蛋白水解靶向病毒、其活疫苗及其制备方法和用途
文献发布时间：2023-06-19 09:26:02
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种蛋白水解靶向病毒以及用途。本发明还提供了所述病毒的制备方法。
背景技术
流感是由流感病毒所引起的一种急性呼吸道传播疾病，可季节性地感染禽类、哺乳动物和人类。流感病毒又可分为A、B、C三种类型，其中以A型(又称甲型)流感病毒的暴发最为频繁。甲型流感病毒属于正黏病毒科，其基因组共由8个独立的单链RNA片段组成，编码10种蛋白：血凝素蛋白(HA)；基质蛋白(M)，其分为M1和M2；神经氨酸酶(NA)；核壳蛋白(NP)；非结构蛋白(NS)，包括NS1和NEP；以及PB1、PB2和PA三种聚合酶。每种蛋白对于流感病毒都具有重要的生物学功能。甲型流感病毒根据其主要表面抗原HA和NA的抗原性的差异分为不同亚型。目前已发现了18种亚型的HA蛋白和11种亚型的NA蛋白。A型流感病毒大规模流行可引起极高的发病率和死亡率，严重威胁着人类的健康(W.H.O.2003；Coleman 2007)。A型流感病毒在二十世纪主要引起了三次大型流感，即1918年的H1N1，1957年的H2N2以及1968年的H3N2，共造成约5000万人死亡(Kilbourne 2006；Taubenberger，Hultin et al.2007)。2009年甲型流感也是由H1N1流感病毒引起(Dawood，Jain et al.2009；Zimmer and Burke2009)，其传播之迅速，引起了世界的关注。据统计，全世界平均每年有30-50万人死于流感(Fiore，Shay et al.2007)。
自流感发现以来，科学家们一直致力于对于流感病毒的防控。接种疫苗是目前最有利于预防流感、控制流感传播的手段。20世纪30年代末，流感病毒疫苗开始在人类中使用。目前的流感病毒疫苗分为以下几种：灭活病毒疫苗、减毒病毒疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗和类病毒颗粒疫苗。
目前应用的灭活流感疫苗为三价疫苗，包括H1N1、H3N2和B型流感病毒疫苗。多年的临床应用表明，流感灭活疫苗具有很好的免疫效果和安全性，接种后可刺激机体产生相应的抗体，但缺点是不能刺激产生分泌型免疫球蛋白(sIgA)。另外，流感病毒在鸡胚上传代会发生抗原变异，且大部分鸡体内携带有多种病毒，疫苗有被这些病毒污染的可能。由于新流行的抗原变异株必须要能在鸡胚中高效复制，才有可能生产大量疫苗。随着制备疫苗所用的野生型病毒在鸡蛋中生长，其免疫原性在一定程度上被改变或降低。如果生产的疫苗株与当前流行株不匹配，就会失去免疫保护效果。近年来，一个重大进展就是利用哺乳动物细胞代替鸡胚培养。哺乳动物细胞主要是MDCK细胞和Vero细胞，具有无外源因子污染、易于规模化生产、抗原稳定等优点。哺乳动物细胞培养的流感疫苗具有较好的免疫原性，接种后不良反应轻，较安全。研究阶段取得了很好的实验结果。但还有一些问题未能解决，临床尚未见到使用。
减毒活疫苗主要包括温度敏感型疫苗、重配疫苗、冷适应减毒流感活疫苗、反向遗传技术疫苗和复制缺陷流感疫苗5种类型。现在研制成功的是冷适应减毒流感活疫苗。该疫苗是一种降低了毒力并能在最佳适应温度下生长的流感病毒株。这种病毒只能在25℃左右复制，不能在37℃下传代，因此其感染只局限于上呼吸道，临床上无明显的流感症状。利用弱毒株与当前的流行毒株进行基因重组，得到带有弱毒株片段和流行株的HA和NA基因的重组病毒。多项研究证实，冷适应毒株生物学性质有很好的稳定性。弱毒流感疫苗与灭活疫苗的免疫后抗体阳转率都在50％～70％，能有效控制流感的流行。冷适应减毒活疫苗已在俄罗斯使用，美国也将被批准使用。其在接种途径、免疫效果方面比灭活疫苗有一定的优势，如可通过鼻内喷雾或者点滴方式来免疫。冷适应减毒活疫苗在上呼吸道复制，可诱导黏膜的sIgA和全身的体液及细胞免疫反应，产生比灭活疫苗更广泛更持久的保护。但冷适应减毒活疫苗可与其他流感病毒发生基因重配后得到有毒的重配株病毒，并且在二价或三价冷适应减毒活疫苗中可能会出现干扰现象。
理想的疫苗应具备下列条件：①免疫原性强，②毒性反应小，③遗传学上稳定④在流行期能快速获得与流行株一致的抗原性。鉴于活疫苗相对于灭活疫苗的优势及活疫苗的安全考虑，使用哺乳动物细胞生产复制可控、遗传稳定、安全有效的新型流感病毒活疫苗，提高疫苗的安全性和有效性，将会促进流感疫苗快速发展。
泛素-蛋白酶体系统
蛋白的降解对于维持正常的细胞功能(例如增殖、分化、死亡)至关重要。真核细胞内蛋白的降解主要有溶酶体途径、特殊细胞器的水解系统、细胞膜表面水解系统、Caspase蛋白酶系统和高度保守的泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)。泛素-蛋白酶体途径是细胞质和细胞核内依赖于ATP、非溶酶体途径的蛋白质降解通路，高效并高度选择性地降解细胞在应激和非应激条件下产生的蛋白质，尤其是半衰期短的功能蛋白、癌基因产物和变性、变构的蛋白等，应激状态下也可降解细胞内的结构蛋白。该蛋白水解通路的发现被认为是细胞周期、细胞恶化转化研究的转折点，是十分重要的细胞功能调节因素。
泛素-蛋白酶体系统由泛素(ubiquitin)、泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzymes(E1))、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme(E2))、泛素蛋白连接酶(unbiquitin-protein ligases(E3))以及蛋白酶体(proteasome)组成。泛素是一种高度保守的、由76个氨基酸组成的小分子蛋白质，分子量为8.45k。从细胞核到细胞质，从生殖细胞到各种体细胞都有广泛的分布，在增殖活跃的肿瘤细胞和胚胎细胞中高表达。泛素C末端的甘氨酸(Gly)羧基在泛素连接酶的协助下，与需降解的靶蛋白的赖氨酸(Lys)α或ε氨基结合并形成多泛素链，以便于靶蛋白被蛋白水解酶复合体识别和水解。泛素活化酶(E1)催化泛素与蛋白底物结合。当泛素途径被启动后，在ATP参与下，泛素的甘氨酸残基的C端与泛素结合酶(E2)的活化位点半胱氨酸(Cys)连接，继而使泛素被活化。