用于纯化重组蛋白的完全流穿过程

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白质，特别是单克隆抗体的小规模和大规模纯化的完全流穿纯化过程。

背景技术

抗体纯化可能是生物生产中成本最高的方面之一。单克隆抗体(mAb)一般使用三步式的三种树脂色谱法过程进行纯化，每一步至少使用一种特定的缓冲液系统。这种常规纯化过程包括捕获步骤，随后是中度纯化步骤，并以精细纯化步骤结束，并且通常需要3到5个工作日(包括储存和开放阶段)。在此类常规过程中，这三个步骤是在一系列不同的单元操作中执行的，由于需要在每个步骤之间调节pH、摩尔浓度和蛋白质浓度，因此这一系列不同的单元操作不能以连续的方式进行操作。因此，常规纯化过程一般在每个不连续步骤和数个系统之间需要许多不同的缓冲液和许多储存单元。因此，这些常规纯化过程容易受到污染、技术故障和人为错误的影响。另外，由于需要在每一步之间中断以浓缩洗脱液、调节pH和电导率并在下一步骤之前储存洗脱液，并且由于一个步骤无法在上一步骤完成之前开始，所以此类常规纯化过程特别冗长且成本高昂。

常规过程的高成本还归因于一般使用蛋白A基质作为纯化的第一步。实际上，从历史上看，一般在过程的早期放入最具选择性的树脂(这就是蛋白A的情况)，以去除尽可能多的杂质。然而，即使蛋白A是用于纯化单克隆抗体的最具选择性的介质，所述过程中仍然会残留污染物。这一步骤也是整个过程中成本最高的，这也是因为它被用作与大量污染物接触的第一步。另外，很难去除残留的污染物以符合药物规格。

随着细胞培养物效价的提高和用于生产的细胞培养物体积的增加，下游加工被视为行业瓶颈。这与单克隆抗体的生产尤其相关，在单克隆抗体的生产中，焦点已从批体积转移到下游加工能力。此外，早期临床前和临床阶段研究需要可以更快生产出的大量抗体。因此，行业中需要一种成本更低的过程，所述过程可以以连续的方式执行以用于蛋白质纯化，特别是用于抗体纯化，以及用于缩短获得批料所花费的时间，降低污染、技术故障和人为错误的风险，并降低过程扩大需求。

发明内容

诸位发明人已经发现了一种纯化蛋白质、特别是抗体的新型方法，所述方法仅包括以连续完全流穿方式的三个步骤，这些步骤均不涉及蛋白A，并且有利地仅使用一种缓冲液，同时仍允许获得高产率的具有优良纯度的纯化抗体。因此，所述纯化的蛋白质适用于医学应用。因此，所述方法可以用于纯化蛋白质以用于临床试验和/或用于制造包含所述蛋白质的药物组合物。另外，所述方法不需要在步骤间进行任何调节，并且因此从收获待纯化的蛋白质到最终产物可以在密闭系统中进行。

简言之，这种方法仅包括三个连续的步骤，旨在去除大量污染物的更低成本的技术用作第一步，用于第二步和第三步的技术越来越具有选择性以去除残留的少量污染物，并且因此其使用量与常规过程中的使用量相比更小。

因此，本发明的方法以连续的方式包括：一个过滤步骤，其涉及使用至少一种螯合剂；交换步骤，其涉及使用至少一层渗滤膜；以及精细纯化步骤，其涉及使用膜吸附器组合，其中所述膜吸附器组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的。图1示出了本发明的方法。这三个纯化步骤有利地以这种特定顺序实施。另外，已经发现在整个过程中仅需使用一种缓冲液，即用于所述交换步骤的缓冲液。换句话说，在所述精细纯化步骤中任选使用的平衡缓冲液与用于所述交换步骤的缓冲液有利地相同。这种缓冲液有利地包含Bis Tris、Tris、Tris-HCl、磷酸盐和/或柠檬酸，例如与NaCl、乙酸和水组合。更特别地，可以在整个过程中仅使用一种缓冲液，从而确保所有步骤之间的相容性，并且使得能够节约供应链制造和质量控制并降低储存要求。

本发明的方法进一步允许取消开放阶段(即打开所述纯化系统以进行诸如为新缓冲液准备色谱柱、稀释所述样品或调节其pH的手动操作的步骤)，从而降低污染风险，并且提供在分类更少的环境中工作的可能性。另外，由于本发明的方法有利地不涉及使用任何柱并且主要使用一次性且即用型膜吸附器，因此无需储存或重复使用验证，无需准备或填充柱或相关的控制，无需清洁验证和有限的硬件。因此缩短了过程周期时间，最大限度地降低了过程扩大的需求，并且可以减少操作和储存费用。因此，本发明的方法既允许快速成本低廉的分批生产又可以减少所述纯化系统的占用时间。因此，所述方法适用于从实验室规模到工业规模的扩大和重组蛋白的纯化。

已经针对两种不同的抗体制定并实施了特定的方案。在这种方案中，使在第一过滤步骤结束时获得的经过滤的蛋白质溶液直接通过所述至少一层渗滤膜，即无需进行任何处理如pH调节、缓冲液更换或稀释，并且使在所述交换步骤结束时获得的渗余物也直接通过至少两个膜吸附器的组合，即无需进行任何处理如pH调节、缓冲液更换或稀释。这种方案的优点是极快(几个小时)，导致高产率(超过70％)，纯度符合制药行业标准，并且能够减少所使用的缓冲液和储存设施二者。此外，这种过程具有非常灵活和节省成本的优点，因为它不涉及使用蛋白A基质，所述蛋白A基质一般是常规过程中成本最高的要素。另外，所述过程可以完全自动化，以连续的方式运行，并且不包括任何开放阶段。此外，已成功地针对两种不同的抗体执行了所述过程。

因此，本发明提供了一种从溶液纯化蛋白质的方法，所述方法包括：

(a)过滤步骤，其包括：

-使所述溶液以所述流穿方式通过至少一种螯合剂基质，

-从所述至少一种螯合剂基质的流穿物回收经过滤的蛋白质溶液；

(b)交换步骤，其包括：

-使用用于所述交换的仅一种缓冲液使在步骤(a)结束时获得的所述经过滤的蛋白质溶液通过至少一层渗滤膜，

-回收所述至少一层渗滤膜的含部分纯化的蛋白质的渗余物；

(c)精细纯化步骤，其包括：

-使在步骤(b)结束时获得的所述渗余物以所述流穿方式通过膜吸附器组合，其中所述膜吸附器组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的，并且所述膜吸附器组合已预先用与步骤(b)中用于交换的所述一种缓冲液相同的平衡缓冲液进行平衡，

