规基序，并且具有SEQID NO：37的氨基酸序列：

MRRVDQPRPPGTPFGLREQTTSNADAPARTAPPAHPAPERPTGMLGGLTRYVPGDRSGRPPAMPAAAETSRRPTTSARPLPYGGSGSAARMNEAAGHPLRMPQLPQLSDIERARFHSVTTDSQHLRPVRPRMPPPVGASPLRRSTALRPYHDVLSQWQRHYNADRNRWHSAWRQANSNNPQIETRTGRALKATADLLEDATQPGRVALELRSVPLPQFPDQAFRLSHLQHMTIDAAGLMELPDTMQQFAGLETLTLARNPLRALPASIASLNRLRELSIRACPELTELPEPLASTDASGEHQGLVNLQSLRLEWTGIRSLPASIANLQNLKSLKIRNSPLSALGPAIHHLPKLEELDLRGCTALRNYPPIFGGRAPLKRLILKDCSNLLTLPLDIHRLTQLEKLDLRGCVNLSRLPSLIAQLPANCIILVPPHLQAQLDQHRPVARPAEPGRTGPTTPALSPSAAGDRAGPSSSATASELLLTAALERIEDTAQAMLSTVIDEERNPFLEGAPSYLPGKRPTDVTTFGQVPALRDMLAESRDLEFLQRVSDMAGPSPRIEDPSEEGLARHYTNVSNWKAQKSAHLGIVDHLGQFVYHEGSPLDVATLAKAVQMWKTRELIVHAHPQDRARFPELAVHIPEQVSDDSDSEQQTSPEPSGHQ

来自野油菜黄单胞菌的E3泛素连接酶XopL，其是非常规基序，具有如下所示的SEQID NO：38的核苷酸序列：

ATGCGACGCGTCGATCAACCACGCCCGCCGGGCACGCCTTTCGGACTGCGGGAGCAGACTACGTCCAATGCGGATGCGCCCGCGCGCACTGCCCCACCCGCACACCCCGCGCCCGAGCGCCCTACCGGCATGCTCGGCGGACTGACCAGATATGTGCCTGGCGATCGGTCCGGGCGACCGCCAGCAATGCCTGCCGCTGCCGAGACCTCTCGCCGGCCAACCACCTCCGCCCGCCCGCTTCCCTACGGCGGATCCGGCAGCGCCGCGCGGATGAACGAGGCGGCTGGACATCCTTTGCGGATGCCGCAATTGCCACAGCTCAGCGACATAGAACGCGCTCGCTTCCACTCCGTCACCACCGACTCGCAACACTTGCGGCCGGTGCGCCCCCGTATGCCACCGCCCGTGGGCGCTTCACCCTTACGGCGCTCCACAGCGCTGCGCCCGTACCACGACGTGCTGTCGCAATGGCAACGCCACTACAACGCAGATCGCAATCGCTGGCACAGCGCATGGCGCCAGGCCAACAGCAACAACCCGCAGATCGAGACTCGCACAGGCCGGGCGCTGAAGGCGACAGCCGACCTGCTGGAGGACGCAACCCAACCGGGCCGGGTCGCGCTGGAGCTGCGCTCAGTTCCGCTGCCGCAATTTCCCGACCAGGCATTCCGTCTTTCGCATCTGCAGCACATGACGATCGACGCGGCAGGGTTGATGGAGCTCCCGGACACCATGCAGCAATTTGCGGGCCTGGAAACACTCACGCTCGCACGCAATCCGCTTCGCGCGCTACCGGCATCCATCGCAAGCCTCAACCGATTACGCGAGCTCTCCATCCGCGCCTGCCCGGAATTGACGGAACTTCCCGAACCCCTGGCAAGCACCGATGCATCCGGCGAGCACCAGGGCTTGGTCAACCTGCAGAGCCTACGGCTGGAATGGACCGGGATCAGATCGCTTCCGGCGTCCATCGCCAACCTGCAAAATCTGAAAAGCCTGAAGATACGCAACTCGCCGCTGTCCGCCCTTGGCCCGGCCATCCATCACCTGCCAAAGTTGGAGGAGCTTGATTTGCGGGGCTGTACCGCGCTGCGCAACTATCCGCCGATTTTCGGCGGCCGTGCGCCACTGAAGCGACTGATTCTGAAAGACTGCAGCAACCTGCTCACGCTGCCACTGGACATTCACCGCCTGACGCAGCTGGAAAAACTCGATCTGCGAGGTTGCGTCAACCTTTCCAGACTGCCCTCGTTGATCGCCCAATTACCTGCCAATTGCATCATCCTGGTGCCGCCGCATCTCCAAGCGCAGCTCGACCAGCATCGTCCAGTTGCGCGCCCCGCCGAACCAGGGCGGACCGGACCGACCACCCCAGCTCTCTCGCCCTCTGCTGCCGGCGACCGCGCCGGGCCATCCTCTTCGGCGACCGCCAGCGAACTGCTTCTTACCGCTGCGCTCGAACGCATCGAAGACACCGCACAGGCCATGCTGAGCACGGTCATCGATGAAGAAAGAAATCCCTTTCTGGAAGGTGCTCCATCCTATCTCCCAGGAAAACGCCCTACCGATGTCACCACCTTCGGCCAAGTTCCGGCATTGCGGGACATGCTGGCAGAAAGCAGGGATCTTGAGTTCCTGCAACGGGTAAGCGACATGGCAGGCCCATCCCCCAGAATCGAAGACCCGAGCGAGGAAGGCCTCGCCCGCCACTACACGAACGTCAGCAACTGGAAGGCGCAGAAGAGCGCACACCTGGGCATCGTCGATCATCTCGGGCAGTTCGTTTATCACGAAGGAAGCCCGCTCGACGTAGCGACATTGGCCAAGGCAGTGCAGATGTGGAAGACCCGTGAGCTGATCGTCCACGCACACCCGCAAGACCGCGCGCGCTTTCCCGAGCTCGCTGTGCACATTCCCGAGCAGGTCAGCGACGACTCTGATAGCGAACAGCAGACAAGCCCGGAACCTTCAGGCCATCAGTAG

尽管靶向结构域具有固有的结合相互作用，例如，二级、三级或四级柔性，但是在与E3基序泛素区域的结合方面仍然必须具有柔性。在这方面，如果没有足够的间隔，则E3基序可能在空间上阻碍底物-靶结构域相互作用。这样，在一些实施例中，本申请采用足够长度的多肽接头以防止靶向结构域和底物之间结合的空间破坏。

在一些实施例中，靶向结构域通过在生理条件下可裂解或不可裂解的接头共价连接至泛素区域。接头可需要包含亲核或亲电反应基团的有机部分，其允许将靶向结构域共价连接至泛素区域剂。在一些实施例中，接头是烯醇醚、缩酮、亚胺、肟、腙、半卡巴腙、酰基酰亚胺或亚甲基。在一些实施例中，接头可以是酸可裂解的接头，可水解裂解的接头或酶可裂解的接头。

基于肽的连接基团在细胞中被酶如肽酶和蛋白酶裂解。基于肽的可裂解连接基团是在氨基酸之间形成的产生寡肽如二肽、三肽和多肽的肽键。基于肽的可裂解基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成的产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的裂解基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键，即酰胺键，并且不包括整个酰胺官能团。肽可裂解的连接基团具有通式-NHCHR1C(O)NHCHR2C(O)-，其中R1和R2是两个相邻氨基酸的R基团。这些候选物可以使用类似于上述那些的方法进行评估。

对于体外应用，可以是用于将多肽缀合至固体支持物的交联剂的合适的接头包括可以与支持物表面上存在的官能团或与多肽或两者反应的多种试剂。可用作交联剂的试剂包括同-双-官能试剂，并且特别是杂-双-官能试剂。有用的双官能交联剂包括但不限于N-SIAB、双马来酰亚胺、DTNB、N-SATA、N-SPDP、SMCC和6-HYNIC。可以选择交联剂以在多肽和固体支持物之间提供可选择性裂解的键。例如，光不稳定的交联剂，如3-氨基-(2-硝基苯基)丙酸可用作从固体支持物上裂解多肽的手段。参见Brown等人,“A Single-Bead DecodeStrategy Using Electrospray Ionization Mass Spectrometry and a NewPhotolabile Linker:3-amino-3-(2-nitrophenyl)propionic Acid,”Mol.Divers 4-12(1995)和美国专利第5,643,722号，其全部内容特此通过引用并入本文。

抗体、多肽或其片段，例如靶向结构域，可以通过在羧基官能化的珠和多肽的氨基末端之间形成的共价酰胺键，或相反地，通过在氨基官能化的珠和多肽的羧基末端之间形成的共价酰胺键，固定在固体支持物如珠上。此外，双官能三苯甲基接头可以连接到支持物上，例如经由氨基树脂通过树脂上的氨基或羧基连接到树脂如Wang树脂上的4-硝基苯基活性酯上。使用双功能三苯甲基方法，固体支持物可能需要用挥发性酸如甲酸或三氟乙酸处理以确保多肽被裂解并可被除去。在这种情况下，多肽可以作为无珠贴剂沉积在固体支持物的孔的底部或固体支持物的平坦表面上。在加入基质溶液后，多肽可被解吸到MS中。

对于本领域技术人员显而易见的是，上述方法和技术可用于本申请的嵌合分子，包括其组成部分，例如降解结构域、泛素区域、靶区域及其修饰，以及如上所述的接头分子。

本申请的第二个方面涉及一种形成核糖核蛋白的方法。该方法包括提供编码本文所述的分离的嵌合分子的mRNA；提供一个或多个聚腺苷酸结合蛋白(“PABP”)；和由所述mRNA和所述一个或多个PABP组装核糖核蛋白复合物。在一个实施例中，mRNA包含3'-末端聚腺苷酸(聚A)尾。

在该方面中描述的嵌合分子根据本申请的前述方面进行。

本文所述的聚腺苷酸结合蛋白(“PABP”)(也称为聚(A)结合蛋白)是指与mRNA的聚(A)尾结合的RNA结合蛋白。聚(A)尾位于mRNA的3'末端，长度为200-250个核苷酸。结合蛋白还通过帮助聚腺苷酸聚合酶在翻译前将聚(A)核苷酸尾加到前mRNA而参与mRNA前体。核同种型选择性地结合约50个核苷酸，并通过增加其对RNA的亲和力来刺激聚腺苷酸聚合酶的活性。在mRNA代谢过程中也存在聚(A)结合蛋白，包括无义介导的衰变和核质运输。聚(A)结合蛋白还可以保护尾巴免于降解并调节mRNA的产生。

在一个实施例中，核糖核蛋白，在本文中也称为纳米复合物，可以是纳米颗粒。在优选的实施例中，纳米复合物包括纳米颗粒。核糖核蛋白或纳米复合物是由药物纳米颗粒与带相反电荷的聚电解质形成的复合物。阳离子和阴离子药物都与带相反电荷的聚电解质形成复合物。与其他纳米结构相比，纳米复合物的产率通常更高，并且复合效率通常更好。与其他纳米结构相比，纳米复合物也更易于制备。使用扫描电子显微镜、差示扫描量热法、X射线衍射和透析研究通过生产收率、复合效率、药物负载、粒径和ζ电势来表征根据本申请的核糖核蛋白或纳米复合物制剂。纳米复合物在不同领域具有广泛的应用，例如癌症治疗、基因药物递送、向脑的药物递送以及蛋白质和肽药物递送。