泛素结合酶(E2)在泛素被活化后，活化的泛素转移到泛素结合酶的活化位点半胱氨酸残基上。泛素蛋白连接酶(E3)在决定泛素介导的底物蛋白降解的选择性方面具有重要作用。E3对酶底物具有亲和力并需要与E2连接将泛素从E2转移到靶蛋白。在泛素与酶底物结合后，通常会形成一个多聚泛素链。在该链中，每个泛素单体的C端都与前面泛素的特定赖氨酸残基连接起来。蛋白酶体是催化泛素与底物蛋白偶联体降解的关键酶，包括20S蛋白酶体和26S蛋白酶体。20S的α亚基主要用于底物识别，而β亚基主要用于进行底物降解。26S蛋白酶体的作用可能与产生游离肽、游离泛素或可重复利用的泛素有关。因此，泛素-蛋白酶体系统的作用由连续的两步组成：(1)泛素分子与靶蛋白的共价结合；(2)多聚泛素化的蛋白被26S蛋白水解酶复合体(proteasome)降解，同时泛素被重新活化。此过程需要E1、E2和E3三种酶的协助才能实现，它贯穿于整个细胞的质膜系统，包括细胞膜、内质网到核膜等。泛素-蛋白酶体途径是真核细胞内重要的蛋白质调控系统，参与调节细胞周期进程、细胞增殖与分化以及信传导等多种细胞生理过程，因此，细胞内的蛋白泛素化降解是蛋白质重要的转录后修饰方式。
简言之，生物体内的细胞一直努力维持适当的蛋白水平，每一刻它们都在生成和降解成千上万种蛋白。维持蛋白平衡的关键因子是一个称为泛素(ubiquitin)的小蛋白。当它被链接到蛋白上后，它会导致这些蛋白被运送到蛋白酶体中进行降解。利用这一原理，研究人员开发了基于蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis-Targeting Chimeras，PROTACs)技术的蛋白降解剂。即研究人员设计出一种具有两个活性端的小分子，一个活性端可以与靶向的蛋白相结合，而另一个活性端可以与称为E3泛素连接酶(E3ubiquitin ligase)的蛋白相结合。这种双功能小分子能够强迫泛素与靶向蛋白相结合，将它们运送到细胞的垃圾处理站中。在蛋白被降解后它们可以继续靶向其它蛋白，从而迅速降低不需要的蛋白的水平。
但是，当前并没有将该技术用于病毒改造的报道。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明提供了一种蛋白水解靶向病毒，所述病毒包含能被泛素-蛋白酶体系统识别的分子和连接链(linker)。本发明还提供了所述病毒的制备方法以及所述病毒的用途。
在本申请中，术语“蛋白水解靶向分子(Proteolysis-Targeting molecules)”是指能被泛素-蛋白酶体系统识别的多肽、氨基酸序列、蛋白或者其他分子的各种分子。申请人发现，将所述蛋白水解靶向分子的编码核苷酸序列引入到病毒的基因组中，该蛋白水解靶向分子可以随着病毒基因组的复制而复制，并且可以随着病毒蛋白的翻译而融合表达于病毒蛋白中，从而得到被蛋白水解靶向分子定点修饰的病毒，即蛋白水解靶向病毒，Proteolysis-Targeting chimeric virus(PROTAC virus，PROTAC病毒)。
由于泛素-蛋白酶体系统广泛存在于宿主细胞中，为了避免PROTAC病毒在制备过程中被细胞内的泛素-蛋白酶体系统降解导致生产效率降低，发明人在病毒蛋白与蛋白水解靶向分子之间引入了可以被选择性切割的连接链(linker)，该连接链可以在特定的人工改造的细胞系中被切割，从而将病毒蛋白与蛋白水解靶向分子分离，病毒蛋白不会被泛素-蛋白酶体系统降解而得以保留，因此PROTAC病毒可以在该特定的人工改造的细胞系中高效复制、大量生产制备。而在正常的细胞中，泛素-蛋白酶体体系统会识别与病毒蛋白融合的蛋白水解靶向分子，从而降解病毒蛋白，病毒的复制能力被减弱甚至完全失去复制能力，因此，PROTAC病毒具有很高的安全性。此外，PROTAC病毒还可以进一步被修饰，例如引入一些免疫增强剂到病毒蛋白的特定区域或者特定氨基酸，从而得到性能改善的病毒，而得到免疫原性增强的PROTAC病毒。
本发明的另一个目的是在流感病毒基因组中引入了可被条件性切割的蛋白水解靶向分子的编码核苷酸序列，使得流感病毒只有在能够将蛋白水解靶向分子切掉或者失活的特定的病毒生产体系中才可以复制。利用流感病毒对该特定病毒生产体系的依赖，可以在该系统中进行流感病毒的大量制备，由于人体和动物等的正常细胞中存在泛素-蛋白酶体途径，可以识别与病毒蛋白融合表达的蛋白水解靶向分子，从而将病毒蛋白降解，因此制备出来的流感病毒在动物和人体中不能进行复制繁殖，增加了病毒的安全性，从而使得该流感病毒成了名副其实的流感病毒活疫苗。此外，动物和人体等的泛素-蛋白酶体系统可以识别多种蛋白水解靶向分子，因此可以在病毒蛋白中引入不同种类、不同数量的蛋白水解靶向分子；而可以被选择性切割的连接链(linker)也有多种，因此可以引入不同种类、不同数量的连接链来实现蛋白水解靶向分子的选择性切割；这些不同种类和数量的蛋白水解靶向分子和连接链可以进行任意组合，可以为制备不同复制效率、不同减毒程度的病毒疫苗提供保证，这对于流感病毒疫苗的生产效率和免疫原性至关重要。
该蛋白水解靶向病毒的原理在于：(1)引入到病毒蛋白特定位点的蛋白水解靶向分子可以被正常宿主细胞中的泛素-蛋白酶体系统识别，从而将相关的病毒蛋白降解、失活；(2)引入到病毒蛋白特定位点的蛋白水解靶向分子可以在特定的病毒生产系统中被抑制，或者通过连接链被选择性地切割，而与病毒蛋白分离，从而避免或减少病毒蛋白被泛素-蛋白酶体途径降解。(3)引入到病毒蛋白特定位点的蛋白水解靶向分子在正常宿主细胞中不能被抑制，或者链接蛋白水解靶向分子与病毒蛋白的连接链在正常宿主细胞中不能被切割。因此制备出来的病毒在动物和人体等的宿主细胞中可以被泛素-蛋白酶体途径识别、降解，而复制能力降低甚至完全失去复制繁殖能力，增加了病毒的安全性。
一方面，本发明提供了一种蛋白水解靶向病毒，所述病毒在其一个或多个不同的病毒蛋白的位点包含一个或多个能被泛素-蛋白酶体系统识别的蛋白水解靶向分子；并且所述病毒蛋白和蛋白水解靶向分子之间通过一个或多个连接链连接；其中，所述连接链能够被选择性切割。
优选地，所述位点为的蛋白的C端和/或N端，即所述病毒的基因片段的C端和/或N端。
根据本发明所述的蛋白水解靶向病毒。其中所述多个蛋白水解靶向分子，可以是相同的蛋白水解靶向分子，也可以是不同的蛋白水解靶向分子的组合；所述多个连接链可以是相同的连接链，也可以是不同的连接链的组合。