-从所述膜吸附器组合的流穿物回收纯化的蛋白质；

其中所述纯化方法不包括蛋白A色谱法步骤。

本发明还提供了一种从溶液纯化蛋白质的方法，所述方法包括：

(a)过滤步骤，其包括：

-使所述溶液以所述流穿方式通过至少一种螯合剂基质，

-从所述至少一种螯合剂基质的流穿物回收经过滤的蛋白质溶液；

(b)交换步骤，其包括：

-使用用于所述交换的仅一种缓冲液使在步骤(a)结束时获得的所述经过滤的蛋白质溶液通过至少一层渗滤膜，所述仅一种缓冲液与在所述精细纯化步骤(c)中使用的平衡缓冲液相同；

-回收所述至少一层渗滤膜的含部分纯化的蛋白质的渗余物；

(c)精细纯化步骤，其包括：

-使在步骤(b)结束时获得的所述渗余物以所述流穿方式通过膜吸附器组合，其中所述膜吸附器组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的，并且所述膜吸附器组合已预先用所述平衡缓冲液进行平衡，

-从所述膜吸附器组合的流穿物回收纯化的蛋白质；

其中所述纯化方法不包括蛋白A色谱法步骤。

本发明特别提供了一种从溶液纯化蛋白质的方法，所述方法包括：

(a)过滤步骤，其包括：

(i)使所述溶液以所述流穿方式通过所述至少一种螯合剂基质，

(ii)从所述至少一种螯合剂基质的流穿物回收经过滤的蛋白质溶液，

(b)交换步骤，其包括：

(i)使用用于所述交换的仅一种缓冲液使在步骤(a)结束时获得的所述经过滤的蛋白质溶液通过所述至少一层渗滤膜，

(ii)回收所述至少一层渗滤膜的含部分纯化的蛋白质的渗余物；

以及

(c)精细纯化步骤，其包括：

(i)使平衡缓冲液通过所述膜吸附器组合，其中所述平衡缓冲液与步骤(b)中用于交换的所述一种缓冲液相同，

(ii)使从步骤(b)获得的渗余物以所述流穿方式通过所述膜吸附器组合，

(iii)从所述膜吸附器组合的流穿物回收纯化的蛋白质；

其中所述纯化方法不包括蛋白A色谱法步骤。

在本发明的一个实施方案中，整个所述纯化方法仅使用一种缓冲液。在特定实施方案中，所述一种缓冲液包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸盐和/或柠檬酸。在另一个实施方案中，所述一种缓冲液包含以下项或由以下项组成：(i)Bis Tris、Tris或Tris-HCl，(ii)乙酸，(iii)水和(iv)任选的盐。

在一个实施方案中，所述过滤步骤的所述至少一种螯合剂基质选自活性炭、硅藻土、自由阳离子交换树脂、自由阴离子交换树脂和自由混合模式树脂。在特定实施方案中，所述至少一种螯合剂基质是两种不同螯合剂基质的组合。在更特定的实施方案中，所述两种不同螯合剂基质的组合是活性炭和自由阴离子交换树脂的组合。在另一个特定实施方案中，所述至少一种螯合剂基质是多于两种(即，三种、四种、五种或多于五种)不同螯合剂基质的组合。

在一个实施方案中，所述交换步骤的所述至少一层渗滤膜为单路切向流过滤(SPTFF)模块或切向流过滤(TFF)模块。在特定实施方案中，所述交换步骤的所述至少一层渗滤膜为盒、中空纤维或螺旋缠绕的形式。在特定实施方案中，在所述交换步骤中浓缩所述经过滤的蛋白质溶液。

在一个实施方案中，所述精细纯化步骤的膜吸附器组合是两个膜吸附器的组合或至少两个膜吸附器(例如三个、四个或至少四个膜吸附器)的组合。

在一个实施方案中，所述膜吸附器组合的膜吸附器选自阳离子交换膜吸附器、阴离子交换膜吸附器、多模态(multi-modal)膜吸附器、疏水相互作用膜吸附器及其组合。在特定实施方案中，所述精细纯化步骤的膜吸附器组合是阳离子交换膜吸附器和阴离子交换膜吸附器的组合。

在一个实施方案中，所述精细纯化步骤的膜吸附器组合是至少两个膜吸附器的组合，所述至少两个膜吸附器选自阳离子交换膜吸附器、阴离子交换膜吸附器、多模态膜吸附器和疏水相互作用膜吸附器。

在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(c)之后的纳米过滤步骤以及任选地在所述纳米过滤步骤之后的最终超滤和/或渗滤步骤。在本发明的另一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(c)之后、在所述纳米过滤步骤之后和/或在所述最终超滤和/或渗滤步骤之后的低pH灭活步骤。在本发明的一个实施方案中，所述方法在步骤(a)之前包括在液体培养基中、优选在生物反应器中进行细胞培养以提供含所述蛋白质的液体培养基的步骤。所述培养的细胞可以是哺乳动物、细菌或酵母细胞。在优选的实施方案中，所述培养的细胞可以是哺乳动物细胞系(例如，Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞、HEK293细胞等，包括这些细胞系的不同亚型)以及原代或确立的哺乳动物细胞培养物(例如，由淋巴母细胞、纤维母细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生的)。

在本发明的一个实施方案中，正在纯化的蛋白质是抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

因此，本发明还提供了一种从液体培养基生成纯化的蛋白质的集成过程。

在本发明的某些实施方案中，所述一种缓冲液包含5mM至40mM(特别地，20mM)BisTris、15mM至150mM(特别地，75mM)NaCl，用乙酸将pH调节至6-9(特别地，7.5)。

在本发明的某些实施方案中，所述一种缓冲液包含5mM至40mM(特别地，20mM)Tris或Tris-HCl、15mM至150mM(特别地，75mM)NaCl，用乙酸将pH调节至6-9(特别地，7.5)。

在本发明的某些实施方案中，所述一种缓冲液包含5mM至40mM(特别地，20mM)Tris或Tris-HCl、15mM至150mM(特别地，75mM)NaCl，用柠檬酸将pH调节至6-9(特别地，7.5)。

在本发明的某些实施方案中，所述一种缓冲液包含15mM至150mM(特别地，75mM)NaCl，用

本发明提供了一种试剂盒，其包含：至少一种螯合剂基质、至少一层渗滤膜和膜吸附器组合，其中所述膜吸附器组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的；以及一种缓冲液，其包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸盐和/或柠檬酸，特别是包含以下项或由以下项组成：(i)Bis Tris、Tris或Tris-HCl，(ii)乙酸，(iii)水和(iv)任选的NaCl。在一些实施方案中，所述试剂盒用于使用本发明的方法从溶液纯化蛋白质。