核糖核蛋白或纳米复合物可以具有任何合适的大小。在至少一个实施例中，核糖核蛋白或纳米复合物的直径小于约200nm，直径小于约100nm、小于约95nm、小于约90nm、小于约85nm、小于约80nm、小于约75nm、小于约70nm、小于约65nm、小于约60nm、小于约55nm、小于约50nm、小于约45nm、小于约40nm、小于约35nm、小于约30nm、小于约25nm、小于约20nm、小于约15nm、小于约10nm、小于约9nm、小于约8nm、小于约7nm、小于约6nm、小于约5nm、小于约4nm、小于约3nm、小于约2nm或小于约1nm。还包括直径范围的上限为约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm、约40nm、约35nm、约30nm、约25nm、约20nm、约15nm、约10nm、约9nm、约8nm、约7nm、约6nm、约5nm、约4nm、约3nm或约2nm和下限为约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm、约40nm、约35nm、约30nm、约25nm、约20nm、约15nm、约10nm、约9nm、约8nm、约7nm、约6nm、约5nm、约4nm、约3nm、约2nm或约1nm或其任何组合的纳米颗粒。在某些实施例中，本申请还提供纳米复合物的大小范围为约50nm至约200nm或约10nm至约100nm。在某些实施例中，纳米复合物的大小为约50nm至约150nm。在其他实施例中，纳米复合物的大小可以是约50nm、约75nm或约100nm。

可以优化核糖核蛋白和/或纳米复合物的大小以定位在受试者内的特定位置。例如，可以优化核糖核蛋白和/或纳米复合物，使得其可以移入受试者的各种器官。

在一个实施例中，核糖核蛋白和/或纳米复合物含有有机凝胶。

本申请的核糖核蛋白和/或纳米复合物可以具有任何合适的形状。例如，本申请的核糖核蛋白和/或纳米复合物可以具有网眼、球形、正方形、矩形、三角形、圆盘、立方体状形状、立方体、长方体(立方体)、圆锥体、圆柱体、棱柱、多面体、金字塔、直角圆柱体、杆、分支的圆柱体的形状以及其他规则或不规则形状。在一个实施例中，核糖核蛋白和/或纳米复合物的聚合物基质可含有缠结且共价结合的聚合物。在一个实施例中，基质是水凝胶。

在一个实施例中，对于由聚合物单元形成的每个颗粒，核糖核蛋白和/或纳米复合物基质中的聚合物单元的数量范围为10至5000，例如20至400。在另一个实施例中，聚合物单元的数量范围为10,000至200,000，例如15,000至200,000个聚合物单元。

根据本申请的核糖核蛋白和/或纳米复合物可以包括官能化的表面。在一个实施例中，核糖核蛋白和/或纳米复合物被负官能化。或者，核糖核蛋白和/或纳米复合物可以被正官能化。在其他实施例中，核糖核蛋白和/或纳米复合物不带电荷或为中性。

在一个实施例中，核糖核蛋白和/或纳米复合物是可生物降解的。在另一个实施例中，核糖核蛋白和/或纳米复合物是无毒的。

在一个实施例中，核糖核蛋白和/或纳米复合物可进一步包括至少一种稳定剂。稳定剂可以被吸附在核糖核蛋白和/或纳米复合物的表面上。核糖核蛋白和/或纳米复合物可以分散在液体介质中，并且稳定剂可以用作佐剂，以在分散过程中帮助分离单个核糖核蛋白和/或纳米复合物。稳定剂有助于分离单个核糖核蛋白和/或纳米复合物的能力可以通过比较含有稳定剂的组合物和不含稳定剂的对照组合物的分散过程来确定。稳定剂有助于分离单个纳米颗粒的能力可以通过较短的分散时间来表明。或者，可以使用稳定剂来促进分散的纳米复合物在液体介质，优选在水性介质中的稳定性。

本申请的第三方面涉及一种包含本文所述的嵌合分子和药学上可接受的载体的组合物。

根据本申请的方法，可以将嵌合分子掺入适合施用的药物组合物中。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌化合物、等渗和吸收延迟化合物等。

在该方面中描述的嵌合分子是根据本申请先前描述的方面进行的。

药物组合物通常需要适合于施用于受试者的形式的重组或基本上纯化的嵌合分子和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体部分地取决于所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法。因此，存在多种用于施用蛋白质组合物的药物组合物的合适制剂。参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,马克出版有限公司(MackPublishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚州，第18版(1990)，其全部内容特此通过引用并入本文。通常将药物组合物配制成无菌的、基本上等渗的并完全符合美国食品药品管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。

如本文所用，术语药学上可接受的载体包括例如任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或制剂助剂。由Gennaro编辑的Remington'sPharmaceutical Sciences，马克出版有限公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州,1995(其全部内容特此通过引用并入本文)公开了用于配制药物组合物的各种载体及其制备的已知技术。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄芪胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；洗涤剂，例如TWEEN

本申请的化合物可以口服、肠胃外，例如皮下、静脉内、肌内、腹膜内，通过鼻内滴注，或通过施于粘膜(例如鼻粘膜、喉粘膜)和支气管来施用。它们可以单独施用或与合适的药物载体一起施用，并且可以以固体或液体的形式，例如片剂、胶囊剂、粉剂、溶液、悬浮液或乳液施用。

本申请的组合物可以例如与惰性稀释剂或与可吸收的可食用载体一起口服施用，或者可以将它们封装在硬或软壳胶囊中，或者可以将它们压制成片剂，或者可以将它们直接与饮食的食物掺杂。对于口服治疗性施用，这些组合物可以与赋形剂掺杂并以片剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂等形式使用。此类组合物和制剂应含有至少0.1％的活性化合物。当然，这些组合物中组合物的百分比可以变化，并且可以方便地为单位重量的约2％至约60％。制备根据本申请的优选组合物，使得口服剂量单位含有约1-250mg的活性化合物。

片剂、胶囊剂等还可含有粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊剂时，除上述类型的材料外，它还可含有液体载体，例如脂肪油。

这些组合物也可以肠胃外施用。本发明组合物的溶液或悬浮液可以在水中适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合而制备。也可以在油中在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中制备分散体。示例性油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、右旋糖水溶液和相关的糖溶液，以及二醇如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。在所有情况下，该形式都必须是无菌的，并且必须具有达到易于注射程度的流动性。它必须在生产和储存条件下稳定，并且必须保存以防微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物和植物油。

本申请的组合物也可以以气雾剂形式直接施用于气道。为了用作气雾剂，可以将本申请的溶液或悬浮液形式的组合物与合适的推进剂(例如，烃类推进剂，如丙烷、丁烷或异丁烷)与常规助剂一起包装在加压气雾剂容器中。本申请的材料还可以以非加压形式例如在喷雾器或雾化器中施用。

在一些实施例中，本申请的组合物进一步含有选自由以下组成的非限制性群组的第二药剂或药物组合物：抗炎剂、抗糖尿病药剂、降血脂药剂、化学治疗药剂、抗病毒药剂、抗生素、代谢性治疗药剂、小分子抑制剂、蛋白激酶抑制剂、佐剂、凋亡剂、增殖剂、亲器官性靶向剂、免疫剂、病原体抗原，所述病原体为例如病毒、细菌、真菌和寄生虫，任选以整个灭活生物体、肽、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物或其组合的形式，可在已出版的文献中找到的落入上述类别且已获批准用于人类使用的药理学或免疫学药剂的任何实例、任何其他生物活性组分或这些中的任一种的任何组合。

在一些实施例中，第二药剂或药物组合物选自由以下组成的非限制性群组：抗炎剂、抗糖尿病药剂、降血脂药剂、化学治疗药剂、抗病毒药剂、抗生素、代谢性治疗药剂、小分子抑制剂、蛋白激酶抑制剂、佐剂、凋亡剂、增殖剂、亲器官性靶向剂。

E3泛素连接酶及其功能结构域的重要性通过它们调节的正常细胞过程的数量来突出，并且是与功能丧失或不适当靶向相关的伴随疾病的基础。参见Ardley等人,“E3Ubiquitin Ligases.Essays Biochem 41:15-30(2005)，其全部内容特此通过引用并入本文。

本申请的第四方面涉及一种治疗疾病的方法。该方法包括选择患有疾病的受试者，并且向该受试者施用本文所述的组合物，以使该受试者具有与未患该疾病的受试者相比增加的底物表达水平。

在该方面中描述的嵌合分子是根据本申请先前描述的方面进行的。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人，但是也可以是另一种动物，例如家畜(例如狗、猫等)、农畜(例如牛、羊、猪、马等)或实验动物(例如猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。术语“患者”是指患有或怀疑患有疾病或病况的“受试者”。

所述方法可以包括向疾病具有可测量表型的受试者施用组合物。在一些实施例中，与来自未患该疾病的受试者的表型相比，该疾病的表型涉及底物的表达水平增加。在这方面，本申请的药物组合物中包含的嵌合分子有效治疗或减轻疾病症状，该疾病的特征在于与来自未患病受试者的表型相比，一种或多种底物的表达水平的表型增加。

在本申请的上下文中可以治疗或预防的疾病的非限制性实例包括癌症、转移癌、实体癌、浸润性癌症、扩散性癌症、乳腺癌、肺癌、NSCLC癌症、肝癌、前列腺癌、脑癌、胰腺癌、淋巴癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌和其他本领域已知的实体癌、血细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、中风、局部缺血、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血、外周血管疾病、酒精性肝病、肝硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、糖尿病、癌症、关节炎、ALS、致病性疾病、特发性疾病、病毒性疾病、细菌、疾病、朊病毒疾病、真菌病、寄生虫病、关节炎、伤口愈合、免疫缺陷、炎性疾病、再生障碍性贫血、贫血、遗传性病症、先天性病症、1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、高血糖、代谢综合征、脂肪营养不良综合征、血脂异常、胰岛素抗性、瘦素抗性、动脉粥样硬化、血管疾病、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、非酒精性脂肪肝疾病、败血性休克、多器官功能障碍综合征、类风湿关节炎、创伤、中风、心肌梗塞、全身性自身免疫性疾病、慢性肝炎、超重和/或肥胖或其任何组合。

在一些实施例中，该疾病是癌症、转移癌、中风、缺血、外周血管疾病、酒精性肝病、肝炎、肝硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、囊性纤维化糖尿病、ALS、致病性疾病、特发性疾病、病毒性疾病、细菌、疾病、朊病毒疾病、真菌病、寄生虫病、关节炎、伤口愈合、免疫缺陷、炎性疾病、再生障碍性贫血、贫血、遗传性病症、先天性病症、1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、高血糖、代谢综合征、脂肪营养不良综合征、血脂异常、胰岛素抗性、瘦素抗性、动脉粥样硬化、血管疾病、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、非酒精性脂肪肝疾病、超重或肥胖及其任意组合。

当在体内用于治疗时，将组合物以有效量，即具有所需治疗作用的量施用于受试者。剂量和给药方案将取决于受试者的疾病程度，所用特定肽的特征，例如其治疗指数，受试者和受试者的病史。有效量可以在临床前试验和临床试验期间通过医师和临床医生熟悉的方法确定。可通过多种众所周知的用于施用药物化合物的方法中的任何一种将有效量的在该方法中有用的肽施用给需要其的哺乳动物。

所述组合物的剂量、毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定，例如，用于确定LD

在一些实施例中，本申请的组合物通过口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过植入、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内、经皮或通过施于粘膜来施用。

本申请的第五方面涉及一种用于底物沉默的方法。该方法包括选择待沉默的底物；提供本文所述的嵌合分子；和使底物与嵌合分子在有效允许形成底物-分子复合物的条件下接触，其中该复合物介导待沉默的底物的降解。

在该方面中描述的嵌合分子根据本申请的前述方面进行。

本申请的第六方面涉及一种筛选对疾病具有治疗功效的试剂的方法。该方法包括提供生物分子，其存在介导疾病状态；提供测试试剂，其包含(i)包含E3泛素连接酶(E3)基序的降解结构域，(ii)能够特异性地将所述降解结构域导向所述生物分子的靶向结构域，其中所述靶向结构域与所述降解结构域异源，和(iii)将所述降解结构域偶联至所述靶向结构域的接头；使所述生物分子在有效使所述测试试剂促进所述生物分子降解的条件下与所述测试试剂接触；确定作为接触的结果的生物分子的水平；以及基于所述确定，将降低所述生物分子水平的所述测试试剂鉴定为对所述疾病具有治疗功效的候选物。