优选地，所述蛋白水解靶向分子选自如SEQ ID NO:1-110中任一项所示的氨基酸序列：
优选地，所述连接链选自任意的可以被选择性切割的分子，优选氨基酸序列，如可被烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEVp)选择性切割的分子；对凝血酶敏感的可切割分子(酶切位点为LVPR
更优选地，所述连接链为任意可以被TEVp识别并切割的序列E-X
优选地，所述蛋白水解靶向分子和连接链之间还包含柔性接头；
更优选地，所述蛋白水解靶向分子、连接链和柔性接头具有如下连接方式：
柔性接头-连接链-柔性接头-蛋白水解靶向分子；
进一步优选地，所述柔性接头-连接链-柔性接头-蛋白水解靶向分子选自如SEQID NO:138-149、167和168中任一项所示的氨基酸序列。
优选地，所述病毒选自流感病毒、艾滋病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、丙肝病毒HCV、乙肝病毒HBV、甲肝病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒HPV、单纯疱疹病毒HSV、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、水泡性口炎病毒、呼吸道合胞病毒RSV、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、寨卡病毒Zika、SARS、中东呼吸综合征病毒、轮状病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、汉坦病毒、新型肠道病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、蓝耳病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、细小病毒、朊病毒、天花病毒、烟草花叶病毒、腺相关病毒、噬菌体、疱疹病毒、西尼罗河病毒、诺如病毒(Norovirus)、人博卡病毒、冠状病毒和新冠病毒SARS-CoV-2；更优选地，所述病毒为流感病毒或新冠病毒SARS-CoV-2；。
优选地，所述病毒为经修饰的病毒，其经过修饰或者包含数个插入修饰的组合。
根据本发明的具体的实施例，提供了一种蛋白水解靶向流感病毒(PROTAC流感病毒)，所述流感病毒在其一个或多个不同的病毒蛋白的位点包含一个或多个能被泛素-蛋白酶体系统识别的蛋白水解靶向分子；并且所述病毒蛋白和蛋白水解靶向分子之间通过连接链连接；其中，所述连接链为E-X
优选地，在流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、M1、M2、NS1、NEP蛋白的一个或多个中包含蛋白水解靶向分子和连接链；即在流感病毒基因组的PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、M1、M2、NS1、NEP基因片段的一个或多个中包含编码蛋白水解靶向分子和连接链的核苷酸序列，即所述蛋白水解靶向分子和连接链定点修饰到流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、M1、M2、NS1、NEP蛋白的一个或多个的相应的位点。
优选地，在流感病毒的PA和PB2中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PA蛋白和PB1蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PB2蛋白和PB1蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PA蛋白、PB2蛋白、PB1蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PA蛋白、PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PA蛋白、PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白、NP蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PA蛋白、M1蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PB1蛋白、M1蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PB2蛋白、M1蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白、NS1蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
在流感病毒的PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白、NEP蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；或
在流感病毒的NS1蛋白、NEP蛋白中均包含一个或多个蛋白水解靶向分子和连接链；
优选地，所述蛋白水解靶向病毒为蛋白水解靶向冠状病毒，所述冠状病毒在其一个或多个不同的病毒蛋白的位点包含一个或多个能被泛素-蛋白酶体系统识别的蛋白水解靶向分子；并且所述病毒蛋白和蛋白水解靶向分子之间通过连接链连接；其中，所述连接链为E-X
优选地，所述病毒为新冠病毒SARS-CoV-2；