本发明提供了一种试剂盒，其包含：至少一种螯合剂基质、至少一层渗滤膜和膜吸附器组合，其中所述膜吸附器组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的；以及制备一种缓冲液的说明书，所述一种缓冲液包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸盐和/或柠檬酸，特别是包含以下项或由以下项组成：(i)Bis Tris、Tris或Tris-HCl，(ii)乙酸，(iii)水和(iv)任选的NaCl。在一些实施方案中，所述试剂盒用于使用本发明的方法从溶液纯化蛋白质。

本文还提供了通过本文所述的任何方法获得的分离的蛋白质、药物制剂和药物组合物。

从以下具体实施方式并结合所附权利要求将更充分地理解所公开的纯化方法的这些和其他特征和优点。应当注意，权利要求的范围由其中的叙述来限定，而并不由说明书中阐述的特征和优点的具体讨论限定。

在本发明的上下文中，除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应视为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。另外，术语“包含”涵盖“由......组成”(例如，“包含”X的组合物可仅由X组成或可包含其他物质，例如X+Y)。

具体实施方式

为了简化蛋白质纯化过程并降低其成本，诸位发明人已经开发一种新的纯化过程，所述过程是连续的完全流穿的并且不包括蛋白A色谱法步骤。

本发明涉及一种从溶液纯化蛋白质的方法，所述方法包括：

(a)过滤步骤，其包括：

-使所述溶液以所述流穿方式通过至少一种螯合剂基质，

-从所述至少一种螯合剂基质的流穿物回收经过滤的蛋白质溶液；

(b)交换步骤，其包括：

-使用用于所述交换的仅一种缓冲液使在步骤(a)结束时获得的所述经过滤的蛋白质溶液通过至少一层渗滤膜，

-回收所述至少一层渗滤膜的含部分纯化的蛋白质的渗余物；

(c)精细纯化步骤，其包括：

-使在步骤(b)结束时获得的所述渗余物以所述流穿方式通过膜吸附器组合，其中所述膜吸附器组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的，并且所述膜吸附器组合已预先用与步骤(b)中用于交换的所述一种缓冲液相同的平衡缓冲液进行平衡，

-从所述膜吸附器组合的流穿物回收纯化的蛋白质；

其中所述纯化方法不包括蛋白A色谱法步骤。

在交换步骤(b)中，“使用用于所述交换的仅一种缓冲液使在步骤(a)结束时获得的所述经过滤的蛋白质溶液通过至少一层渗滤膜”的表述意指所述经过滤的蛋白质溶液和所述一种缓冲液通过所述至少一层渗滤膜。

在特定实施方案中，本发明的方法包括：

(a)过滤步骤，其包括：

(i)使所述溶液以所述流穿方式通过所述至少一种螯合剂基质，

(ii)从所述至少一种螯合剂基质的流穿物回收经过滤的蛋白质溶液，

(b)交换步骤，其包括：

(i)仅使用一种缓冲液使从步骤(a)获得的所述经过滤的蛋白质溶液通过所述至少一层渗滤膜，

(ii)回收所述至少一层渗滤膜的含部分纯化的蛋白质的渗余物；

以及

(c)精细纯化步骤，其包括：

(i)使平衡缓冲液通过所述膜吸附器组合，其中所述平衡缓冲液与步骤(b)中用于交换的所述一种缓冲液相同，

(ii)使从步骤(b)获得的渗余物以所述流穿方式通过所述膜吸附器组合，

(iii)从所述膜吸附器组合的流穿物回收纯化的蛋白质，

其中所述纯化方法不包括蛋白A色谱法步骤。

如上所述，本发明的上述方法仅包括三个步骤，这三个步骤均不是蛋白A色谱法步骤。即使根据本发明的方法仅包括三个步骤且没有蛋白A色谱法步骤，但它仍可以获得适于药学目的并且特别是适于向人类给予的纯化的蛋白质。

除了纯化过程中不存在人工操作(并因此缩短完成纯化过程所需的总时间)之外，所公开的方法还减少了用于纯化的缓冲液的量，并且不存在蛋白A色谱法步骤也降低了成本。除了允许纯化各种mAb之外，所公开的纯化方法还简化了mAb的纯化，提高了总产率，并且减少了原料、储存设施、商品成本和加工时间。

与常规蛋白质纯化方法形成对照，如上所述，本文公开的方法使用了一种独特的缓冲液，所述独特的缓冲液用于交换步骤并且在精细纯化步骤中用于平衡膜吸附器。

如本文所用，“根据本发明的缓冲液”是指包含Bis Tris、Tris、Tris-HCl、磷酸盐和/或柠檬酸的缓冲液。Bis Tris、Tris或Tris-HCl是本领域技术人员熟知的化合物：

-对于Bis Tris，其IUPAC名称为2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇并且其CAS号为6976-37-0

-对于Tris，IUPAC名称为2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇并且CAS号为77-86-1，并且

-对于Tris-HCl，IUPAC名称为2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇盐酸盐并且CAS号为1185-53-1。

根据本发明的此类缓冲液可以对应于交换缓冲液和平衡缓冲液。

更具体地，根据本发明的这种缓冲液可包含不同浓度的相同化学物质(其中之一是Bis Tris、Tris、Tris-HCl、磷酸盐和/或柠檬酸)或由其组成。在特定实施方案中，缓冲液包含Bis Tris、Tris、Tris-HCl、磷酸盐和/或柠檬酸。在特定实施方案中，缓冲液包含以下项或由以下项组成：(i)Bis Tris、Tris或Tris-HCl，(ii)乙酸和(iii)水。在更特定实施方案中，缓冲液包含以下项或由以下项组成：(i)Bis Tris、Tris或Tris-HCl，(ii)乙酸，(iii)NaCl和(iv)水。在其他方面，这种缓冲液包含以下项或由以下项组成：不同浓度的(i)BisTris、Tris或Tris-HCl，(ii)乙酸，(iii)NaCl和(iv)水。

例如，交换缓冲液可包含以下项或由以下项组成：5mM至40mM(例如20mM)Bis Tris和15mM至150mM(例如75mM)NaCl，用乙酸将pH调节至6-9(例如7.5)。

可替代地，交换缓冲液可包含以下项或由以下项组成：5mM至40mM(特别地，20mM)Tris或Tris-HCl、15mM至150mM(特别地，75mM)NaCl，用乙酸将pH调节至6-9(特别地，7.5)。

可替代地，交换缓冲液可包含以下项或由以下项组成：5mM至40mM(特别地，20mM)Tris或Tris-HCl、15mM至150mM(特别地，75mM)NaCl，用柠檬酸将pH调节至6-9(特别地，7.5)。