在该方面中描述的嵌合分子根据本申请的前述方面进行。

如本文所用，术语“参考水平”或“对照水平”是指出于比较目的可能感兴趣的生物标志物(或生物分子、配体、底物等)的量或浓度。在一些实施例中，参考水平可以是至少一种生物标志物的水平，其表达为取自健康受试者的对照群体或取自具有蛋白质或底物异常表达的患病群体的至少一种生物标志物的水平的平均值。在另一个实施例中，参考水平可以是同一受试者中在较早时间，即在本测定之前的至少一种生物标志物的水平。在另一个实施例中，参考水平可以是在接受治疗方案之前受试者中至少一种生物标志物的水平。

如本文所用，术语“样品”可包括但不限于身体组织或体液，例如血液(或血液馏分，例如血浆或血清)、淋巴、粘液、眼泪、唾液、痰、尿、精液、粪便、CSF、腹水或全血，并且包括身体组织的活检样品。样品还可以包括从来自受试者的样品生长的微生物的体外培养物。样品可以从任何受试者获得，例如患有或怀疑患有以疾病为特征的疾病或病况的受试者/患者。

如本文所用，术语“筛选”是指确定嵌合分子或组合物是否具有预防或减缓(减轻)本文所述的靶向病理状况，即以特定疾病中的缺陷为特征的疾病或病况的能力或特征。

如本文所用，术语嵌合分子或组合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以实现所需治疗和/或预防效果的量，例如，导致与所治疗疾病相关的症状的预防或减少的量。给予受试者的化合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。它还将取决于疾病的程度、严重性或阶段。技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。

如本文所用，术语“酶联免疫吸附测定”(ELISA)包括基于抗体的测定，其中通过产生可检测信号的酶反应完成目标抗原的检测。ELISA可以竞争性或非竞争性形式进行。ELISA还包括双位点或“夹心”测定，其中使用两种针对抗原的抗体，一种抗体捕获抗原，一种用酶或其他可检测标记物标记以检测捕获的抗体-抗原复合物。在典型的双位点ELISA中，抗原具有至少一个未标记抗体和酶联抗体可以高亲和力结合的表位。因此，可以使用酶联抗体亲和捕获和检测抗原。选择的典型的酶包括碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，当与适当的底物接触时，这两种酶都产生可检测的产物。

如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于在变性溶剂的存在下丧失与前者的结合，但不丧失与后者的结合。通常，表位将是形成底物的决定区，其可以被一个或多个靶结构域识别。

为了筛选具有表位的靶向结构域或底物，可以进行常规的交叉阻断测定，其例如描述于Antibodies,A Laboratory Manual，冷泉港实验室，Ed Harlow and David Lane(1988)，其全部内容特此通过引用并入本文。该测定可用于确定靶结构域是否与不同的靶结构域、抗体、抗体片段等结合底物的相同位点或表位。或者或另外，表位作图可通过本领域已知的方法进行。例如，抗体序列可以被诱变，例如通过丙氨酸扫描诱变，以鉴定接触残基。在不同的方法中，对应于底物的不同区域的肽可以用于与测试靶结构域或与测试抗体和靶结构域或具有表征表位的抗体的竞争测定中。

如本文所用，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，例如在V

如本文所用，术语“分离的”或“纯化的”多肽、肽、分子或嵌合分子基本上不含来自衍生该药剂的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染多肽，或基本上不含化学前体或化学合成的其他化学物质。例如，嵌合分子将不含会干扰此类分子预期功能、诊断或治疗用途的材料。除了嵌合分子、酶、激素和其他蛋白质和非蛋白质溶质所涵盖的材料之外，此类干扰材料还可能包括蛋白质或片段。

在一个实施例中，关于未患疾病的受试者的标准生物分子水平进行鉴定。在一些实施例中，还可以针对没有接触的生物分子水平进行鉴定。就此而言，可以使用对照水平与样品中生物分子的水平进行比较。在一些实施例中，对照水平是来自未患疾病的受试者的生物分子的水平。与从健康受试者获得的样品相比，从怀疑患有影响底物水平的疾病或病况的受试者获得的样品中的生物分子的过量表明在测试受试者中与生物分子相关的疾病或病况。

存在大量疾病，其中某些底物生物分子的过量程度已知可指示受试者是否患有疾病或可能发展疾病。参见例如，Anderson等人,“Discovering Robust Protein Biomarkersfor Disease from Relative Expression Reversals in 2-D DIGE Data,”Proteomics7:1197-1207(2007)，其全部内容特此通过引用并入本文。与对照受试者相比，生物分子增加的病况的实例包括上述疾病。

因此，将本申请的嵌合分子和组合物施用于需要治疗的受试者。E3泛素连接酶如编码E3基序的E3基因产物如上所述，并且可用于本发明的筛选方法中以确定本文公开的嵌合分子的功效。在一些实施例中，进行合适的体外或体内测定以确定本申请的嵌合分子和组合物的作用以及是否指示施用以用于治疗。在用于人类受试者的测试之前，可以在合适的动物模型系统中测试用于治疗的组合物，所述动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。类似地，对于体内测试，可以在施用于人类受试者之前使用本领域已知的任何动物模型系统。

可以采用本领域技术人员已知的使细胞、器官或组织与组合物接触的任何方法。体内方法通常包括向哺乳动物，合适地是人施用嵌合分子或组合物，例如上述那些。当在体内用于治疗时，如本文所述，将嵌合分子或组合物以有效量施用于受试者。可以根据本文所述方法开始时提出的经验变量确定结果。

体外方法通常包括测定嵌合分子或组合物(例如上述那些)对样品或提取物的作用。在一些实施例中，可通过评估对底物降解的影响，即嵌合分子和组合物在样品中施加表型变化的能力，来确定嵌合分子功效。此类方法包括但不限于免疫组织化学、免疫荧光、ELISPOT、ELISA或RIA。各种有用的免疫检测方法的步骤已经在科学文献中进行了描述，如例如Nakamura等人,Enzyme Immunoassays:Heterogeneous and Homogeneous Systems,Handbook of Experimental Immunology,Vol.1:Immunochemistry 27.1-27.20(1986)，每个文献的全部内容并且特别是关于免疫检测方法的教导均通过引用并入本文。

从最简单和直接的意义上讲，免疫测定是涉及抗体与抗原之间结合的结合测定。免疫测定的许多类型和形式是已知的，并且都适用于检测公开的生物标志物。免疫测定的实例是酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫斑点测定(ELISPOT)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀测定(RIPA)、免疫珠捕获测定、蛋白质印迹、斑点印迹、凝胶迁移测定、流式细胞术、免疫组织化学、荧光显微法、蛋白质阵列、多重珠阵列、磁捕获、体内成像、荧光共振能量转移(FRET)和光漂白后的荧光恢复/定位(FRAP/FLAP)。

一般来说，免疫测定包括使怀疑含有目标分子(例如所公开的生物分子)的样品与目标分子的抗体接触，或使目标分子的抗体(例如所公开的生物分子的抗体)与可视情况在有效允许形成免疫复合物的条件下与抗体结合的分子接触。在这方面，技术人员将能够评估给定样品中特定生物分子的存在和/或水平。随后，将本申请的嵌合分子组合物加入测定中。此后，可以使用本文所述的免疫测定来评估生物分子的水平，即其存在或水平，以确定治疗后的表型效应。

免疫测定可以包括用于检测或定量样品中目标生物分子的量的方法，该方法通常涉及检测或定量结合过程中形成的任何免疫复合物。通常，免疫复合物形成的检测在本领域中是众所周知的，并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记物或标志物的检测，例如任何放射性、荧光、生物或酶标签或任何其他已知标记物。参见，例如，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，每个专利的全部内容并且特别是关于免疫检测方法和标记物的教导均通过引用并入本文。

如上所述，本申请的治疗方法具有连接至靶向结构域的泛素区域。在一些实施例中，如上所述，靶向结构域结合细胞内生物分子。同样，本申请的治疗方法采用足够长度的多肽接头，以防止靶向结构域和底物之间结合的空间破坏。在一些实施例中，生物分子与如上所述的疾病有关。

在一个实施例中，该方法用多种测试剂进行。

本申请的第七方面涉及一种筛选疾病生物标志物的方法。该方法包括提供表达一种或多种配体的患病细胞的样品；提供多个嵌合分子，其包含(i)包含E3泛素连接酶(E3)基序的降解结构域，(ii)能够特异性地将所述降解结构域引导至所述一种或多种配体的靶向结构域，其中所述靶向结构域与所述降解结构域异源，和(iii)将所述降解结构域与所述靶向结构域偶联的接头；使样品在有效使患病细胞在不存在嵌合分子的情况下不能增殖的条件下与多个嵌合分子接触；确定哪些嵌合分子允许患病细胞增殖；和基于所述确定将与嵌合分子结合并允许患病细胞增殖的配体鉴定为疾病的生物标志物。

在该方面中描述的嵌合分子根据本申请的前述方面进行。

如本文所用，术语“生物标志物”或“生物分子”或“分子”是指与取自对照受试者或对照受试者群体的比较样品相比，不同地存在于取自患有疾病的患者的样品中的多肽(具有特定表达水平)。

如本文所用，术语“配体”或“底物”是指能够与蛋白质、分子、嵌合分子、配体(二聚体)、底物(二聚体)、第二底物、第二配体、靶结构域、区域、部分及其片段、泛素或E3基序区域、结构域或其部分、生物分子、生物标志物等结合并形成瞬时或稳定复合物以用于生物学目的的物质，例如在酶促反应过程中与酶相互作用的底物。配体还包括通过分子间力如离子键、氢键和范德华力与靶蛋白上的位点结合的信号触发分子。在一些实施例中，底物结合配体和/或配体结合底物。

许多(如果不是全部)疾病是复杂的和多因素的。例如，当考虑神经变性时，在病理表现之前会发生大量的神经元细胞丢失。改善症状的辅助疗法进一步阻碍了筛选和开发治疗神经退行性疾病的药物。因此，靶标检测被先前的治疗性施用所模糊，这又可能减慢疾病进程并进一步混淆治疗方案。以此方式，本申请提供了通过采用表型筛选分析来阐明疾病生物标志物的新的、创造性的筛选方法。参见例如，Pruss,R.M.,“Phenotypic ScreeningStrategies for Neurodegenerative Diseases:A Pathway to Discover Novel DrugCandidates and Potential Disease Targets or Mechanisms.”CNS&NeurologicalDisorders-Drug Targets,9,693-700(2010)，其全部内容特此通过引用并入。

表型筛选涉及使用来自患有疾病的患者的合适样品，例如细胞、细胞提取物、神经元、组织等的类别，并使该样品经受本文所述的一种或多种嵌合分子。随后，根据患病细胞的存活力、增殖、细胞过程和/或表型特征，例如，收缩、膜电位丧失、形态变化等筛选样品。图像分析软件允许细胞体或其他物体凭经验评估结果。来自筛选的命中物可以通过刺激存活途径、模拟营养因子或抑制死亡信号来维持细胞存活。然后，可以将靶向二级测定中的较高含量筛选和分析用于鉴定靶标和有希望的命中物的作用机理。

可以进行生物标志物筛选分析的疾病病况的实例包括上述疾病。在一些实施例中，筛选疾病生物标志物的方法包括多个分子，其中所述分子具有如上所述的E3基序。在一些实施例中，生物标志物筛选方法包括具有如上所述的靶向结构域的分子。本申请的筛选方法使用足够长度的多肽接头，以防止靶向结构域与生物分子和/或配体之间结合的空间破坏。

一旦确定嵌合分子可提供治疗指示，就使用靶向结构域区域(或整个嵌合分子)从样品中免疫沉淀生物标志物以分离该生物标志物，然后使用本领域众所周知的方法进行鉴定。生物标志物的分离和纯化方法包括但不限于例如使用尺寸排阻或基于亲和力的柱树脂的HPLC或FPLC色谱法。参见例如Sambrook等人1989，冷泉港实验室出版社，其全部内容特此通过引用并入本文。

本申请的多肽的活性片段、衍生物或变体可以通过例如缺失或添加对多肽的性质、二级结构和生物学活性具有最小影响的氨基酸来识别。例如，多肽可以在蛋白质的N-末端与信号(或前导)序列连接，所述信号(或前导)序列共翻译或翻译后指导蛋白质的亚细胞或细胞外定位。