更优选地，在冠状病毒的刺突蛋白(spike(S)protein)、包膜糖蛋白(envelope(E)glycoprotein)、膜糖蛋白(membrane(M)glycoprotein)、核衣壳蛋白(nucleocapsid(N)protein)、非结构蛋白1(nonstructural protein1(nsp1))、非结构蛋白2、非结构蛋白3、非结构蛋白4、非结构蛋白5、非结构蛋白6、非结构蛋白7、非结构蛋白8、非结构蛋白9、非结构蛋白10、非结构蛋白11、非结构蛋白12、非结构蛋白13、非结构蛋白14、非结构蛋白15、非结构蛋白16、3a蛋白、3b蛋白、6蛋白、7a蛋白、7b蛋白、8a蛋白、8b蛋白、9b蛋白、3C样蛋白酶(3C-like proteinase)、前导蛋白(leader protein)、2’-O-核糖甲基转移酶(2’-O-ribosemethyltransferase)、核酸内切酶(endoRNAse)、3’-至-5’核酸外切酶(3’-to-5’exonuclease)、解旋酶(helicase)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase)、orf1a多聚蛋白(orf1a polyprotein)、ORF10蛋白(ORF10protein)、ORF8蛋白(ORF8protein)、ORF7a蛋白(ORF7a protein)、ORF6蛋白(ORF6protein)、ORF3a蛋白(ORF3aprotein)的一个或多个中包含一个或者多个蛋白水解靶向分子和连接链；
优选地，蛋白水解靶向病毒为蛋白水解靶向HIV病毒，所述HIV病毒在其一个或多个不同的病毒蛋白的位点包含一个或多个能被泛素-蛋白酶体系统识别的蛋白水解靶向分子；并且所述病毒蛋白和蛋白水解靶向分子之间通过连接链连接；其中，所述连接链为E-X
优选地，所述病毒为HIV病毒；
还优选地，在HIV病毒的Gag多聚蛋白(Gag polyprotein)、pol多聚蛋白(polpolyprotein)、gp160、HIV转录反式激活子(HIV trans-activator of transcription；Tat)、病毒体蛋白表达调节蛋白(regulator of expression of virion proteins；Rev)、病毒负因子(negative factor；Nef)、慢病毒蛋白R(lentivirus protein R；Vpr)、病毒感染性因子(viral infectivity factor；Vif)、病毒蛋白U(virus protein U；Vpu)、基质蛋白(MA；matrix protein,p17)、衣壳蛋白(CA；capsid protein,p24)、间隔肽1(SP1；spacerpeptide 1,p2)、核衣壳蛋白(NC；nucleocapsid protein,p7)、间隔肽2(SP2；spacerpeptide2,p1)、P6、逆转录酶(RT；reverse transcriptase)、核糖核酸酶H(Rnase H)、整合酶(integrase；IN)、HIV蛋白酶(HIV protease；PR)、gp120、gp41蛋白的一个或多个中包含一个或者多个蛋白水解靶向分子和连接链。
在本发明的一个实施方案中，利用反向遗传技术，发明人可以将现用的流感病毒模型的任意基因替换成其他亚型或者毒株的基因，或者将现用的流感病毒模型替换成其他亚型或者毒株，从而制备出其他亚型或者毒株的流感病毒，使得该方法可以应用于任意亚型或毒株的流感病毒，而且制备出的病毒在可以选择性切掉蛋白水解靶向分子的细胞株中大量复制，而在正常的宿主细胞中会被泛素-蛋白酶系统识别降解。此外，该方法可以适用于其他亚型或者毒株，包括H1N1，H1N2，H1N3，H1N8，H1N9，H2N2，H2N3，H2N8，H3N1，H3N2，H3N8，H4N2，H4N4，H4N6，H4N8，H5N1，H5N2，H5N3，H5N6，H5N8，H5N9，H6N1，H6N2，H6N4，H6N5，H6N6，H6N8，H7N1，H7N2，H7N3，H7N7，H7N8，H7N9，H8N4，H9N1，H9N2，H9N5，H9N8，H10N3，H10N4，H10N7，H10N8，H10N9，H11N2，H11N6，H11N9，H12N1，H12N3，H12N5，H13N6，H13N8，H14N5，H15N2，H15N8，H16N3，H17N10和H18N11。此外，利用反向遗传技术，还可以制备多价流感病毒，如含有H1N1、H3N2、B型流感病毒表面抗原的多价流感病毒。更重要的是，制备出的突变型强毒和多价病毒具有非常高的安全性和有效性。
本发明还提供了编码所述蛋白水解靶向病毒的核酸分子。
本发明还提供了表达所述蛋白水解靶向病毒的核酸载体。
另一方面，本发明提供了制备蛋白水解靶向病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
1)构建细胞系：构建可稳定表达对蛋白水解靶向病毒的连接链具有选择性切割作用的蛋白酶细胞系；
优选地，所述细胞系为哺乳动物细胞系；
更优选地，所述细胞系选自CHO细胞、Vero细胞、MDCK.2细胞、HEK293T细胞、MDCK细胞、A549细胞、BHK细胞、BHK-21/BRS细胞、Sp2/0细胞、HEK293细胞、293F细胞、HeLa细胞、TZM-bl细胞、Sup-T1细胞、MRC-5细胞和VMK细胞、LLC-MK2细胞、HCT-8细胞、Huh-7细胞、Caco2细胞；
更进一步优选地，所述细胞系选自HEK293T细胞系或MDCK细胞系；
优选地，所述细胞系为任选的泛素-蛋白酶体系统缺陷的细胞系；更优选地，所述细胞系为E3连接酶敲除或者敲低的细胞系；2)位点选择：通过对宿主体内的泛素-蛋白酶体体系的表达分布进行统计分析、对病毒进行生物信息学和蛋白质结构预测，确定引入的蛋白水解靶向分子种类、引入蛋白水解靶向分子和连接链的病毒蛋白及位点；
3)基因突变：使用基因工程的方法，在所确定的病毒蛋白及选择位点的编码基因处引入编码蛋白水解靶向分子和连接链的核苷酸序列；
4)构建表达载体，将步骤3)得到的基因突变后的病毒蛋白的编码核苷酸序列与载体可操作地连接，得到表达载体；
优选地，所述表达载体为质粒；
5)利用反向遗传技术，将步骤4)中的表达载体与用于流感病毒拯救的其他表达载体在步骤1)构建的对蛋白水解靶向病毒的连接链具有选择性切割的细胞系中，共转染得到蛋白水解靶向病毒；
任选地，6)将该蛋白水解靶向病毒在步骤1)得到的细胞系中进行复制，以大规模生产所述蛋白水解靶向病毒；
优选地，所述病毒制备中加入蛋白酶体抑制剂；更优选地，所述蛋白酶体抑制剂为MG132、MG-341或乳胞素；
或所述方法包括以下步骤：①位点选择：通过对宿主体内的泛素-蛋白酶体体系的表达分布进行统计分析、对病毒进行生物信息学和蛋白质结构预测，确定引入的蛋白水解靶向分子种类、引入蛋白水解靶向分子和连接链的病毒蛋白及位点；