可替代地，交换缓冲液可包含以下项或由以下项组成：15mM至150mM(特别地，75mM)NaCl，用

此类交换缓冲液尤其适合与交换步骤、特别是与TFF盒一起使用，但也适合于膜吸附器的平衡、特别是阳离子交换膜吸附器和阴离子交换膜吸附器的组合的平衡。

上述缓冲液配制品的优点包括能够以较大的相容性使mAb产物通过所述方法的三个步骤、特别是交换步骤和精细纯化步骤，同时最大限度地减少不希望的相互作用，限制pH和电导率下降，并且与传统纯化方法相比促进了产率的提高。此类缓冲液配制品的使用使得能够在(a)、(b)和(c)三个步骤之间没有任何中间储存的情况下实现所述方法。

因此，在特定实施方案中，所述方法在(a)、(b)和(c)三个步骤之间不包括任何中间储存。

当重复使用精细纯化步骤的膜吸附器时，可以任选地使用消毒缓冲液。这种消毒缓冲液可包含以下项或由以下项组成：至少NaOH、更优选0.05N至1N(例如0.5N)NaOH。

如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”是指：

1)具有天然蛋白质序列的分子，即a)由天然存在的并且特别是非重组细胞产生的蛋白质，或b)基因工程化或重组细胞，或

2)因一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代和/或因至少一种翻译后修饰(例如糖基化)而与天然蛋白质的序列不同的分子。

上述第1)段中提到的分子可以称为天然蛋白质。

上述第2)段提到的分子是非天然蛋白质。

在某些方面，待纯化的蛋白质是抗体。

如本文所用，术语“抗体”是指完整抗体，或其与完整抗体竞争进行特异性结合的结合片段。结合片段包括但不限于F(ab)、F(ab')、F(ab')

如本文所用，术语“重链”涵盖全长重链及其片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，而CH3结构域位于羧基末端。

如本文所用，术语“轻链”涵盖全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。与重链一样，轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。如本文所用，术语“轻链”包括具有足以赋予对靶抗原的特异性的可变区序列的任何免疫球蛋白多肽。

天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每个这种四聚体通常由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一条全长“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条全长“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。每条轻链和重链的氨基末端部分通常包括约100至110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变结构域通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常限定负责效应子功能的恒定区。人轻链通常分类为κ和λ轻链。通常将重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有多个亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA被类似地细分为多个亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，可变区和恒定区通常通过约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，并且重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。

每个轻/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。可变区通常展现通过三个高变区(也称为互补决定区或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)的相同总体结构。来自每一对的两条链的CDR通常通过框架区对齐，这可以使得能够结合至特异性表位。从N末端到C末端，轻链和重链可变区二者通常均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对每个结构域的氨基酸分配通常根据以下出版物中的定义：Kabat等人,1991,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,美国卫生和公众服务部,NIH出版号91-3242。双特异性或双功能抗体通常是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。

F(ab)片段由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成。F(ab)分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。F(ab')片段含有一条轻链和含有更多恒定区的一条重链(在CH1与CH2结构域之间)，使得可在两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')

可以通过所公开的方法纯化的单克隆抗体(mAb)可以通过各种技术产生，所述技术包括常规单克隆抗体方法，例如，本领域熟知的标准体细胞杂交技术。尽管优选体细胞杂交方法，但原则上可以采用其他产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化。举例来说，单克隆抗体可以对应于鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。

可以通过本发明的方法纯化的抗体的非限制性例子还包括：帕尼单抗、奥马珠单抗、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿克托单抗(actoxumab)、阿达木单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、阿拉赛珠单抗(alacizumab)、阿仑单抗、阿利库单抗、阿妥莫单抗、阿玛妥昔单抗(amatuximab)、安那莫单抗(anatumomab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿替努单抗(atinumab)、托珠单抗、巴西利单抗(basilizimab)、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、比西单抗、康纳单抗(canakinumab)、西妥昔单抗、达克珠单抗、登苏单抗(densumab)、依库丽单抗、依决洛单抗、依法珠单抗、依芬古单抗、厄马索单抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗、英夫利昔单抗、那他珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、度普利尤单抗(dupilumab)、萨瑞鲁单抗(sarilumab)或夫苏木单抗(fresolimumab)。

在某些方面，待纯化的蛋白质是酶。

可通过本发明的方法纯化的酶的非限制性例子包括：酸性α-葡糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶B)、酸性脂肪酶、溶酶体酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、α-半乳糖苷酶A、酸性β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神经氨酸酶、己糖胺酶A或己糖胺酶B。

可通过本发明的方法纯化的蛋白质的其他非限制性例子包括人促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(例如TNF-α、TNF-β或TNF-K)、干扰素α或干扰素β。

包含待纯化的蛋白质的溶液可以是培养基，优选澄清的培养基。包含待纯化的蛋白质的溶液是例如在灌注生物反应器或分批补料生物反应器中获得的培养基。

美国专利申请US 2014/255994、US 2015/232505、US 2015/183821和US 2017/218012以及国际申请WO 2014/137903(通过引用以其整体并入本文)中披露了灌注生物反应器或补料分批生物反应器的例子。

术语“澄清的培养基”意指从哺乳动物、细菌或酵母细胞培养物获得的基本上不含(例如，至少不含80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％)哺乳动物、细菌或酵母细胞的液体培养基。

在特定实施方案中，本发明方法的第一过滤步骤可以集成在用于在细胞培养物回收过程中获得澄清的培养基的澄清步骤中，所述过滤步骤因此成为澄清步骤的一部分。

如本文所用，短语“回收蛋白质”是指在使用所公开的纯化方法之后收集蛋白质。

在本发明的上下文中，表述“螯合剂”是指任何种类的颗粒状吸附介质或固定化配体，诸如活性炭、硅藻土、树脂珠，它们在纯化过程中用作吸收剂以从混合物中存在的污染物分子分离待纯化的目标分子。“螯合剂基质”的表述不包括蛋白A基质。

在本发明方法的某些实施方案中，所述至少一种螯合剂基质是颗粒状吸附介质。

所述至少一种螯合剂基质可以是柱、过滤器的形式或作为粉末添加至待纯化的产物中。在特定实施方案中，将本发明上下文中使用的至少一种螯合剂基质以粉末的形式添加到待纯化的产物中。

在所公开的方法的特定实施方案中，所述至少一种螯合剂基质是活性炭过滤器。在所公开的方法的其他特定实施方案中，所述至少一种螯合剂是树脂。

所述至少一种螯合剂基质、特别是活性炭过滤器或树脂介质与污染物相互作用，实现杂质的高效率去除。使用螯合剂基质特别是使用活性炭或树脂的另一个优点是对单克隆抗体的亲和力较低。