然后可以使用本领域已知的技术阐明生物标志物。在一些实施例中，使用MALDI-TOF、质谱分析法、质谱法、蛋白质测序、抗体相互作用、蛋白质印迹、免疫测定、ELISA、色谱技术、反向蛋白质组学、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光或其任何组合来进行生物标志物的鉴定。

用于研究和鉴定蛋白质的合适的质谱技术包括激光解吸电离质谱和电喷雾电离质谱。在激光解吸电离(LDI)质谱(MS)类别中，可以使用基质辅助LDI(MALDI)和表面辅助LDI(SELDI)飞行时间(TOF)MS。SELDI TOF-MS特别适合用于本方法，因为它为分析、定量低丰度蛋白(pg-ng/ml)和高可重复性的结果提供了埃摩尔灵敏度。

本文所述的方法可以例如通过利用预包装的试剂盒来进行，所述试剂盒包含至少一种试剂，例如本文所述的嵌合分子或组合物，其可以方便地用于例如临床环境中以治疗表现出涉及过度表达的底物、生物分子或生物标志物的疾病或疾患的症状的受试者。此外，其中可表达本申请的嵌合分子的任何细胞类型或组织适用于本文所述的试剂盒。

在本申请的另一个方面是使用本申请的嵌合分子和组合物的试剂盒或试剂系统。此类试剂盒将含有试剂组合，其包括根据本文公开的方法进行测定所需的特定要素。试剂系统以商业包装形式，作为组合物或混合物存在，其中在测试装置构造中将允许试剂的相容性，或更典型地作为测试试剂盒，即，装有必要试剂的一个或多个容器、装置等的包装组合，并且优选包括用于进行测定的书面说明书。试剂盒可以适用于任何构造的测定，并且可以包括用于进行本文所述的各种测定形式中的任一种的组合物。

可用于所公开方法的试剂可储存在溶液中或可冻干。当冻干时，一些或所有试剂可以容易地储存在微量滴定板孔中，以在重构后容易使用。预期本领域已知的用于冻干试剂的任何方法将适合于制备可用于所公开方法的干燥试剂。

本申请的范围内还包括包含本申请的嵌合分子/组合物和第二试剂以及使用说明书的试剂盒。试剂盒可用于检测生物样品中底物的存在，所述生物样品为例如任何体液，包括但不限于例如血清、血浆、淋巴、囊液、尿、粪便、脑脊液、腹水或血液，并且包括身体组织的活检样品。例如，试剂盒可包含一种或多种嵌合分子，其由与能够结合生物样品中底物的靶向结构域连接的E3基序泛素区域构成。

实例

提供以下实例以例示本申请的实施例，但是它们绝不旨在限制其范围。

包括以下实例以说明本申请的说明性实施例。本领域技术人员应当理解，以下实例中公开的技术代表发明人发现的在本申请的实践中良好发挥作用的技术，并且因此可以认为构成其实施的优选方式。然而，根据本申请，本领域技术人员应当理解，在不脱离本申请的精神和范围的情况下可以在所公开的具体实施例中进行多种改变，并且仍可获得相同或相似的结果。

实验方法

质粒。表1提供了本研究中使用的所有质粒。

表1.本研究中使用的菌株、细胞系和质粒。

大肠杆菌菌株DH5α用于构建和增殖所有质粒。为了构建pcDNA3-EGFP，使用引入5'Kozak序列的引物PCR扩增EGFP，并将得到的PCR产物连接到pcDNA3中。通过使用重叠延伸PCR，利用引入5'Kozak序列的引物进行ERK2和EGFP的基因组装，随后连接到pCDH1来产生质粒pCDH1-ERK2-EGFP。通过用加入5'Kozak序列和3'SV40 NLS序列的引物PCR扩增EGFP，然后将PCR产物连接到pcDNA3中，产生质粒pcDNA3-EGFP-NLS。通过用5'Kozak序列PCR扩增SHP2，然后连接到pcDNA3-EGFP中，产生质粒pcDNA3-SHP2-EGFP。通过PCR扩增来自质粒mEGFP-HRas G12V的EGFP-HRas

为了产生GFP-定向的uAb，通过使用在上游引入Kozak、6x-FIis和FLAG序列的引物PCR扩增来自pHFT2-GS2的GS2(Koide等人,“Teaching an Old Scaffold New Tricks:Monobodies Constructed Using Alternative Surfaces of the FN3 Scaffold,”J.Mol.Biol.415(2):393-405(2012)，其全部内容特此通过引用并入本文)，然后将其连接到pcDNA3中，使得BamHI和EcoRI限制性位点在GS2的上游可用以产生N-末端融合，来产生质粒pcDNA3-HF-GS2。对于C-末端融合，通过用引入上游Kozak序列和下游NheI和SbfI限制性位点的引物PCR扩增GS2，然后连接到pcDNA3中，产生质粒pcDNA3-GS2-FH。用引入NheI和SbfI位点的引物PCR扩增编码AvrPtoB、IpaH9.8、NleG2-3、NleG5-l、NleL、SlrP、SopA、SPOP、SspH1、SspH2和XopL的基因，然后将得到的PCR产物连接到pcDNA3-GS2-FH中。用引入BamHI和EcoRI位点的引物PCR扩增编码LegAU13、LegU1和SidC的基因，然后将得到的PCR产物连接到pcDNA3-HF-GS2中。通过使用引入上游HindIII和Kozak序列和下游NheI位点的引物PCR扩增来自pHFT2-GS2的GS2，然后连接至pcDNA3-R4-CHIPΔTPR代替scFvR4，产生质粒pcDNA3-GS2-CHIP。通过用引入HindII和XhoI(VHL)或BamHI和XhoI(βTrCP)位点的引物PCR扩增编码VHL和βTrCP的基因，之后将所得PCR产物连接在pcDNA3-NSlmb-GS2中代替NSlmb来产生质粒pcDNA3-VHL-GS2和pcDNA3-βTrCP-GS2。通过pcDNA3-GS2-IpaH9.8的定点诱变产生质粒pcDNA3-GS2-IpaH9.8

通过用引入NcoI和NotI(GS2-IpaH9.8)或NheI和NotI(IpaH9.8ΔLRR)位点的引物分别PCR扩增全长GS2-IpaH9.8和截短的IpaH9.8ΔLRR，然后将得到的PCR产物连接到pET24d(+)，产生质粒pET24d-GS2-IpaH9.8和pET24d-IpaH9.8ΔLRR。使用引入上游NcoI位点和下游FLAG、6x-His和HindIII序列的引物，通过PCR扩增来自pHFT2-GS2的GS2，之后将所得PCR产物连接到pET28a(+)中，产生质粒pET28a-GS2。通过用引入EcoRV和HindIII位点的引物PCR扩增来自pcDNA3-GS2-IpaH9.8

细胞系、培养和转染。本研究中使用的所有细胞系均在表1中提供。简而言之，HEK293T和HeLa细胞获自ATCC，HeLa H2B-EGFP细胞由Elena Nigg慷慨提供，MCF10A rtTA细胞由Matthew Paszek慷慨提供，在含有4.5g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺(VWR)且补充有10％FetalCloneI(VWR)和1％青霉素-链霉素-两性霉素B(赛默飞世尔(ThermoFisher))的DMEM中培养HEK293T、HeLa和HeLa H2B-EGFP细胞。在补充有5％马血清(赛默飞世尔)、20ng/mLEGF(派普泰克(Peprotech))、0.5mg/mL氢化可的松(西格玛(Sigma))、100ng/mL霍乱毒素(西格玛)、10μg/mL胰岛素(西格玛)和1％青霉素-链霉素-两性霉素B(赛默飞世尔)的DMEM/F12培养基(赛默飞世尔)中生长MCF-10a细胞。将所有细胞维持在37℃、5％CO

使用Nucleofection Kit V(瑞士龙沙(Lonza))和HyPBASE(一种用于PiggyBac转座酶的高活性形式的表达质粒)产生稳定的MCF10A rtTA细胞系。进行MCF10A rtTA细胞的转座以产生下列稳定的系：MCF10A EGFP-HRas

通过慢病毒转化产生表达EGFP、EGFP-HRas

蛋白质印迹分析。将HEK293T细胞以10,000个细胞/cm

流式细胞术分析。将细胞以10,000个细胞/cm

显微镜检查。将细胞以10,000个细胞/cm

蛋白质表达和纯化。通过使含有编码所需蛋白质的基于pET28a的质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞或含有基于pTriEx-3的质粒的Rosetta(DE3)细胞在37℃下在200mL的Luria-Bertani(LB)培养基中生长来获得纯化的蛋白质。当培养物密度(Abs

ELISA。在4℃下用在0.05M NaCO

阳离子多肽的合成与表征。如本组研究人员最近所述，根据Uchida和同事的改进程序合成N4(TEP)多胺(Li等人,“Polyamine-Mediated Stoichiometric Assembly ofRibonucleoproteins for Enhanced mRNA Delivery,”Angew Chem.Int.Ed.Engl.56(44):13709-12(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文)。Uchida等人,“ModulatedProtonation of Side Chain Aminoethylene Repeats in N-SubstitutedPolyaspartamides Promotes mRNA Transfection,”J.Amer.Chem.Soc.136(35):12396-405(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文。简而言之，在搅拌下向聚(β-苄基-L-天门冬氨酸盐)在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(西格玛)中的冷却溶液(2mL)中逐滴加入50当量的用NMP稀释两倍的四亚乙基五胺(西格玛)。在0℃下搅拌2小时后，在搅拌下通过逐滴加入冷的6N HCl将pH调节至1。将所得溶液从再生纤维素膜袋(仕必纯(Spectrum Laboratories)，1kDa MWCO)中针对0.01N HCl透析，然后针对蒸馏水透析，冷冻并冻干以得到白色粉末。在25℃下使用Bruker Avance 400MHz NMR光谱仪在氘化氧(剑桥同位素实验室(CambridgeIsotope Laboratories))中通过

通过体外转录制备mRNA。通过用XbaI和NotI位点替换GFP片段，将编码uAb的cDNA克隆到pGEM4Z/GFP/A64中。另外，使用NotI和EcoRI将人α-球蛋白3'UTR序列置于cDNA和聚A尾之间，以改善mRNA翻译。用SpeI进行线性化，然后用HiScribe

纳米复合物转染。将多胺溶解在10mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中。对于96孔板的每个孔，在室温下将在5μl OptiMEM(赛默飞世尔)中稀释的200ng mRNA与5μl含PABP的OptiMEM(mRNA：PABP重量比＝1：5)混合10分钟。然后，加入5μl含多胺的OptiMEM并在室温下孵育15分钟，然后转染到稳定表达d2EGFP的HEK293T中。调整多胺以达到50：1(N/P)的比例以进行转染。在转染后的不同时间点通过BD FACSCelesta(贝迪医疗(Becton Dickinson))测量EGFP表达。

动物实验。根据既定的机构指南和MIT比较医学系批准的方案，在无病原体的条件下进行小鼠护理和实验程序。C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。在麻醉下，对8-10周龄小鼠的耳朵皮下注射在25μl OptiMEM体积中的用N4(TEP)多胺包装的5μg mRNA和25μg PABP。用安装在不透光样品盒(精诺真(Xenogen))中的CCD相机进行荧光成像。曝光时间为1秒。信号的成像和定量由LivingImage采集和分析软件(精诺真)控制。

实例1-工程化的IpaH9.8有效沉默哺乳动物细胞中的GFP

为了确定是否可以重新设计来自致病菌的E3泛素连接酶模拟物以沉默非天然靶标，重点是一组14种候选酶，这些酶代表了迄今为止在细菌中发现的主要E3类别(下文表2)。Maculins等人,“Bacteria-Host Relationship:Ubiquitin Ligases as Weapons ofInvasion.Cell Res.26(4):499-5l0(2016)和Lin等人,“Exploitation of the Host CellUbiquitin Machinery by Microbial Effector Proteins,”J.Cell Sci.130(12):1985-96(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文。