②基因突变：使用基因工程的方法，在所确定的病毒蛋白及选择位点的编码基因处引入编码蛋白水解靶向分子和连接链的核苷酸序列；
③构建突变序列的表达载体，将步骤3)得到的基因突变后的病毒蛋白的编码核苷酸序列与载体可操作地连接，得到表达载体；
优选地，所述表达载体为质粒；
④构建对蛋白水解靶向病毒的连接链具有选择性切割作用的蛋白酶的过表达载体；
构建可稳定表达对蛋白水解靶向病毒的连接链具有选择性切割作用的蛋白酶的细胞系；
⑤利用反向遗传技术，将步骤③得到的表达载体、其他病毒拯救所需的表达载体以及步骤④得到的表达载体共同转染宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在培养基中培养，得到蛋白水解靶向病毒。
根据本发明所述的方法，其中，所述方法还包括步骤7)：
检测：通过测定步骤5)得到的蛋白水解靶向病毒在步骤1)得到的细胞系与未经改造的正常宿主细胞中的复制能力，来确定所述蛋白水解靶向病毒是否改造成功，其中，所述蛋白水解靶向病毒在步骤1)得到的细胞系中复制，在未经改造的正常宿主细胞中复制能力降低或不能复制的蛋白水解靶向病毒为改造成功的蛋白水解靶向病毒。
任选地，所述方法还包括步骤8)：
使用改造成功的蛋白水解靶向病毒载体，重复步骤2)-5)，使得蛋白水解靶向病毒的多个病毒蛋白上均引入了蛋白水解靶向分子和连接链；或者在蛋白水解靶向病毒的任一病毒蛋白上引入多个蛋白水解靶向分子和连接链；
任选地，测定得到的蛋白水解靶向病毒在步骤1)得到的细胞系与未经改造的正常宿主细胞中的复制能力，来确定所述蛋白水解靶向病毒是否改造成功；其中，所述蛋白水解靶向病毒在步骤1)得到的细胞系中复制，在未经改造的正常宿主细胞中复制能力降低或不能复制的蛋白水解靶向病毒为改造成功的蛋白水解靶向病毒。
根据本发明的具体的实施例，提供了一种蛋白水解靶向流感病毒的制备和大规模生产的方法，其包括以下步骤：
1)构建细胞系：将烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp稳定转导至哺乳动物细胞系中，构建可以稳定表达烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp的细胞系；
优选地所述哺乳动物细胞系为HEK293T细胞系和MDCK细胞系；
构建的稳定细胞系为HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp；需要说明的是，虽然在本实施例中，优选烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEVp)及其对应的可切割序列作为研究对象，但本领域技术人员应理解的是，该发明技术的原理可以拓展至其他任何具有切割作用的分子(包括蛋白、多肽、核酸、及化学分子)。
2)位点选择：通过对宿主体内的泛素-蛋白酶体体系的表达分布进行统计分析、对流感病毒进行生物信息学和蛋白质结构预测，预测分析在流感病毒的各个蛋白中引入蛋白水解靶向分子及连接链烟草蚀斑病毒蛋白酶切割序列后的流感病毒的蛋白结构，以确定引入蛋白水解靶向分子和连接链的基因片段及位点；
优选地，在编码流感病毒的不同蛋白的基因片段中选择一个或多个插入位点；
3)基因突变：使用基因工程的方法，在所确定的流感病毒蛋白及选择位点的编码基因处引入编码蛋白水解靶向分子和连接链的核苷酸序列；
4)构建质粒：
将步骤3)得到的基因突变后的病毒蛋白的编码核苷酸序列与质粒可操作地连接，得到编码质粒；
5)利用反向遗传技术，将步骤4)中的质粒与用于流感病毒拯救的其他质粒在步骤1)得到的稳定表达TEVp的稳定细胞中共转染，获得蛋白水解靶向流感病毒；
其中，在蛋白水解靶向流感病毒的基因组中引入了蛋白水解靶向分子及烟草蚀斑病毒蛋白酶切割序列的编码核苷酸序列，从而在对应的流感病毒的蛋白中引入蛋白水解靶向分子及烟草蚀斑病毒蛋白酶切割序列得到蛋白水解靶向分子修饰的流感病毒(PROTAC流感病毒)；
优选地，还包括将转染成功后的宿主细胞在含有0.5％FBS、2μg/mL TPCK-trypsin的DMEM培养基中培养；
简言之，将得到的突变序列表达载体与其他病毒拯救所需的质粒以及过表达TEVp的质粒共同转染宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有0.5％FBS、2μg/mL TPCK-trypsin的DMEM培养基中培养；
任选地，6)将该蛋白水解靶向流感病毒在稳定表达TEVp的稳定细胞系中进行大规模生产；
优选地，转染约4天后，或者当包装出的病毒使4)中的宿主细胞完全病变或者90％以上病变后，收集上清，用于感染新的MDCK-TEVp细胞，培养基为含有0.5％FBS、2μg/mLTPCK-trypsin的DMEM培养基，感染4天后，或当感染的病毒使4)中的宿主细胞完全病变后，收集上清，即得。
优选地，所述方法还包括步骤7)
检测：通过测定步骤5)得到的蛋白水解靶向流感病毒对TEVp的依赖性以及其包装产物的失活对蛋白酶体途径的依赖性，来确定所述蛋白水解靶向流感病毒是否改造成功；
具体地，将上清离心并过0.45μm滤膜去除细胞碎片，对包装产物进行TEVp依赖性的检测，以及包装产物的失活对蛋白酶体途径的依赖性，保留维持着TEVp依赖性的突变体设定为改造成功的候选物。所谓包装产物的TEVp依赖性，指的是使用所述方法包装的病毒在TEVp高表达的细胞系中可以复制增殖，而在不表达TEVp的正常细胞中复制能力降低或者缺陷。
任选地，所述方法还包括步骤8)：
使用改造成功的蛋白水解靶向流感病毒载体重复步骤2)-5)，使得蛋白水解靶向流感病毒的多个病毒蛋白上均引入了蛋白水解靶向分子和连接链；或者在蛋白水解靶向流感病毒的任一病毒蛋白上引入多个蛋白水解靶向分子和连接链；
优选地，通过测定得到的蛋白水解靶向流感病毒对TEVp的依赖性以及其包装产物的失活对蛋白酶体途径的依赖性，来确定所述蛋白水解靶向病毒是否改造成功；保留经过长期传代仍旧维持着对TEVp的依赖性的蛋白水解靶向病毒为改造成功候选物；
任选地，所述方法还包括
9)选择改造成功的候选物，并对产物进行纯化；
10)对9)中的蛋白水解靶向流感病毒进行安全性或免疫原性检测，相比野生型病毒，安全的流感病毒为改造成功的流感病毒。