在本发明的特定实施方案中，所述过滤步骤中的所述至少一种螯合剂基质选自活性炭、硅藻土、自由阳离子交换树脂、自由阴离子交换树脂和自由混合模式树脂。在特定实施方案中，所述至少一种螯合剂基质是两种不同螯合剂基质的组合。在一更特定实施方案中，所述两种不同螯合剂基质的组合是活性炭、特别是活性炭过滤器和自由阴离子交换树脂的组合。

在所公开的方法的特定实施方案中，所述活性炭过滤器是Zeta Plus 35SP(由3M商业化)、Zeta Plus 53SP(由3M商业化)、Millisak CR40(由Millipore商业化)或ZetaPlus 55SP级(由3M商业化)。

在所公开的方法的另一个特定实施方案中，自由阴离子交换树脂是NH2-750F(由Tosoh商业化)或Emphaze AEX(由3M商业化)。树脂NH2-750F的特性总结如下。

在本发明的上下文中，“渗滤”的表述是指使用超滤膜从溶液完全去除、替换盐或溶剂或降低盐或溶剂的浓度的技术。

如本文所用，“超滤”或“UF”是指使用半渗透膜以基于粒径和UF膜中的孔径从溶液物理地且选择性地去除颗粒和/或离子的过滤技术。

在一个实施方案中，所述交换步骤的所述至少一层渗滤膜为单路切向流过滤(SPTFF)模块或切向流过滤(TFF)模块。在特定实施方案中，所述交换步骤的所述至少一层渗滤膜为盒、中空纤维或螺旋缠绕的形式。

在所公开的方法的特定实施方案中，所述交换步骤的至少一层渗滤膜是Ready ToProcess中空纤维盒30kDa(由GE商业化)。

在所公开的方法的特定实施方案中，所述交换步骤的至少一层渗滤膜是Cadence在线渗滤装置(由Pall商业化)。

在一个实施方案中，在所述交换步骤的至少一层渗滤膜之前或之后是Cadence在线浓缩装置(由Pall商业化)。

在所公开的方法的另一个特定实施方案中，所述交换步骤的至少一层渗滤膜是Pellicon盒(由Millipore商业化)或Sartocon盒(由Sartorius商业化)。

所述交换步骤有利地允许纯化和浓缩经过滤的蛋白质溶液。在本文中，表述“浓缩经过滤的蛋白质溶液”意指与经过滤的蛋白质溶液中的蛋白质浓度相比，部分纯化的渗余物中蛋白质的浓度增加。

在本发明的上下文中，“膜吸附器”是指带有官能团(诸如亲和基团和离子交换基团)的聚合物、特别是丙烯酸聚合物或者纤维或无纺布介质的平面层。树脂与膜之间的差异之一是流动分布：对于树脂是通过扩散，并且在膜中是通过对流。

在精细纯化步骤中使用的膜吸附器组合涉及使用至少两种在作用机制方面正交的膜吸附器。

在本发明的上下文中，表述“在作用机制方面正交的膜吸附器”意指所用的膜吸附器具有相反或不同的作用机制，诸如阳离子交换和阴离子交换相互作用、多模态和阴离子交换相互作用、阳离子交换和疏水相互作用、或阴离子交换和疏水相互作用，并且所述膜吸附器是单一的集成步骤，即其中像单一过滤步骤一样一起对其进行加工。

实际上，诸位发明人证明，使用这种膜吸附器组合能够捕获杂质，同时最大限度地减少对目的产物的吸附。

在优选实施方案中，其中在精细纯化步骤的膜吸附器组合中使用多于两个膜吸附器，即，至少一个另外的膜吸附器是总共三个、四个或多于四个膜吸附器，所述至少一个另外的膜吸附器是与在作用机制方面正交的两个膜吸附器相比具有不同作用机制的膜；所述总共多于两个膜吸附器仍被认为是集成的单一步骤。

作为非限制性例子，如果在作用机制方面正交的两个膜吸附器分别具有阳离子交换和阴离子交换相互作用，则所述至少一个另外的膜吸附器具有疏水相互作用或多模态相互作用。

在本发明的上下文中，膜吸附器被特别地组合为单一集成步骤。因此，大大减少了步骤和缓冲液的数量。还去除了调节和操纵，从而简化了全局过程。特别地，在膜吸附器组合的一个膜吸附器与这种膜吸附器组合的另一个(多个)膜吸附器之间没有洗脱、调节或储存步骤。

在特定实施方案中，精细纯化步骤的膜吸附器与操作条件(特别是pH、电导率和/或缓冲液)的特定组合是根据待纯化的蛋白质的特性(例如，pI、分子重量......)决定的。

如本领域技术人员将理解的，所述精细纯化步骤的最佳条件应允许获得目的蛋白质的最大产率，即应允许目的蛋白质与膜吸附器组合进行最低相互作用，同时允许最大限度地去除污染物，即在膜吸附器组合的膜吸附器之间没有任何调节或洗脱步骤的情况下，同时允许污染物与膜吸附器组合进行最高相互作用。

图3举例说明了确定用于精细纯化步骤的两种膜吸附器的最佳组合的例子。在所述例子中，使用Sartobind S和Sartobind STIC膜吸附器的组合获得了最佳纯化性能，其中具有更高的污染物清除率(较低的HCP和HMW)，同时最大限度地提高了抗体产率。此图还示出了进样量对产率和污染物去除率的影响。

在本发明的上下文中，为了确定这些最佳条件，应将膜吸附器组合的膜吸附器视为单个实体或单一集成步骤，即像单个过滤步骤一样一起对其进行加工。例如，在两个膜吸附器的情况下，尽管确定使用两个膜吸附器时的最佳条件的常规方法涉及确定第一膜吸附器上的最佳条件，然后确定第二膜吸附器上的最佳条件，然后在两个最佳条件之间调节产物(诸如pH调节、电导率调节或缓冲液调节)，但在本发明的上下文中，这两个膜吸附器仅被认为是一个，并且应针对这两个膜吸附器的分离性能确定折中方案，使得仍然能够获得良好的纯化。

通常，在确定用于纯化给定蛋白质的优化的缓冲液时，可以用中性缓冲液进行交换步骤，并且可以手动调节包含渗余物的溶液的pH和电导率，以确定精细纯化步骤中的最佳纯化条件。在确定最佳条件时，可以使用适合于交换步骤的缓冲液再次执行所述过程，所述缓冲液将对应于精细纯化步骤中使用的平衡缓冲液。

图4举例说明了根据用于精细纯化步骤的两个膜吸附器和目的蛋白质的pI的组合确定最佳缓冲液(诸如缓冲液的电导率或pH)的例子。在该例子中，使得能够实现有利纯化(对应于在50ng/ml与500ng/ml之间的HCP水平)的pH和电导率条件对应于每个图的黑色区域。