表2.在本研究中评估的细菌E3泛素连接酶。

表2中的缩写：NEL，新型E3连接酶；HECT，与E6AP C末端同源；SCF，Skp1/Cdc53或Cullen-1/F-box蛋白；SPOP，斑点型POZ蛋白；VHL，希佩尔-林道；ECV，延伸蛋白B/C，卡伦-2，VHL

[12]Janjusevic等人,“A Bacterial Inhibitor of Host Programmed CellDeath Defenses is an E3 ubiquitin ligase,”Science 311:222-26(2006)，其全部内容特此通过引用并入本文

[13]Zhou等人,“Harnessing the Ubiquitination Machinery to Target theDegradation of Specific Cellular Proteins,”Mol.Cell 6:751-56(2000)，其全部内容特此通过引用并入本文

[14]Portnoff等人,“Ubiquibodies,Synthetic E3 Ubiquitin Ligases EndowedWith Unnatural Substrate Specificity for Targeted Protein Silencing,”J.Biol.Chem.289:7844-55(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文

[15]Ashida等人,“Shigella Chromosomal IpaH Proteins are Secreted Viathe Type III Secretion System and act as effectors,”Mol Microbiol.63:680-93(2007)，其全部内容特此通过引用并入本文

[16]Okuda等人Shigella Effector IpaH9.8 Binds to a Splicing FactorU2AF(35)to Modulate Host Immune Responses,”Biochem.Biophys.Res.Commun.333:531-39(2005)，其全部内容特此通过引用并入本文

[17]Ensminger,A.W.,“RR E3 Ubiquitin Ligase Activity and Targeting ofBAT3 by Multiple Legionella pneumophila Translocated Substrates,”Infect.Immun.78:3905-19(2010)，其全部内容特此通过引用并入本文

[18]Quaile等人,“Molecular Characterization of LubX:FunctionalDivergence of the U-Box Fold by Legionella pneumophila,”Structure 23:1459-69(2015)，其全部内容特此通过引用并入本文

[19]Wu等人,“NleG Type 3Effectors From Enterohaemorrhagic Escherichiacoli are U-Box E3 Ubiquitin Ligases,”PLoS Pathog.6:el000960(2010)，其全部内容特此通过引用并入本文

[20]Lin等人,“Biochemical and Structural Studies of a HECT-likeUbiquitin Ligase From Escherichia coli Ol57:H7,”J.Biol.Chem.286:441-49(2011)，其全部内容特此通过引用并入本文

[21]Hsu等人,“The Legionella Effector SidC Defines a Unique Family ofUbiquitin Ligases Important for Bacterial Phagosomal Remodeling,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:10538-43(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文

[22]Zouhir等人,“The Structure of the Slrp-Trxl Complex Sheds Light onthe Autoinhibition Mechanism of the Type III Secretion System Effectors ofthe NEL family,”Biochem.J.464:135-44(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文

[23]Diao等人,“Crystal Structure of SopA,a Salmonella Effector ProteinMimicking a Eukaryotic Ubiquitin Ligase,”Nat.Struct.Mol.Biol.15:65-70(2008)，其全部内容特此通过引用并入本文

[24]Shin等人,“Nanobody-Targeted E3-Ubiquitin Ligase Complex DegradesNuclear Proteins,”Sci.Rep.5:14269(2015)，其全部内容特此通过引用并入本文

[25]Keszei等人,“Structure of an SspH1-PKN1 Complex Reveals the Basisfor Host Substrate Recognition and Mechanism of Activation for a Bacterial E3Ubiquitin Ligase,”Mol.Cell Biol.34:362-73(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文

[26]Bhavsar等人,“The Salmonella Type III Effector SspH2 SpecificallyExploits the NLR Co-Chaperone Activity of SGT1 to Subvert Immunity,”PLoSPathog.9:el0035l8(2013)，其全部内容特此通过引用并入本文

[27]Maniaci等人,“Homo-PROTACs:Bivalent Small-Molecule Dimerizers ofthe VHL E3 Ubiquitin Ligase to Induce Self-Degradation,”Nat.Commun.8:830(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文

[28]Singer等人,“A Pathogen Type III Effector With a Novel E3Ubiquitin Ligase Architecture,”PLoS Pathog.9:el003121(2013)，其全部内容特此通过引用并入本文

该组包括折叠与真核生物E3相似的E3模拟物，例如HECT型、RING或U-box(RING/U-box)型和F-box结构域，以及折叠不同于任何其他真核生物E3的非常规E3，例如新型E3连接酶(NEL)、含XL-box和SidC。通常，通过从每个E3模拟物中去除天然底物结合结构域并用合成的结合蛋白代替它(图1A)来工程化uAb，类似于先前基于人CHIP设计的uAb。Portnoff等人,“Ubiquibodies,Synthetic E3 Ubiquitin Ligases Endowed With UnnaturalSubstrate Specificity for Targeted Protein Silencing,”J.Biol.Chem.289(11):7844-55(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文。例如，弗氏志贺氏菌IpaH9.8由具有8个20个残基的富亮氨酸重复序列(LRR)的N末端结构域组成，所述LRR介导与天然底物蛋白如NF-κB基本调节剂(NEMO)(Ashida等人,“A Bacterial E3 Ubiquitin Ligase IpaH9.8Targets NEMO/DCKgamma to Dampen the Host NF-KapPab-Mediated InflammatoryResponse,”Nat Cell Biol.l2(1):66-73，同上，pp.1-9(2010)，其全部内容特此通过引用并入本文)和鸟苷酸结合蛋白(Li等人,“Ubiquitination and Degradation of GBPs by aShigella Effector to Suppress Host Defence,”Nature 551(7680):378-83(2017)，其全部内容特此通过引用并入)的结合和特异性，而C末端结构域则采用了新型E3泛素连接酶结构。Zhu等人,“Structure of a Shigella Effector Reveals a New Class ofUbiquitin Ligases,”Nat.Struct.Mol.Biol.15(12):1302-08(2008)和Singer等人,“APathogen Type III Effector With a Novel E3 Ubiquitin Ligase Architecture,”PLoS Pathogens 9(1):el003121(2013)，其全部内容特此通过引用并入本文。因此，IpaH9.8的N末端LRR结构域被GS2替代，GS2是一种以纳摩尔亲和力(K

鉴于这种强大的沉默活性，注意力集中在GS2-IpaH9.8上。在表达这种嵌合体的细胞中，EGFP的消除是有效的，去除了高达90％的荧光活性(图2A和2B)，并且在细胞裂解物中没有可检测的EGFP蛋白(图2C)。重要的是，当IpaH9.8的催化半胱氨酸(Rohde等人,“TypeIII Secretion Effectors of the IpaH Family are E3 Ubiquitin Ligases,”CellHost Microbe 1(1):77-83(2007)，其全部内容特此通过引用并入本文)突变为丙氨酸(GS2-IpaH9.8

为了衡量本工程化细菌连接酶的效力，将由GS2-IpaH9.8催化的GFP沉默活性与先前已被重新配置为靶向蛋白水解的基于真核生物E3机制的其他合成连接酶的活性相比。Zhou等人,“Harnessing the Ubiquitination Machinery to Target the Degradationof Specific Cellular Proteins,”Mol.Cell 6(3):751-56(2000)；Zhang等人,“Exploring the Functional Complexity of Cellular Proteins by ProteinKnockout,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(24):14127-32(2003)；Hatakeyama等人,“Targeted Destruction of C-Myc by an Engineered Ubiquitin Ligase SuppressesCell Transformation and Tumor Formation,”Cancer Res.65(17):7874-79(2005)；Ma等人,“Targeted Degradation of KRAS by an Engineered Ubiquitin Ligase SuppressesPancreatic Cancer Cell Growth In Vitro and In Vivo”Mol.Cancer Ther.12(3):286-94(2013)；Kong等人,“Engineering a Single Ubiquitin Ligase for the SelectiveDegradation of all Activated ErbB Receptor Tyrosine Kinases,”Oncogene 33(8):986-95(2014)；Caussinus等人,“Fluorescent Fusion Protein Knockout Mediated byAnti-GFP Nanobody,”Nat.Struct.Mol.Biol.19(1):117-21(2011)；Fulcher等人,“Targeting Endogenous Proteins For Degradation Through the Affinity-DirectedProtein Missile System,”Open Biol.7(5):170066(2017)；Fulcher等人,“An Affinity-Directed Protein Missile System for Targeted Proteolysis,”Open Biol 6(10):160255(2016)；Shin等人,“Nanobody-Targeted E3-Ubiquitin Ligase Complex DegradesNuclear Proteins,”Sci.Rep.5:14269(2015)；和Kanner等人,“Sculpting Ion ChannelFunctional Expression with Engineered Ubiquitin Ligases,”Elife 6:e29744(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文。具体而言，用GS2抗体类似物替换来自人类的几种真核生物E3泛素连接酶的天然底物结合结构域，包括Hsc70相互作用蛋白(CHIP)、斑点型POZ蛋白(SPOP)、β转导素重复序列包含蛋白(βTrCP)和希佩尔-林道蛋白(VHL)以及果蝇额外肢体(supernumerary limbs(Slmb))蛋白的羧基末端，产生一组与GS2-IpaH9.8同源的合成连接酶。当在哺乳动物细胞中将所得的一组GFP特异的uAb与EGFP瞬时共表达时，其所有均能够可测量地降低EGFP水平，但在该测试的条件下，每种的沉默活性相对无效(约25-45％)(图1C和图6A-6B)，使人联想到先前的Slmb-纳米抗体嵌合体在降低未融合的GFP水平方面同样无效的结果。Caussinus等人,“Fluorescent Fusion Protein KnockoutMediated by Anti-GFP Nanobody,”Nat.Struct.Mol.Biol.19(1):117-21(2011)，其全部内容特此通过引用并入本文。此处观察到的Slmb-GS2的弱EGFP敲低实际上是先前用在Slmb与GFP特异性VHH纳米抗体之间的嵌合体cAbGFP4获得的结果的改进，cAbGFP4不能促进未融合的GFP的降解。Caussinus等人,“Fluorescent Fusion Protein Knockout Mediated byAnti-GFP Nanobody,”Nat.Struct.Mol.Biol.19(1):117-21(2011)，其全部内容特此通过引用并入本文。然而，应注意Slmb-cAbGFP4融合体消除了较大的GFP融合蛋白相关的荧光，表明本文报道的数据不一定指示uAb功能障碍，而是可以反映底物偏好/相容性或泛素修饰程度的差异。无论如何，涉及真核生物E3的工程化嵌合体无一显示GS2-IpaH9.8的效力和稳健性，其可重复地降低90-95％的细胞荧光。

实例2-GS2-IpaH9.8降解大范围的底物蛋白。

为了更深入地研究底物相容性问题，测试了GS2-IpaH9.8降解一系列不同底物的能力。多年来，越来越多的GFP衍生的荧光蛋白(FP)已经被开发和优化，提供了用于生物成像的新工具的多样化集合。Tsien,R.Y.,“The Green Fluorescent Protein,”Ann.Rev.Biochem.67:509-44(1998)和Shaner等人,“A Guide to Choosing FluorescentProteins,”Nat.Methods 2(12):905-09(2005)，其全部内容特此通过引用并入本文。为了确定不同的FP靶可以降解的程度，GS2-IpaH9.8在哺乳动物细胞中与单体形式的Emerald、Venus和Cerulean以及增强的青色荧光蛋白(ECFP)瞬时共表达。大约65-85％的与每个FP相关的细胞荧光活性被GS2-IpaH9.8消除，而结构上不相关的mCherry蛋白不被GS2-IpaH9.8靶向，预期GS2对GFP折叠具有特异性(图8A)。有趣地是，超折叠GFP(sfGFP，一种快速折叠和稳健稳定的EGFP突变体)的荧光活性不受GS2-IpaH9.8影响，这与sfGFP对蛋白酶体降解有抗性的最近发现一致。Khmelinskii等人,“Incomplete Proteasomal Degradation ofGreen Fluorescent Proteins in the Context of Tandem Fluorescent ProteinTimers,”Mol.Biol.Cell 27(2):360-70(2016)，其全部内容特此通过引用并入本文。