在本发明的一个具体的实施方案中，通过将被蛋白水解靶向流感病毒基因插入到载体(例如pHH21质粒)中，将所述的载体与拯救流感病毒所需的其他载体一起转染可以选择性切掉蛋白水解靶向分子的稳定细胞系，优选HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp，即可获得PROTAC流感病毒。该病毒在可以选择性切掉蛋白水解靶向分子的稳定细胞系，优选HEK293T-TEVp和/或MDCK-TEVp中进行大量扩增制备。
在本发明的一个实施方案中，为了提高流感病毒的产出效率，以及将来的工业化生产，发明人建立了可以稳定表达烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp的稳定细胞系(优选HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp)。该哺乳动物稳定细胞系还解决了传统使用鸡胚繁殖病毒易引起人体过敏等不良反应的缺点。为了进一步提高产出效率，可以在病毒培养基中加入适量的蛋白酶体抑制剂用于抑制泛素-蛋白酶体系统对病毒蛋白的降解；或者可以使用泛素-蛋白酶体系统缺陷的细胞系，如E3泛素连接酶敲除或者敲低的细胞系。
在本发明中提供了一种可由哺乳动物细胞制备，在基因组和相应蛋白中分别引入可被条件性切割的蛋白水解靶向分子的的突变流感病毒，即PROTAC病毒。优选地，所述病毒为H1N1、H5N1、H7N9、H3N2或B型流感病毒。
上述病毒也可以由稳定表达TEVp的哺乳动物稳定细胞系(如293T细胞、MDCK细胞、CHO细胞、Vero细胞等)来制备。为了进一步提高产出效率，可以在病毒培养基中加入适量的蛋白酶体抑制剂用于抑制泛素-蛋白酶体系统对病毒蛋白的降解；或者可以使用泛素-蛋白酶体系统缺陷的细胞系，如E3泛素连接酶敲除或者敲低的细胞系。制备的突变流感病毒具有很好的安全性和免疫活性。
为了建立稳定表达TEVp的哺乳动物细胞细胞系，发明人构建了带有嘌呤霉素抗性的慢病毒过表达载体，其携带TEVp的表达基因，通过病毒分别转导HEK293T细胞和MDCK细胞，并经过嘌呤霉素筛选，得到稳定表达TEVp的稳定细胞株。将这些稳定细胞株单克隆化，进行单克隆培养，利用Western blotting和RT-qPCR分选出TEVp表达量最高的稳定细胞株，即为最终的稳定细胞系HEK293T细胞和MDCK细胞。
经中空纤维柱和凝胶层析方法或者蔗糖梯度密度离心方法，即可得到纯化后的突变型PROTAC流感病毒。经体内外实验初步证明，PROTAC流感病毒具有优良的安全性和遗传稳定性，并且与灭活病毒相比具有更好的免疫效果。
本发明还提供了一种制备减毒活病毒、复制无能活病毒、复制可控活病毒以及制备用于预防和治疗病毒感染相关疫苗和药物的方法，所述方法包括使用所述的蛋白水解靶向病毒的步骤，或使用所述的方法制备蛋白水解靶向病毒的步骤。
本发明还提供了一种疫苗或药物组合物，其包含所述的蛋白水解靶向病毒；
优选地，所述疫苗为减毒活疫苗、复制无能活疫苗或复制可控活疫苗。
本发明还提供了一种制备所述的蛋白水解靶向病毒的系统，所述系统包括：稳定表达对蛋白水解靶向病毒的连接链具有选择性切割作用的蛋白酶的细胞系；优选地，所述细胞系为稳定表达烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp的细胞系；更优选地，所述细胞系为稳定表达烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp的HEK293T细胞系或MDCK细胞系；为了进一步提高产出效率，可以在病毒培养基中加入适量的蛋白酶体抑制剂用于抑制泛素-蛋白酶体系统对病毒蛋白的降解；或者可以使用泛素-蛋白酶体系统缺陷的细胞系，如E3泛素连接酶敲除或者敲低的细胞系。
进一步优选地，所述系统还包括表达所述的蛋白水解靶向病毒的核酸载体。
再另一方面，本发明提供了本发明的蛋白水解靶向病毒在制备减毒活疫苗、复制无能活疫苗、复制可控活疫苗、制备预防和治疗病毒感染相关药物中的用途。
本发明还提供了一种疫苗，所述组合物含有所述PROTAC流感病毒、PROTAC新冠病毒或PROTAC HIV病毒。
优选地，所述疫苗含有佐剂和其它辅料。
本发明还提供了一种药物组合物，其中含有所述PROTAC流感病毒、PROTAC新冠病毒或PROTAC HIV病毒，以及药学上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了所述PROTAC流感病毒、PROTAC新冠病毒或PROTAC HIV病毒在制备减毒活疫苗、复制无能活疫苗、复制可控活疫苗、制备预防和治疗病毒感染的相关药物中的用途。
本发明还进一步提供了携带烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virusprotease，TEVp)基因的慢病毒病毒载体，其序列如下所示。该载体包装病毒后转导细胞，利用嘌呤霉素筛选，可以将烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEVp)整合到宿主细胞中。所述TEVp的氨基酸序列如SEQ ID NO:150所述：
SEQ ID NO:150：
MGESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN
本发明还提供了一种稳定表达TEVp的哺乳动物稳定细胞系HEK293T-TEVp、MDCK-TEVp。
其中，稳定细胞系MDCK-TEVp和HEK293T-TEVp，该细胞系由慢病毒转导获得，携带有烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEVp)基因，利用该稳定细胞系，可以在病毒任意目的蛋白质的特定位点引入以TEVp切割序列作为linker的蛋白水解靶向分子，实现PROTAC病毒的大规模制备。
上述的组合物、药物组合物和疫苗可以在本发明制备定点突变修饰的PROTAC流感病毒的基础上采用本领域常规技术制备；它们可以用于预防或治疗流感病毒感染，包括人和动物的流感病毒感染。
再一方面，本发明提供了一种定点突变、定点修饰、复制可控的流感病毒活疫苗，所述的定点突变和定点修饰为在流感病毒的任意蛋白中引入可引起蛋白降解(水解)的肽段、氨基酸序列或其他分子，该被引入的可引起蛋白降解(水解)的肽段、氨基酸序列或者其他分子在病毒制备过程中可以被选择性地切掉、抑制或失活。本发明还涉及将经过定点突变修饰的位点进行组合制备在多个基因片段上引入可引起蛋白降解(水解)的肽段、氨基酸序列或者其他分子的流感病毒。