在本发明的上下文中，用于平衡所述至少两个膜吸附器的一种缓冲液与用于交换步骤的缓冲液相同。它允许待纯化的蛋白质直接流穿，以最大限度地提高产率，同时保留大多数污染物。

在特定实施方案中，通过改变交换步骤中用来调节蛋白质的缓冲液的pH和电导率来优化所述精细纯化步骤。

在特定实施方案中，所述精细纯化步骤包括与阴离子交换膜吸附器基质结合使用阳离子交换膜吸附器基质。在其他实施方案中，所述精细纯化步骤包括与阴离子交换膜吸附器基质结合使用多模态(混合模式)膜吸附器基质。

膜吸附器基质的组合，特别是阳离子交换膜吸附器和阴离子交换膜吸附器的组合，通过膜吸附器和污染物之间的相互作用而起作用，从而高效去除杂质。与污染物的相互作用归因于若干种机制：离子相互作用、疏水相互作用、范德华相互作用和氢键相互作用。

在特定实施方案中，所述阳离子交换膜吸附器是Sartobind S膜吸附器(Sartorius)、HD-C膜吸附器(Natrix)。在特定实施方案中，所述阳离子交换膜吸附器是Sartobind S膜吸附器(Sartorius)。在特定实施方案中，所述阴离子交换膜吸附器是Sartobind STIC膜吸附器(Sartorius)、Sartobind Q膜吸附器(Sartorius)、或HD-Q膜吸附器(Natrix)。在特定实施方案中，所述阴离子交换膜吸附器是Sartobind STIC膜吸附器(Sartorius)或Sartobind Q膜吸附器(Sartorius)。在其他实施方案中，所述多模态膜吸附器是HD-Sb膜吸附器(Natrix)。在其他实施方案中，所述疏水相互作用膜吸附器是Sartobind苯基膜吸附器(Sartorius)。

在一特定实施方案中，膜吸附器组合是Sartobind S膜吸附器(Sartorius)和Sartobind STIC膜吸附器(Sartorius)的组合。

以下总结了在本发明方法的精细纯化步骤中使用膜吸附器而不是柱的主要优点：

-在相当的规模下，膜吸附器可以以高于柱10倍的流速使用，从而大大缩短了过程的持续时间。例如，装有树脂的5mL柱将以1ml/min的流速使用，而相应的5mL膜吸附器将以最低10ml/min的流速使用。因此，当在2小时30分钟内使用两个装有树脂的柱进行使用用于精细纯化的两个色谱法步骤的经典过程时，所述经典过程可使用膜吸附器在不到15min的时间内完成。

-尽管膜吸附器可重复使用，但其是一次性装置，因此可以将其在一次批处理之后丢弃，并且不需要长期储存。因此，没有必要对其进行测试以确保长期稳定性。

-使用膜吸附器通过避免柱成本、柱填充和柱储存而具有更低成本。

在特定实施方案中，当膜吸附器组合是Sartobind S膜吸附器(Sartorius)和Startobind STIC膜吸附器(Sartorius)的组合时，所述一种缓冲液的pH和电导率在图4上方图中黑色区域中公开的范围内。

在另一个特定实施方案中，当膜吸附器组合是Sartobind S膜吸附器(Sartorius)和Startobind Q膜吸附器(Sartorius)的组合时，所述一种缓冲液的pH和电导率在图4下方图中黑色区域中公开的范围内。

根据本发明的纯化方法是完全流穿纯化方法。

在本文中，“完全流穿纯化方法”意指所述方法的不同纯化步骤都意味着在使目的蛋白质通过纯化步骤的同时仅结合杂质。

在一个实施方案中，根据本发明的方法不包括在过滤步骤结束时调节经过滤的蛋白质溶液的pH和/或在交换步骤结束时调节渗余物的pH。

在特定实施方案中，在过滤步骤结束时获得的经过滤的蛋白质溶液直接通过渗滤膜。更具体地，随后没有在两个步骤之间进行处理(诸如pH调节、缓冲液更换或稀释)。在这种方法中，渗滤膜可以例如对应于例如在Cadence在线浓缩装置之前或之后的Ready ToProcess 30kD中空纤维模块或Cadence在线渗滤模块。另外，在特定实施方案中，在交换步骤结束时获得的渗余物直接通过精细纯化步骤的膜吸附器组合。更具体地，随后没有在两个步骤之间进行处理(诸如pH调节、缓冲液更换或稀释)。在这种方法中，渗滤膜可以例如对应于Ready To Process 30kD中空纤维模块和/或膜吸附器组合可以例如对应于SartobindS膜吸附器和Sartobind STIC膜吸附器的组合。

在这种方法中，完全不存在需要手动干预和打开纯化系统的步骤间处理(例如，稀释、电导率调节和pH调节)。

因此，本发明的方法可以在灵活的自动化色谱系统中执行，所述自动化色谱系统包括多个泵和传感器，以及用于依次或连续操作3个纯化步骤的互连阀和切换阀。

多操作系统的非限制性例子是具有适当适应性的多柱色谱系统(MCCS)。

本发明的方法可以以连续的方式运行。换句话说，本发明的方法可以是从溶液纯化蛋白质的连续方法。

术语“连续方法”或“连续方式的方法”意指将流体连续馈送通过系统的至少一部分的方法。

在本文中，术语“流体”是指任何液体，诸如含有待纯化的蛋白质的溶液、缓冲液或用于病毒灭活的低pH或酸性pH溶液。

在特定实施方案中，第一、第二和第三纯化步骤被连续馈送流体。

术语“集成过程”意指使用结构元件执行的过程，所述结构元件协作地起作用以实现特定结果(例如，从液体培养基生成纯化的蛋白质)。

此外，本发明的方法可以在封闭系统中从所述方法的第一步到最后一步运行。换句话说，本发明的方法优选具有功能上封闭的流路。特别地，三个纯化步骤和任选的一个或多个过滤步骤(例如，纳米过滤步骤和/或最终超滤和/或渗滤步骤)可以在封闭系统中进行。在本发明方法的特定实施方案中，使包含蛋白质的溶液逐个部分地通过三个纯化步骤，溶液的一部分的每次通过对应于一次运行。然后收集并合并每次运行结束时回收的蛋白质。在这种方法中，纯化步骤的膜吸附器被多次使用，并且任选地使用例如如上所述的消毒缓冲液进行消毒，从而能够减小膜吸附器装置和所需缓冲液的体积。举例来说，可以连续执行一系列的3至50次运行(例如3至30次运行、5至25次运行、10至20次运行或15次运行)。更具体地，可以以连续的方式进行3、4、5、6、7或8次运行，然后将膜吸附器消毒(例如，使用消毒缓冲液)。这可以重复例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次，如图2所示。