受到GS2-IpaH9.8降解不同FP的能力的促进，接下来评估GS2-IpaH9.8降解结构不同的FP标记的底物蛋白的能力。GS2-IpaH9.8熟练降解了15种独特的靶蛋白，它们的分子量(27-179kDa)和亚细胞定位(即细胞质、细胞核、膜相关和跨膜)不同(图3A和图8B)。例如，GS2-IpaH9.8引发80-92％的与FP融合相关的荧光活性降解，涉及胞质蛋白α-肌动蛋白、α-突触核蛋白(α-syn)、细胞外信号调节激酶2(ERK2)、黏着斑激酶(FAR)、F-tractin、桩蛋白(PXN)和黏着斑蛋白(VCL)，如通过流式细胞术分析所测定的(图3A和图8B)。对于以下观察到类似的稳健沉默：核靶向FP融合体，其涉及组蛋白H2B和源自SV40大T-抗原的核定位信号(NLS)；膜相关FP融合体，其涉及携带致癌G12V突变(HRas

实例3-GS2-IpaH9.8介导的蛋白质组编辑是灵活的和模块化的。

uAb的有吸引力的特征是它们的高度模块化结构-E3催化结构域和合成结合蛋白结构域可以互换以重新编程活性和特异性。实际上，上述结果揭示了不同的细菌和真核生物E3结构域可嵌合以形成功能性uAb的容易度。为了研究合成的结合蛋白结构域在基于IpaH9.8的uAb中的可互换性，首先用其他高亲和性GFP结合蛋白如FN3抗体类似物GS5(K

接下来，研究了IpaH9.8催化结构域与两种不同的FN3抗体类似物的相容性：NSa5对SHP2的Src-同源2(SH2)结构域具有特异性(Sha等人,“Dissection of the BCR-ABLSignaling Network Using Highly Specific Monobody Inhibitors to the SHP2 SH2Domains,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(37):14924-29(2013)，其全部内容特此通过引用并入本文)，并且RasInII对HRas、KRas和G12V突变体中的每一个具有特异性(Cetin等人,“Raslns:Genetically Encoded Intrabodies of Activated Ras Proteins,”J.Mol.Biol.429(4):562-573(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文)。通过流式细胞术分析，分别测试所得NSa5-IpaH9.8和RasInII-IpaH9.8嵌合体沉默SHP2-EGFP和EGFP-HRas

在上述所有实验中，当瞬时表达GS2-IpaH9.8及其对应的靶标时，实现了有效的敲低。但是，由于实验时间长短、需要精确的表达谱或使用顽固的哺乳动物细胞系，因此瞬时表达并非总是一种选择。因此，为了证明GS2-IpaH9.8介导的沉默的灵活性，针对表达为稳定整合的转基因的靶蛋白评估降解活性。具体地，当GS2-IpaH9.8在稳定地共表达EGFP的细胞中瞬时表达时，荧光活性的降低实际上与对于瞬时表达的EGFP观察到的相同(图9B)。还对ERK2-EGFP、H2B-EGFP和EGFP-HRas

实例4-编码GS2-IpaH9.8的mRNA的递送使得能够在小鼠中进行蛋白质组编辑。

从治疗的角度来看，基于蛋白质的技术如uAb面临的最大挑战之一是细胞内递送。Osherovich,L.,“Degradation From Within,”Science-Business Exchange 7:10-11(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文。本小组的研究人员先前显示，由含有聚A尾的合成mRNA、PABP和生物相容性阳离子多肽构成的共组装纳米复合物(图5A)在体外和小鼠中均大大增强了mRNA表达。Li等人,“Polyamine-Mediated Stoichiometric Assembly ofRibonucleoproteins for Enhanced mRNA Delivery,”Angew Chem.Int.Ed.Engl.56(44):13709-12(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文。在此，假设将GS2-IpaH9.8 mRNA/PABP纳米复合物递送至哺乳动物细胞将导致相比HEK293T细胞中相同的多胺单独进行mRNA转染产生明显更高的uAb表达，从而导致有效的蛋白质降解。为了测试该假设，首先通过定量d2EGFP的降解来体外评估GS2-IpaH9.8 mRNA/PABP纳米复合物递送，d2EGFP是一种不稳定的GFP变体，在HEK293T细胞中被表达为稳定的转基因。如所预期的，仅当阳离子纳米复合物含有活性的、靶标特异性的GS2-IpaH9.8 mRNA并且PABP稳健时，才实现了d2EGFP降解(图5B)。所有其他对照，包括催化失活的GS2-IpaH9.8

受这些结果的鼓励，接下来评估了uAb纳米复合物介导的体内递送和沉默活性。向在所有组织中组成型表达EGFP(Schaefer等人,“Observation of Antigen-Dependent CD8+T-Cell/Dendritic Cell Interactions In Vivo”Cell Immunol.214(2):110-22(2001)，其全部内容特此通过引用并入本文)的转基因UBI-GFP/BL6小鼠的耳朵皮下注射GS2-IpaH9.8 mRNA/PABP纳米复合物。注意到尽管此小鼠品系普遍表达EGFP，但在被毛覆盖的区域中荧光被吸收且无法检测到。注射后24小时的荧光成像显示，接受GS2-IpaH9.8 mRNA/PABP纳米复合物注射的左耳中的EGFP荧光被强力消除，耳朵荧光降低了70％(图5C和5D)。与之形成鲜明对比的是，右耳中接受催化失活的GS2-IpaH9.8

实例5-实例1-4的讨论

Ubiquibody是一种较新的蛋白质组编辑方式，使得能够选择性去除体细胞中原本稳定的蛋白质(Portnoff等人,“Ubiquibodies,Synthetic E3 Ubiquitin LigasesEndowed With Unnatural Substrate Specificity for Targeted Protein Silencing,”J.Biol.Chem.289(11):7844-55(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文)，在基础研究、药物发现和治疗中具有潜在的应用。在本研究中，创造了一种新型的具有细菌E3泛素连接酶特征的uAb，从而为uAb的开发打开了一个尚未开发的泛素化活性来源之门。具体而言，评估了14种细菌E3连接酶，这些细菌E3连接酶属于不断增长的效应蛋白类别，其模拟宿主细胞E3连接酶以利用泛素化途径。Maculins等人,“Bacteria-Host Relationship:UbiquitinLigases as Weapons of Invasion.”Cell Res.26(4):499-510(2016)和Lin等人,“Exploitation of the Host Cell Ubiquitin Machinery by Microbial EffectorProteins,”J.Cell Sci.130(12):1985-96(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文。其中最引人注目的是来自弗氏志贺氏菌的IpaH9.8，当通过遗传融合的合成结合结构域直接导向靶底物时，它被证明是蛋白质转换的重要催化剂。发现这种沉默活性与底物的亚细胞定位(即细胞质、细胞核、质膜)或表达方式(即瞬时与稳定)无关。唯一具有类似功能的其他E3连接酶是在pWR100毒力质粒或染色体上在弗氏志贺氏菌中发现的IpaH9.8的同源物。Maculins等人,“Bacteria-Host Relationship:Ubiquitin Ligases as Weapons ofInvasion.”Cell Res.26(4):499-5l0(2016)，其全部内容特此通过引用并入本文。这些酶的N末端催化NEL结构域具有惊人的同源性(99-100％)，这说明了它们在uAb环境中的相似性能。因此，接下来功能最佳的细菌E3泛素连接酶是鼠伤寒沙门氏菌SspH1，它也是一种NEL型酶，与IpaH9.8的总体同一性为38％，并且在NEL结构域中的同一性为42％。Norkowski等人,The Species-Spanning Family of LPX-Motif Harbouring Effector Proteins,”Cell Microbiol.20(11):el2945(2018)，其全部内容特此通过引用并入本文。还应该指出，在该测试的条件下，没有一个哺乳动物的E3泛素连接酶能够将EGFP水平降低到60％以下。尽管其原因尚不完全清楚，但鉴于先前报道的uAb格式的这些不同E3连接酶的成功敲低结果(Portnoff等人,“Ubiquibodies,Synthetic E3 Ubiquitin Ligases Endowed WithUnnatural Substrate Specificity for Targeted Protein Silencing,”J.Biol.Chem.289(11):7844-55(2014)；Caussinus等人,“Fluorescent Fusion ProteinKnockout Mediated by Anti-GFP Nanobody,”Nat.Struct.Mol.Biol.19(1):117-21(2011)；Fulcher等人,“Targeting Endogenous Proteins For Degradation Through theAffinity-Directed Protein Missile System,”Open Biol.7(5):170066(2017)；Fulcher等人,“An Affinity-Directed Protein Missile System for Targeted Proteolysis,”Open Biol 6(10):160255(2016)；Shin等人,“Nanobody-Targeted E3-Ubiquitin LigaseComplex Degrades Nuclear Proteins,”Sci.Rep.5:14269(2015)；和Kanner等人,“Sculpting Ion Channel Functional Expression with Engineered UbiquitinLigases,”Elife 6:e29744(2017)，所有文献的全部内容特此通过引用并入本文)，表明EGFP可能代表这些工程化嵌合体的差底物。

虽然此处的工作主要集中在沉默FP和FP标记底物上，但仍设计了基于IpaH9.8的uAb，其有效降解包括HRas在内的疾病相关靶标，与KRas和NRas以及和SHP2(Ras/MAPK信号转导通路的调节剂)共同构成癌症中最常见的突变癌蛋白。重要的是，耗尽这些临床上重要的靶标以及所有其他FP融合体的能力用于突出uAb技术的非凡模块化。仅仅交换E3泛素连接酶的天然底物结合结构域可生成对不同底物蛋白具有特异性的定制uAb。有趣的是，志贺氏菌属已经形成一种类似的策略，用于在感染过程中推翻宿主防御，其中质粒和染色体编码的IpaH蛋白通过介导NF-κB相关蛋白的蛋白酶体降解在抑制宿主炎症反应中起关键作用。Ashida等人,“A Bacterial E3Ubiquitin Ligase IpaH9.8 Targets NEMO/IKKgammato Dampen the Host NF-KapPab-Mediated Inflammatory Response,”Nat Cell Biol.12(1):66-73,同上，pp.1-9(2010)和Ashida等人,“Shigella IpaH Family Effectors as aVersatile Model for Studying Pathogenic Bacteria,”Front CellInfect.Microbiol.5:100(2015)，其全部内容特此通过引用并入本文。具体来说，通过采用不同的LRR结构域，它们仅共享约50％的相似度(Norkowski等人,“The Species-SpanningFamily of LPX-Motif Harboring Effector Proteins,”Cell Microbial.el 2945(2018)，其全部内容特此通过引用并入本文)，志贺氏菌能够将几乎相同的催化NEL结构域重定向到一系列宿主蛋白上(例如，对于IpaH9.8为NEMO、U2AF53；对于IpaH7.8为Glomulin；对于IpaH4.5为p65；对于IpaH2.5和IpaH1.4为HOIP；对于IpaH0722为TRAF2)。Maculins等人,“Bacteria-Host Relationship:Ubiquitin Ligases as Weapons of Invasion.CellRes.26(4):499-5l0(2016)；Lin等人,“Exploitation of the Host Cell UbiquitinMachinery by Microbial Effector Proteins,”J.Cell Sci.130(12):1985-96(2017)；和Ashida等人,“Shigella IpaH Family Effectors as a Versatile Model for StudyingPathogenic Bacteria,”Front Cell Infect.Microbiol.5:100(2015)，所有文献的全部内容特此通过引用并入本文。据信泛素化这些结构多样的底物所需的固有构象灵活性有助于解释NEL基序对可定制靶标降解的显著能力。还应该指出，尽管此处的工作利用了先前确认的E3泛素连接酶，但可以使用类似的交换策略来创建基于GS2的uAb以鉴定新型E3连接酶。此类方法可以实现对E3连接酶的系统鉴定，这是一个重要的目标，考虑到人类基因组编码了600多种推定的E3连接酶(Metzger等人,“HECT and RING Finger Families of E3Ubiquitin Ligases at a Glance,”J.Cell Sci.125(Pt 3):531-37(2012)，其全部内容特此通过引用并入本文)，而细菌基因组可能编码了数百种其他酶，其中许多仍待确认是泛素转移的催化剂。