本发明还提供了一种定点突变、修饰流感病毒的方法，所述方法包括将可引起蛋白降解(水解)的任意分子(包括多肽、氨基酸序列、蛋白、或其他分子)(Proteolysis-targeting molecule)通过零个、一个或者多个可被选择性切割的连接链(linker，包括多肽、氨基酸序列、蛋白、或者其他分子)引入到流感病毒的任意基因(蛋白)中，被突变修饰的流感病毒蛋白在正常的宿主(细胞)中可以被降解(水解)，导致病毒复制能力(活性)降低甚至复制能力完全消失。
本发明还提供了一种选择性抑制病毒蛋白降解(水解)的方法，所述方法包括选择性地抑制或失活可引起蛋白降解(水解)的分子，选择性地切割蛋白降解分子与病毒蛋白之间连接链，以保证病毒在制备过程中高的生产效率。为了进一步提高PROTAC病毒的生产效率，在PROTAC病毒制备过程中还可以加入适量的蛋白酶体抑制剂(如MG132、MG-341、乳胞素lactacystin等)用于抑制蛋白酶体介导的蛋白降解，或者使用泛素-蛋白酶体系统缺陷的细胞进行PROTAC病毒的制备，如相应的E3连接酶敲除或者敲低的细胞系。
本发明进一步提供了所述定点突变修饰或多点组合的流感病毒的应用，如作为流感病毒活疫苗、减毒疫苗、复制无能疫苗、流感病毒强毒的安全模型等的用途。本发明中的技术可以被广泛用于任意病毒的改造制备、及其或活疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、强毒的安全模型等的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)通用性：所有的病毒都有蛋白，只需要在想要降解的病毒蛋白中引入“可切割的蛋白水解靶向分子”，就可以控制病毒的复制。因此该技术可用于所有病毒疫苗的制备。
2)可供选择的蛋白水解靶向分子有成千上万种，这些分子都可以被开发利用来制备这种病毒疫苗。因此有丰富的后备资源可供选择。
3)操作简单：只需要简单的病毒载体的构建和病毒的制备技术，生产者甚至不需要太多的病毒生物学知识就可以制备这类疫苗。
4)实验证明，该技术可以用于设计成具有不同失活程度的疫苗，具有安全的可控性。
5)实验证明这类疫苗具有很好的免疫原性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为TEVp过表达慢病毒载体的图谱；
图2A为对潜在的HEK293T-TEVp细胞进行RT-PCR鉴定的电泳图(箭头表明的细胞为目的基因TEVp的mRNA表达水平相对较高的细胞)。图2B为对潜在的MDCK-TEVp细胞进行RT-PCR鉴定的电泳图(O(old)代表第一批次的MDCK细胞；N(new)代表第二批次的MDCK细胞；箭头表明的细胞为目的基因TEVp的mRNA表达水平相对较高的细胞)。。
图3为根据本发明的方法制备的HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp细胞系的目的蛋白TEVp蛋白表达检测的图及病毒包装效率的图。
图4为根据本发明的方法制备的蛋白水解靶向流感病毒(PROTAC流感病毒)在MDCK-TEVp细胞系和正常细胞系中感染2天后复制滴度的柱形图。
图5为根据本发明的方法制备的含有多个蛋白水解分子的蛋白水解靶向流感病毒(PROTAC流感病毒)在MDCK-TEVp细胞系和正常细胞系中感染复制滴度的柱形图。
图6为比较根据本发明的方法制备的蛋白水解靶向流感病毒(PROTAC流感病毒)在MDCK-TEVp细胞和正常细胞系中复制能力的柱形图。
图7为根据本发明的方法制备的蛋白水解靶向流感病毒(PROTAC流感病毒)的遗传稳定性进行考察，说明制备出的PROTAC流感病毒在多次传代后，仍旧是稳定的。
图8为使用western blot实验评价根据本发明的PROTAC流感病毒在正常细胞中可被蛋白酶体降解的图。
图9为使用免疫荧光实验评价根据本发明的PROTAC流感病毒在MDCK-TEVp细胞系和正常细胞中的复制的免疫荧光检测图。
图10为根据本发明的PROTAC病毒的动物水平免疫原性和保护性结果；
图11提供了根据本发明的方法制备蛋白水解靶向病毒的制备方法的流程图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，发明人用实施例对具体试验进行阐述和说明，其中所述实施例仅用于说明，并不限定本发明的保护范围。任何与本发明等价的变体或者实施方案都包括在本发明中。
该稳定表达TEVp的哺乳动物细胞系经委托由北京可瑞生物科技有限公司(CorreGene)协助完成。
(1)TEVp过表达慢病毒载体的构建：
TEVp过表达慢病毒载体图谱如图1所示。所述慢病毒载体具有嘌呤霉素抗性。
(2)慢病毒包装纯化及定量
①第0天细胞接种：293T接种于10cm/15cm培养皿中(接种数量由预期的病毒量决定，1×10^8/15cm培养皿)，控制接种密度，第二天生长至80％融合；
②第1天质粒转染：使用(1)中所述的TEVp过表达慢病毒载体、psPAX2质粒(该质粒可由addgene获得)和pVSVG质粒(该质粒可由addgene获得)共同转染293T细胞；
③第2天换液：转染18小时后换液(转染体系有毒性)，完全吸去培养基，小心加入20mL新鲜完全培养基(15cm培养皿)；
④病毒上清预处理：第3、4和5天收集病毒上清后，将培养上清转移至50mL离心管中，最高转速离心10min；使用0.45μm滤器过滤病毒上清，直接使用灭菌后的250mL离心瓶收集病毒上清；
⑤高速离心纯化病毒：使用20mL注射器将10％蔗糖溶液，缓慢地注入离心瓶底部，体积比保持4:1(病毒上清4份，蔗糖溶液1份)，4℃，14000rpm离心2小时；
⑥病毒重悬：弃去上清，吸干净，加入100ul－1000ul PBS，吹吸混匀；
⑦病毒上清分装，-80度冻存；分装时剩余30ul左右单独冻存，用于滴度测定。
⑧使用化学发光法(CMIA)测定慢病毒滴度，确认pLenti-CMV-puro-2A-TEVp-8534bp的滴度为5.12E+7TU/mL，体积1000ul，总量为5.12E+7TU，达到转导要求。