本文公开的方法可用于回收纯化的蛋白质。如本文所用，“纯化的”是指允许在体外、离体或体内有效使用蛋白质的纯度。为了使蛋白质有效用于体外、离体或体内应用中，蛋白质应基本上不含污染物、其他蛋白质和/或可能会干扰所述蛋白质在此类应用中的使用的化学物质，或至少不希望包含在目的蛋白质中的化学物质。此类应用包括治疗组合物的制备、在治疗组合物中给予蛋白质、以及本文公开的其他方法。优选地，如本文所提及的，“纯化的”蛋白质是这样的蛋白质，其可以通过任何方法(即，通过从天然来源直接纯化、重组或合成)产生并且已经从其他蛋白质组分纯化，使得所述蛋白质在给定组合物中占总蛋白质的至少约70％重量/重量，并且更优选地在给定组合物中占总蛋白质的至少约80％或至少约85％、并且更优选地至少约90％、并且更优选地至少约91％、并且更优选至少约92％、并且更优选的至少约93％、并且更优选地至少约94％、并且更优选地至少约95％、并且更优选地至少约96％、并且更优选地至少约97％、并且更优选地至少约98％、并且更优选地至少约99％重量/重量。

在特定实施方案中，本发明的方法包括：

(a)过滤步骤，其包括：

(i)使所述溶液以所述流穿方式通过所述至少一种螯合剂基质，

(ii)从所述至少一种螯合剂基质的流穿物回收经过滤的蛋白质溶液，

(b)交换步骤，其包括：

(i)使从步骤(a)得到的所述经过滤的蛋白质溶液和所述一种缓冲液通过所述至少一层渗滤膜，

(ii)回收所述至少一层渗滤膜的含部分纯化的蛋白质的渗余物；

以及

(c)精细纯化步骤，其包括：

(i)使平衡缓冲液通过所述膜吸附器组合，其中所述平衡缓冲液与步骤(b)中用于交换的所述一种缓冲液相同，

(ii)使从步骤(b)获得的渗余物以所述流穿方式通过所述膜吸附器组合，

(iii)从所述膜吸附器组合的流穿物回收纯化的蛋白质，

其中所述纯化方法不包括蛋白A色谱法，

其中所述一种缓冲液包含以下项或由以下项组成：

-5mM至40mM(例如20mM)Bis Tris和15mM至150mM(例如75mM)NaCl，用乙酸将pH调节至6-9(例如7.5)，

-5mM至40mM(例如20mM)Tris或Tris-HCl、15mM至150mM(例如75mM)NaCl，用乙酸将pH调节至6-9(例如7.5)，

-5mM至40mM(例如20mM)Tris或Tris-HCl、15mM至150mM(例如75mM)NaCl，用柠檬酸将pH调节至6-9(例如7.5)，或

-15mM至150mM(例如75mM)NaCl，用

从溶液纯化蛋白质的方法可包括精细纯化步骤之后的至少一个另外的最终过滤步骤，诸如纳米过滤步骤、超滤步骤和/或渗滤步骤。在纯化用于药物目的的重组蛋白时，通常在精细纯化步骤之后进行另外的最终过滤步骤。因此，本发明的方法可进一步包括在步骤(c)之后的纳米过滤步骤。在纳米过滤步骤之后，可进一步进行超滤和渗滤步骤。如本文所用，“超滤”或“UF”是指使用半渗透膜以基于粒径和UF膜中的孔径从溶液物理地且选择性地去除颗粒和/或离子的过滤技术。如本文所用，“纳米过滤”是指通过用于去除例如病毒颗粒的纳米过滤器过滤溶液。如本文所用，“渗滤”是指使用超滤膜从溶液完全去除、替换盐或溶剂或降低盐或溶剂的浓度的技术。

本发明的方法还可以进一步包括至少一个病毒灭活步骤。所述至少一个病毒灭活步骤可以在本发明方法的任何阶段进行，例如在步骤(a)之前、步骤(a)之后、步骤(b)之后、步骤(c)之后、在纳米过滤步骤之后和/或在超滤和/或渗滤步骤之后进行。这种病毒灭活步骤通常可以是低pH或酸性pH灭活步骤。如本文所用，“低pH或酸性pH灭活”是指使用酸性pH使病毒特别是包膜病毒变性的病毒灭活技术。通常，低pH或酸性pH灭活步骤是通过在约3.0与5.0之间(例如，在约3.5与约4.5之间、在约3.5与约4.25之间、在约3.5与约4.0之间，例如4.0)的pH下培养回收的蛋白质至少15分钟的时间段(例如，在15分钟与1小时之间的时间段、在约30分钟与2小时之间的时间段、或在约45分钟与2小时之间的时间段)进行的。例如，低pH或酸性pH灭活步骤是通过在pH为4的情况下培养回收的蛋白质持续例如30分钟至2小时进行的。

在步骤(a)之前，本发明的方法还可以包括提供一种液体培养基的步骤，所述液体培养基含有已进行澄清以去除细胞并且基本上不含细胞的待纯化的蛋白质，其中将所述液体培养基馈送经过所述至少一种螯合剂基质。

例如，用于从溶液纯化蛋白质的本发明的方法可包括：

(a前)提供一种液体培养基的步骤，所述液体培养基含有已进行澄清以去除细胞并且基本上不含细胞的待纯化的蛋白质，

(a)过滤步骤，其包括：

-使步骤(a前)的所述液体培养基以流穿方式通过至少一种螯合剂基质；

-从所述至少一种螯合剂基质的流穿物回收经过滤的蛋白质溶液；

(b)交换步骤，其包括：

-使用用于所述交换的仅一种缓冲液使在步骤(a)结束时获得的所述经过滤的蛋白质溶液通过至少一层渗滤膜；

-回收所述至少一层渗滤膜的含部分纯化的蛋白质的渗余物；以及

(c)精细纯化步骤，其包括：

-使在步骤(b)结束时获得的所述渗余物以所述流穿方式通过膜吸附器组合，其中所述膜吸附器组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的，并且所述膜吸附器组合已预先用与步骤(b)中用于交换的所述一种缓冲液相同的平衡缓冲液进行平衡；