从药物开发的观点来看，传统上已经使用小分子抑制剂实现了基因产物的药理控制，所述小分子抑制剂靶向酶和受体，所述酶和受体具有定义明确的牢固结合小分子的疏水口袋。不幸的是，人类蛋白质组中的大多数(约80-85％)由难以治疗的靶标构成，例如转录因子、支架蛋白和非酶蛋白，其无法被药理学抑制并且因此视为“无成药性”。Crews,C.M.,“Targeting the Undruggable Proteome:The Small Molecules of My Dreams,”Chem.Biol.17(6):551 55(2010)和Arkin等人,“Small-Molecule Inhibitors ofProtein-Protein nteractions:Progressing Towards The Dream,”Nat.Rev.DrugDiscov.3(4):301-17(2004)，其全部内容特此通过引用并入本文。作为替代方案，现在可以使用多种在DNA或RNA水平上沉默蛋白质的技术，例如CRISPR、RNAi、TALEN和ZFN，第一种RNAi疗法patisiran于2018年获得批准用于遗传性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性。Adams等人,“Patisiran,An RNAi Therapeutic,For Hereditary Transthyretin Amyloidosis,”N.Engl.J.Med.379(1):11-21(2018)，其全部内容特此通过引用并入本文。尽管如此，仍希望提供新的适应性技术，例如uAb和相关的PROTACs技术，其提供对蛋白质沉默的时间和翻译后控制，尤其是因为它们有潜力克服与基于核酸靶向的方法相关的某些局限性，例如不可逆性，缺乏时间控制力和脱靶效应。Deleavey等人,“Designing Chemically ModifiedOligonucleotides for Targeted Gene Silencing,”Chemistry&Biology 19(8):937-54(2012)；Gaj等人,“TALEN,and CRISPR/Cas-Based Methods for Genome Engineering,”Trends Biotechnol.31(7):397-405(2013)；Fu等人,“High-Frequency Off-TargetMutagenesis Induced by CRISPR-Cas Nucleases in Human Cells,”Nat.Biotechnol.31(9):822-26(2013)；和Fedorov等人,“Off-Target Effects by siRNA Can Induce ToxicPhenotype,”RNA 12(7):1188-96(2006)，其全部内容特此通过引用并入本文。原则上，uAb和PROTAC均可降解蛋白质，而不论其功能如何，包括目前无成药性的蛋白质组。此外，与传统的“基于占用率”的疗法不同，uAb和PROTAC具有催化作用，使其分别比构建它们的靶标结合抗体模拟物和小分子抑制剂显著更有效。

uAb的主要优势在于它们可以迅速适于命中各种细胞内靶标的容易度，这是由于它们的重组、模块化设计，这主要利用全部早已存在的合成结合蛋白以及系统的全基因组的努力来从头产生并验证针对人类蛋白质组的蛋白结合物。Colwill等人,“A Roadmap toGenerate Renewable Protein Binders to the Human Proteome,”Nat.Methods8(7):551—58(2011)，其全部内容特此通过引用并入本文。因为获得以高特异性和亲和力结合靶标的抗体模拟物应该比获得具有相同特性的小分子更容易，所以使得定制设计的PROTAC可能是更具挑战性的任务。Osherovich,L.,“Degradation From Within,”Science-BusinessExchange 7:10-11(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文。尽管如此，PROTAC作为一种治疗方法是大有前途的，因为它基于具有大几率进入细胞的小分子。确实，令人印象深刻的临床前体外和体内数据推动了临床上可行的PROTAC的发展，2013年发现Arvinas和2016年发现C4 Therapeutics证明了这一点。但是，应该指出的是，将需要传统的药物化学方法来改善PROTAC的口服生物利用度、药代动力学以及吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADMET)特性。Neklesa等人,“Targeted Protein Degradation by PROTACs,”Pharmacol.Ther.17:4138-144(2017)和Deshaies,R.T,“Protein Degradation:Prime Time for PROTACs,”Nat.Chem.Biol.11(9):634-35(2015)，其全部内容特此通过引用并入本文。与PROTAC相比，基于uAb的疗法的细胞内递送是一个更大的障碍，因为大多数球状蛋白药物由于其较大的尺寸和生化特性而不会自发穿过质膜。Osherovich,L.,“Degradation From Within,”Science-Business Exchange 7:10-11(2014)，其全部内容特此通过引用并入本文。本文研究的一种可能的解决方案是使用mRNA作为体内治疗性基因产物的来源。近年来，通过结构修饰已大大克服了使用mRNA的障碍，包括其不稳定性和免疫原性，同时通过纳米技术和材料科学的进步解决了与递送和蛋白质表达谱有关的问题。Guan等人,“Nanotechnologiesin Delivery of mRNA Therapeutics Using Nonviral Vector-Based DeliverySystems,”Gene Ther.24(3):133-43(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文。在这里，利用了这种独特的方法来创建一流的治疗性uAb递送策略；该方法涉及最近证明的稳定预先形成的蛋白质-RNA复合物以进行递送的静电学策略。Li等人,“Polyamine-MediatedStoichiometric Assembly of Ribonucleoproteins for Enhanced mRNA Delivery,”Angew Chem.Int.Ed.Engl.56(44):13709-12(2017)，其全部内容特此通过引用并入本文。在这里，将编码GFP导向的GS2-IpaH9.8嵌合体的合成mRNA与PABP共组装，并使用带有阳离子胺化侧基的结构明确的多肽将组装的核糖核蛋白包装成纳米尺寸的复合物。所得的纳米复合物在体外和体内均实现了GFP的高效沉默，从而证明了新的蛋白质组编辑范例，并为基于uAb的疗法的临床翻译打开了大门。

尽管本文已经详细描绘和描述了优选实施例，但是对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本申请的精神的情况下，可以进行各种修改、增加、替换等，并且因此认为这些在以下权利要求所限定的本申请的范围之内。

序列表

<110> 康奈尔大学

麻省理工学院

<120> 用工程化细菌泛素连接酶模拟物进行的广谱蛋白质组编辑

<130> 8177-02-PCT

<150> 62/644,055

<151> 2018-03-16

<160> 38

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自丁香假单胞菌的AvrPtoB U-box基序

<400> 1

Met Ala Gly Ile Asn Arg Ala Gly Pro Ser Gly Ala Tyr Phe Val Gly

1 5 10 15

His Thr Asp Pro Glu Pro Val Ser Gly Gln Ala His Gly Ser Gly Ser

20 25 30

Gly Ala Ser Ser Ser Asn Ser Pro Gln Val Gln Pro Arg Pro Ser Asn

35 40 45

Thr Pro Pro Ser Asn Ala Pro Ala Pro Pro Pro Thr Gly Arg Glu Arg

50 55 60

Leu Ser Arg Ser Thr Ala Leu Ser Arg Gln Thr Arg Glu Trp Leu Glu

65 70 75 80

Gln Gly Met Pro Thr Ala Glu Asp Ala Ser Val Arg Arg Arg Pro Gln

85 90 95

Val Thr Ala Asp Ala Ala Thr Pro Arg Ala Glu Ala Arg Arg Thr Pro

100 105 110

Glu Ala Thr Ala Asp Ala Ser Ala Pro Arg Arg Gly Ala Val Ala His

115 120 125

Ala Asn Ser Ile Val Gln Gln Leu Val Ser Glu Gly Ala Asp Ile Ser

130 135 140

His Thr Arg Asn Met Leu Arg Asn Ala Met Asn Gly Asp Ala Val Ala

145 150 155 160

Phe Ser Arg Val Glu Gln Asn Ile Phe Arg Gln His Phe Pro Asn Met

165 170 175

Pro Met His Gly Ile Ser Arg Asp Ser Glu Leu Ala Ile Glu Leu Arg

180 185 190

Gly Ala Leu Arg Arg Ala Val His Gln Gln Ala Ala Ser Ala Pro Val

195 200 205

Arg Ser Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Gly

210 215 220

Ser Ser Gln Arg Ser Leu Phe Gly Arg Phe Ala Arg Leu Met Ala Pro

225 230 235 240

Asn Gln Gly Arg Ser Ser Asn Thr Ala Ala Ser Gln Thr Pro Val Asp

245 250 255

Arg Ser Pro Pro Arg Val Asn Gln Arg Pro Ile Arg Val Asp Arg Ala

260 265 270

Ala Met Arg Asn Arg Gly Asn Asp Glu Ala Asp Ala Ala Leu Arg Gly

275 280 285

Leu Val Gln Gln Gly Val Asn Leu Glu His Leu Arg Thr Ala Leu Glu

290 295 300

Arg His Val Met Gln Arg Leu Pro Ile Pro Leu Asp Ile Gly Ser Ala

305 310 315 320

Leu Gln Asn Val Gly Ile Asn Pro Ser Ile Asp Leu Gly Glu Ser Leu

325 330 335

Val Gln His Pro Leu Leu Asn Leu Asn Val Ala Leu Asn Arg Met Leu

340 345 350

Gly Leu Arg Pro Ser Ala Glu Arg Ala Pro Arg Pro Ala Val Pro Val

355 360 365

Ala Pro Ala Thr Ala Ser Arg Arg Pro Asp Gly Thr Arg Ala Thr Arg

370 375 380

Leu Arg Val Met Pro Glu Arg Glu Asp Tyr Glu Asn Asn Val Ala Tyr

385 390 395 400

Gly Val Arg Leu Leu Asn Leu Asn Pro Gly Val Gly Val Arg Gln Ala

405 410 415

Val Ala Ala Phe Val Thr Asp Arg Ala Glu Arg Pro Ala Val Val Ala

420 425 430

Asn Ile Arg Ala Ala Leu Asp Pro Ile Ala Ser Gln Phe Ser Gln Leu

435 440 445

Arg Thr Ile Ser Lys Ala Asp Ala Glu Ser Glu Glu Leu Gly Phe Lys

450 455 460

Asp Ala Ala Asp His His Thr Asp Asp Val Thr His Cys Leu Phe Gly

465 470 475 480

Gly Glu Leu Ser Leu Ser Asn Pro Asp Gln Gln Val Ile Gly Leu Ala

485 490 495

Gly Asn Pro Thr Asp Thr Ser Gln Pro Tyr Ser Gln Glu Gly Asn Lys

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Asp Leu Ala Phe Met Asp Met Lys Lys Leu Ala Gln Phe Leu Ala Gly

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Lys Pro Glu His Pro Met Thr Arg Glu Thr Leu Asn Ala Glu Asn Ile

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Ala Lys Tyr Ala Phe Arg Ile Val Pro

545 550

<210> 2

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自丁香假单胞菌的AvrPtoB U-box基序

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<212> PRT

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<220>

<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH0722新型E3连接酶

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Pro Pro His Ile Gln Glu Leu Asn Ile Ser Ser Asn Glu Leu Arg Ser

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Asn Val Gly Glu Asn Gln Leu His Arg Leu Pro Glu Leu Pro Gln Arg

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Ser Ile Met Asn Leu His Ile Tyr Ala Asp Val Asn Ile Tyr Asn Asn

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH0722新型E3连接酶

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH1.4新型E3连接酶

<400> 5

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<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH1.4新型E3连接酶

<400> 6

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ttagatttaa aaacattacc agatttaccg cctcagataa caacactgga aataagaaaa 300

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<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH2.5新型E3连接酶

<400> 7

Met Leu Ile Arg Ile Leu Val Ile Met Ile Lys Ser Thr Asn Ile Gln

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Ala Ile Gly Ser Gly Ile Met His Gln Ile Asn Asn Val Tyr Ser Leu

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Gly Pro Arg Ile Phe Phe Ser Met Gly Asn Ser Ala Thr Ile Ser Ala

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1 5 10 15

Ser Cys Ile Ser Arg Leu Ser Val Glu Glu Gln Cys Thr Arg Asp Tyr

20 25 30

His Arg Ile Trp Asp Asp Trp Ala Arg Glu Gly Thr Thr Thr Glu Asn

35 40 45

Arg Ile Gln Ala Val Arg Leu Leu Lys Ile Cys Leu Asp Thr Arg Glu

50 55 60

Pro Val Leu Asn Leu Ser Leu Leu Lys Leu Arg Ser Leu Pro Pro Leu

65 70 75 80

Pro Leu His Ile Arg Glu Leu Asn Ile Ser Asn Asn Glu Leu Ile Ser

85 90 95

Leu Pro Glu Asn Ser Pro Leu Leu Thr Glu Leu His Val Asn Gly Asn

100 105 110

Asn Leu Asn Ile Leu Pro Thr Leu Pro Ser Gln Leu Ile Lys Leu Asn

115 120 125

Ile Ser Phe Asn Arg Asn Leu Ser Cys Leu Pro Ser Leu Pro Pro Tyr

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Leu Gln Ser Leu Ser Ala Arg Phe Asn Ser Leu Glu Thr Leu Pro Glu

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Leu Pro Ser Thr Leu Thr Ile Leu Arg Ile Glu Gly Asn Arg Leu Thr

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Val Leu Pro Glu Leu Pro His Arg Leu Gln Glu Leu Phe Val Ser Gly

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Asn Arg Leu Gln Glu Leu Pro Glu Phe Pro Gln Ser Leu Lys Tyr Leu

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Leu Leu Ala Leu Asp Val Ser Asn Asn Leu Leu Thr Ser Leu Pro Glu

225 230 235 240

Asn Ile Ile Thr Leu Pro Ile Cys Thr Asn Val Asn Ile Ser Gly Asn

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Pro Leu Ser Thr Arg Val Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Thr Ser Ser

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Pro Glu Asn Lys Gln Ser Asp Val Ser Gln Ile Trp His Ala Phe Glu

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Asp Thr Val Ser Ala Arg Asn Thr Ser Gly Phe Arg Glu Gln Val Ala

340 345 350

Ala Trp Leu Glu Lys Leu Ser Ala Ser Ala Glu Leu Arg Gln Gln Ser

355 360 365

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Leu Thr Trp Asn Asn Leu Arg Lys Thr Leu Leu Val His Gln Ala Ser

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Arg Thr Leu His Phe Val Asp Glu Ile Glu Val Tyr Leu Ala Phe Gln

435 440 445

Thr Met Leu Ala Glu Lys Leu Gln Leu Ser Thr Ala Val Lys Glu Met

450 455 460

Arg Phe Tyr Gly Val Ser Gly Val Thr Ala Asn Asp Leu Arg Thr Ala

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Glu Ala Met Val Arg Ser Arg Glu Glu Asn Glu Phe Thr Asp Trp Phe

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<213> 人工

<220>

<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH4.5新型E3连接酶

<400> 10

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<220>

<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH7.8新型E3连接酶

<400> 11

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65 70 75 80

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130 135 140

Glu Asn Asn Arg Leu Tyr Asn Leu Pro Ala Leu Pro Glu Lys Leu Lys

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165 170 175

Asp Lys Leu Glu Ile Leu Cys Ala Gln Arg Asn Asn Leu Val Thr Phe

180 185 190

Pro Gln Phe Ser Asp Arg Asn Asn Ile Arg Gln Lys Glu Tyr Tyr Phe

195 200 205

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210 215 220

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<210> 12

<211> 1698

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH7.8新型E3连接酶

<400> 12

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<211> 545

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH9.8新型E3连接酶

<400> 13

Met Leu Pro Ile Asn Asn Asn Phe Ser Leu Pro Gln Asn Ser Phe Tyr

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Arg Leu Asn Leu Ser Ser Leu Pro Asp Asn Leu Pro Ala Gln Ile Thr

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Glu Gly Asn Asn Pro Val Val Arg Glu Tyr Phe Phe Asp Arg Asn Gln

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260 265 270

Ile Trp His Ala Phe Glu His Glu Glu His Ala Asn Thr Phe Ser Ala

275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

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Leu Val His Gln Ala Ser Glu Gly Leu Phe Asp Asn Asp Thr Gly Ala

355 360 365

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545

<210> 14

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自弗氏志贺氏菌的IpaH9.8新型E3连接酶

<400> 14

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自嗜肺军团菌的LegAU13 F-box基序

<400> 15

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自嗜肺军团菌的LegAU13 F-box基序

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aaaggaatcg atccaaccca gaccaatagc taccacttaa atagaacgcc tttacttgca 300

gctatcgaag gaaaagcata tcaaactgca aattacctct ggagaaaata cactttcgat 360

cccaatttta aagataacta tggtgattca cctatctctc ttcttaaaaa gcaactggca 420

aatccagcct tcaaggataa ggaaaaaaaa caaatacgcg ccttaattag gggaatgcaa 480

gaagaaaaaa tagcacagag caagtgcctt gtttgttaa 519

<210> 17

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自嗜肺军团菌的LegU1 F-box基序

<400> 17

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Lys Lys Arg His Arg Gln Ala Ile Ala Gln Met Met Ser Gly Arg Val

65 70 75 80

Thr Ala Ser Ser Met Ala Lys Leu Phe Glu Glu Leu Leu Cys Phe Ser

85 90 95

Ile Pro Ser Ser Tyr Val Phe Leu Ile Phe Phe Ala Ser Gln Lys Ser

100 105 110

Val Ala Leu Ile Glu Val Leu Thr Val Ile Leu Val Phe Ala Ala Ile

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130 135 140

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165 170 175

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180 185

<210> 18

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自嗜肺军团菌的LegU1 F-box基序

<400> 18

atgaaagcaa aatacgaccc cacaaagcct ggactccaaa agttacctcc tgaaatcaag 60

gtaatgattc ttgagtttct tgatgccaaa tcaaaactag ctctttcaca gacaaattat 120

ggttggcgtg atttaattct agaccggcca gaatatacca aagaaataac gaatacatta 180

tttcgtcttg ataaaaaacg ccatcgtcaa gcaatagcac aaatgatgtc aggaagagtt 240

acagcaagtt ctatggctaa gctatttgaa gaattactat gttttagcat accttcgtcc 300

tatgtgtttt taatcttttt cgcatcgcaa aaatctgtgg cgcttataga agtcttaacc 360

gtaatccttg tgtttgctgc aataacctct ctcgcccatg atctggtgga ttattttatt 420

gaaagtgata caaaagctga gaaacagcat gcacatcgcc gtgcttttca attctttgcc 480

caacccagtc aaagcgctgc acaacaaaac ttggaggaag agaatttaag tgctgatccc 540

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<210> 19

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自嗜肺军团菌的LubX U-box基序

<400> 19

Met Ala Thr Arg Asn Pro Phe Asp Ile Asp His Lys Ser Lys Tyr Leu

1 5 10 15

Arg Glu Ala Ala Leu Glu Ala Asn Leu Ser His Pro Glu Thr Thr Pro

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Thr Met Leu Thr Cys Pro Ile Asp Ser Gly Phe Leu Lys Asp Pro Val

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Ile Thr Pro Glu Gly Phe Val Tyr Asn Lys Ser Ser Ile Leu Lys Trp

50 55 60

Leu Glu Thr Lys Lys Glu Asp Pro Gln Ser Arg Lys Pro Leu Thr Ala

65 70 75 80

Lys Asp Leu Gln Pro Phe Pro Glu Leu Leu Ile Ile Val Asn Arg Phe

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Val Glu Thr Gln Thr Asn Tyr Glu Lys Leu Lys Asn Arg Leu Val Gln

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Asn Ala Arg Val Ala Ala Arg Gln Lys Glu Tyr Thr Glu Ile Pro Asp

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Ile Phe Leu Cys Pro Ile Ser Lys Thr Leu Ile Lys Thr Pro Val Ile

130 135 140

Thr Ala Gln Gly Lys Val Tyr Asp Gln Glu Ala Leu Ser Asn Phe Leu

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Ile Ala Thr Gly Asn Lys Asp Glu Thr Gly Lys Lys Leu Ser Ile Asp

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Asp Val Val Val Phe Asp Glu Leu Tyr Gln Gln Ile Lys Val Tyr Asn

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Phe Tyr Arg Lys Arg Glu Val Gln Lys Asn Gln Ile Gln Pro Ser Val

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Ser Asn Gly Phe Gly Phe Phe Ser Leu Asn Phe Leu Thr Ser Trp Leu

210 215 220

Trp Gly Thr Glu Glu Lys Lys Glu Lys Thr Ser Ser Asp Met Thr Tyr

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<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自嗜肺军团菌的LubX U-box基序

<400> 20

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attttaaaat ggttagaaac gaaaaaagaa gacccacaaa gccgtaaacc cttaacggct 240

aaagatttgc aaccattccc cgagttattg attatagtca atagatttgt tgagacacaa 300

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aaagaataca ctgaaattcc ggatatattt ctttgcccaa taagtaaaac gcttatcaaa 420

acacctgtca ttactgccca agggaaagta tatgatcaag aagcattaag taactttctt 480

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taa 723

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7的NleG2-3 U-box基序

<400> 21

Met Pro Leu Thr Ser Asp Ile Arg Ser His Ser Phe Asn Leu Gly Val

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Glu Val Val Arg Ala Arg Ile Val Ala Asn Gly Arg Gly Asp Ile Thr

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Val Gly Gly Glu Thr Val Ser Ile Val Tyr Asp Ser Thr Asn Gly Arg

35 40 45

Phe Ser Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Leu Leu Ser Glu Leu Leu Leu

50 55 60

Leu Gly Phe Asn Ser Gly Pro Arg Ala Leu Gly Glu Arg Met Leu Ser

65 70 75 80

Met Leu Ser Asp Ser Gly Glu Ala Gln Ser Gln Glu Ser Ile Gln Asn

85 90 95

Lys Ile Ser Gln Cys Lys Phe Ser Val Cys Pro Glu Arg Leu Gln Cys

100 105 110

Pro Leu Glu Ala Ile Gln Cys Pro Ile Thr Leu Glu Gln Pro Glu Lys

115 120 125

Gly Ile Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly Ser Asp Val Cys Thr Leu Phe

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Asp Ala Ala Ala Phe Ser Arg Leu Val Gly Glu Gly Leu Pro His Pro

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Leu Thr Arg Glu Pro Ile Thr Ala Ser Ile Ile Val Lys His Glu Glu

165 170 175

Cys Ile Tyr Asp Asp Thr Arg Gly Asn Phe Ile Ile Lys Gly Asn

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7的NleG2-3 U-box基序

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<212> PRT

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Arg Gly Glu Ala Gln Ile Arg Leu Gly Glu Leu Met Val Ser Ile Arg

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Leu Ser Asn Asp Asn Ile Gln Ile Gly Leu Gln Tyr Ile Glu His Ile

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Glu Arg Thr Leu Asn His Gly Ser Leu Thr Ser Arg Glu Val Thr Val

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Leu Arg Glu Ile Glu Met Leu Glu Asn Met Asp Leu Leu Ser Asn Tyr

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7的NleL HECT基序

<400> 26

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275 280 285

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 来自嗜肺军团菌的SidC非常规基序

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<210> 29

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自肠出血性大肠杆菌（“EHEC”）O157:H7的SlrP新型E3连接酶

<400> 29

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<210> 30

<211> 2298

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 来自肠出血性大肠杆菌（“EHEC”）O157:H7的SlrP新型E3连接酶

<400> 30

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<210> 31

<211> 782

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自鼠伤寒沙门氏菌的SopA HECT基序

<400> 31

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<211> 2349

<212> DNA

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<223> 来自鼠伤寒沙门氏菌的SopA HECT基序

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 来自鼠伤寒沙门氏菌的SspH1新型E3连接酶

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Met Phe Asn Ile Arg Asn Thr Gln Pro Ser Val Ser Met Gln Ala Ile

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Ala Gly Ala Ala Ala Pro Glu Ala Ser Pro Glu Glu Ile Val Trp Glu

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165 170 175

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180 185 190

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<213> 人工

<220>

<223> 来自鼠伤寒沙门氏菌的SspH1新型E3连接酶

<400> 34

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<213> 人工

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<223> 来自鼠伤寒沙门氏菌的SspH2新型E3连接酶

<400> 35

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<223> 野油菜黄单胞菌的XopL非常规基序

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