-从所述膜吸附器组合的流穿物回收纯化的蛋白质；

其中所述纯化方法不包括蛋白A色谱法步骤。

最后，可以将纯化的蛋白质配制成适合于储存的组合物、和/或配制成特别适合于给予动物和/或人类的药物组合物。

所公开的方法的诸多优点之一是它允许获得高产率的高纯度蛋白质。举例来说，用本发明的方法回收的纯化的蛋白质可以展现出至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％或99.9％的纯度。更特别地，所公开的方法的诸多优点之一是它允许获得含有减少量的污染性DNA、高分子量(HMW)物质(其对应于蛋白质聚集体)和/或宿主细胞蛋白质(HCP)的高纯度蛋白质溶液。举例来说，包含用本发明的方法回收的纯化的蛋白质的溶液可以展现出小于0.4ppb、小于0.3ppb、小于0.2ppb或小于0.1ppb的污染性DNA的量。举例来说，包含用本发明的方法回收的纯化的蛋白质的溶液还可以展现出小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％的HMW物质的浓度。举例来说，包含用本发明的方法回收的纯化的蛋白质的溶液还可以展现出小于500ng/ml、小于100ng/ml、小于90ng/ml、小于85ng/ml、小于80ng/ml、小于75ng/ml或小于70ng/ml的HCP浓度。另外，本发明的方法可以允许以至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的产率回收纯化的蛋白质。

本发明进一步涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含以下项或由以下项组成：

(a)至少一种螯合剂基质、至少一层渗滤膜和膜吸附器组合，其中所述膜吸附器组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的；和

(b)一种缓冲液，其包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸盐和/或柠檬酸，特别是包含以下项或由以下项组成：(i)Bis Tris、Tris或Tris-HCl，(ii)乙酸，(iii)水和(iv)任选的NaCl；和/或制备一种缓冲液的说明书，所述一种缓冲液包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸盐和/或柠檬酸，特别是包含以下项或由以下项组成：(i)Bis Tris、Tris或Tris-HCl，(ii)乙酸，(iii)水和(iv)任选的NaCl。

下面将通过附图和实施例进一步对本发明进行说明。

附图说明

图1示出了表示本发明的3步式完全流穿方法的方案。

图2示出了表示如实施例4中使用的本发明的3步式完全流穿方法的连续形式的方案。

图3示出了表示比较根据膜的容量(mg/ml)使用4种膜吸附器组合(HD-C+HD-Q；HD-Sb+HD-Q；Sartobind S+Q；Sartobind S+STIC)得到的产率(％)、HMW(％)和HCP(ng/ml)的直方图。

图4示出了根据平衡缓冲液的pH和电导率(mS/cm)的两种膜吸附器组合的最佳点图(上图：Sartobind S+STIC；下图：Sartobind S+Q)和待纯化的蛋白质的3种pI(6；7.5和9)。能够获得有利纯化(对应于50与500ng/ml之间的HCP水平)的pH和电导率条件对应于每个图的黑色区域。

图5示出了在连续实验室规模过程实验期间在膜上进行纯化的部分色谱图(紫外线280nm)。

实施例

使用本发明的方法对人源化单克隆抗体mAb1进行实验室规模的分批纯化。

本实验示出了三个步骤之后以实验室规模获得的杂质去除结果。目的是去除聚集体(HMW)和宿主细胞蛋白质(HCP)，HMW低于1％且HCP低于500ng/ml。

诸位发明人使用2种不同的螯合剂、一个交换步骤和一对膜(Sartobind S和STIC或Sartobind S和Q)成功达到了目的。

实施例2：根据本发明的实验室规模过程

使用本发明的方法对人源化单克隆抗体mAb2进行实验室规模的分批纯化。

所述实验示出了三个步骤之后以实验室规模获得的杂质去除结果。目的是去除聚集体(HMW)和宿主细胞蛋白质(HCP)，HMW低于1％且HCP低于500ng/ml。诸位发明人使用2种螯合剂、一个交换步骤和一对膜(Sartobind S和STIC或Sartobind S和Q)成功达到了目的。在进样条件设置为pH 8.5和3ms/cm的情况下，用Sartobind S+STIC对获得了最佳结果。

实施例3：根据本发明的中试规模过程

使用本发明的方法对mAb1进行中试规模分批纯化。

将与实施例2中公开的过程相同的过程以中试规模扩大。目的是通过这三个步骤和随后的纳米过滤步骤纯化10g。

通过本发明方法的三个步骤和纳米过滤纯化8L澄清的细胞培养物上清液。将8L引入20L混合器中，并连续引入以下项：250ml Tosoh NH

在开始交换步骤之前，过滤产物(Filtrox过滤器)。过滤后回收大约9L产物(用1L的无菌水将产物推出到过滤器之外)。在GE Uniflux上使用中空纤维(790cm2-50KD–Spectrumlabs)进行UF/DF。用于通过中空纤维对产物进行渗滤的缓冲液是20mM Bis Tris缓冲液(用适量乙酸调节至pH 7.2)。

以6.9g/L回收2.64kg(18.2g单克隆抗体)。然后推动2L(14g)的回收产物通过两个膜吸附器：75ml Sartobind S和200ml Sartobind Q。将两层膜串联连接，并使用GEAktaProcess以流穿方式使用。

最后，使产物通过预滤器(XOHC–Millipore)和Viresolve Pro过滤器(Millipore)进行纳米过滤，以得到最终的质量。

下表示出了常规过程与本发明方法之间的比较。

实施例4：根据本发明的完全连续的实验室规模过程

使用本发明的方法以连续方式对人源化单克隆抗体mAb1进行实验室规模的分批纯化。

所述实验的目的是使用连续方式从澄清的大批量收获物纯化mAb1，这意味着每个步骤之间没有中断、储存或调节。诸位发明人使用在螯合剂(固定化AEX，活性炭CA)上过滤、一个交换步骤(单程渗滤)和一对膜(Sartobind S和STIC)成功达到了目的。

通过本发明方法的三个步骤纯化3L澄清的细胞培养物上清液。将产物通过固定化阴离子交换剂(Emphaze AEX BV120)和随后的活性炭过滤器(Millipore CR40 270cm2)进行过滤。然后使产物直接流入单程渗滤膜(0.2m2)中进行浓缩和渗滤(交换步骤)。用于渗滤产物的缓冲液是20mM Bis Tris、20mM NaCl缓冲液(用适量乙酸调节至pH 7.5)。

使从渗余物侧直接回收的渗滤的产物通过中间缓冲袋，以适应后续步骤中的流动差异。然后进一步推动产物通过两个精细纯化膜吸附器；1ml Sartobind S和1mlSartobind STIC。将这两层膜串联连接，并使用GE Akta Pure以流穿方式使用。每个单元步骤与另一个直接连接或通过缓冲袋连接，并且连续加工。

在膜吸附器上进行了多次纯化循环，以加工整个体积的产物，如图5所示(在膜上进行的50次纯化循环的提取物)。在所述过程结束时，通过无菌过滤器回收整个产物池。每5分钟纯化40mg的mAb，达到了每小时每升膜240g mAb1的生产力(240g/L/h)。