(3)稳定单克隆细胞系构建
①第0天细胞接种：HEK293T或者MDCK接种于12/6孔板培养皿中(接种数量由预期的病毒量决定，1×10^6/6孔板培养皿)，控制接种密度，第二天生长至20～30％融合；
②第1天融化病毒：从-80℃冰箱取出病毒，放冰上融化。使用合适moi(MOI＝10)感染细胞。
③第2天病毒转导：使用合适moi感染细胞24小时后换2μg/mL puro抗性培养基抗性筛选。
④连续抗性筛选7天左右(空白对照全部杀亡)。
⑤对于存活细胞进行消化计数，按100个/200个细胞均分到一个96孔板。(平均每孔有1～2个细胞)
⑥3-5天可见克隆增殖，选出单克隆细胞孔，进行增殖，逐级扩增至24孔板，12孔板。
⑦单克隆鉴定：
鉴定引物
TEVp-F:
SEQ ID NO:151TCATTACAAACAAGCACTTG
TEVp-R:
SEQ ID NO:152TAGGCATGCGAATAATTATC
片段大小：144bp
293t-GAPDH-eF:
SEQ ID NO:153CCACATCGCTCAGACACCAT
293t-GAPDH-eR:
SEQ ID NO:154GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT
片段大小：114bp
对优选细胞单克隆消化，提取RNA，RT-PCR鉴定，验证细胞是否有TEVp整合并表达。扩增条件如下表1所示：
表1扩增条件
结果如图2所示，图2A为对潜在的HEK293T-TEVp细胞进行RT-PCR鉴定的电泳图(箭头表明的细胞为目的基因TEVp的mRNA表达水平相对较高的细胞)。该验证工作经委托由北京可瑞生物科技有限公司(CorreGene)协助完成。图2B为对潜在的MDCK-TEVp细胞进行RT-PCR鉴定的电泳图(O(old)代表第一批次的MDCK细胞；N(new)代表第二批次的MDCK细胞；箭头表明的细胞为目的基因TEVp的mRNA表达水平相对较高的细胞)。该验证工作经委托由北京可瑞生物科技有限公司(CorreGene)协助完成。
⑧优选单克隆细胞系扩增培养
优选TEVp表达效率高的细胞系进行扩增、冻存备用，其分别命名为HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp。
结果如图3所示，使用抗-TEVp的抗体对HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp细胞系进行western blot检测，结果表明HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp稳定细胞系中可以高效稳定表达烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp。此外，对细胞进行改造并没有引起病毒生产效率的改变，说明了TEVp在细胞中的兼容性。
(1)拯救野生型流感病毒WSN的质粒的获得：
根据pubmed公布的流感病毒A/WSN/1933的基因序列
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝WSN+NS，经全基因合成，获得该流感病毒各个基因片段的基因。然后将其分别连接在pHH21、pCDNA3(neo)、pcAAGGS/MCS载体上(获自北京中科裕博生物技术有限公司)，获得拯救野生型流感病毒WSN的质粒。获得的质粒的命名及构成如下表2所示。
表2
(2)引入可切割的蛋白水解靶向分子的病毒载体构建
发明人在流感病毒WSN的各个病毒蛋白(PA，PB2，PB1，NP，HA，NA，M1，M2，NS1，NEP)对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可被TEVp切割的蛋白水解靶向分子的基因序列，并构建了如下的病毒载体。
具体地，在病毒的任一蛋白上引入所述可被TEVp切掉的蛋白水解靶向分子的基因序列及其表达的氨基酸序列如下，但不局限于以下序列。将所用氨基酸序列对应的基因序列进行人源化优化，并插入到目的蛋白基因的编码区C端、终止密码子之前；该工作委托北京擎科生物科技有限公司协助完成，并经测序验证突变构建成功。其中：
1)在流感病毒的PA蛋白的C末端引入如SEQ ID NO:138所示的序列，即在其PA蛋白基因编码区的C端、终止密码子之前，引入如SEQ ID NO:155所示的核苷酸序列，并将其命名为PA-TEVcs+PROTAC-1(或者命名为PA-PTD1)；
SEQ ID NO:138
GSGGENLYFQGGSGALAPYIP；
SEQ ID NO:155
GGTTCTGGTGGTGAGAAT CTGTAC TTC CAA
GGTGGATCTGGAGCA TTG GCC CCC TAC ATTCCA；
2)类似地，流感病毒的M1蛋白的C末端引入如SEQ ID NO:138所示的序列，即在其PA蛋白基因编码区的C端、终止密码子之前，引入如SEQ ID NO:155所示的核苷酸序列，并将其命名为M1-TEVcs+PROTAC-1(或者命名为M1-PTD1)；
3)在流感病毒的PB1蛋白的C末端引入如SEQ ID NO:139所示的序列，即在其PB1蛋白基因编码区的C端、终止密码子之前，引入如SEQ ID NO:156所示的核苷酸序列，并将其标记为PB1-TEVcs+PROTAC-2(或者命名为PB1-PTD2)：
SEQ ID NO:139
GSGGENLYFQGGSGDRHDSGLDSM
SEQ ID NO:156GGTTCTGGTGGTGAG AAT CTGTAC TTC CAAGGTGGATCTGGAGAT CGCCAC GAT TCA GGG CTC GAT TCC ATG
4)在流感病毒的PB2蛋白的C末端引入如SEQ ID NO:139所示的序列，即在其PB2蛋白基因编码区的C端、终止密码子之前，引入如SEQ ID NO:156所示的核苷酸序列，并将其标记为PB2-TEVcs+PROTAC-2(或者命名为PB2-PTD2)：
5)在流感病毒的M1蛋白的C末端引入如SEQ ID NO:139所示的序列，即在其M1蛋白基因编码区的C端、终止密码子之前，引入如SEQ ID NO:156所示的核苷酸序列，并将其标记为M1-TEVcs+PROTAC-2(或者命名为M1-PTD2)
6)在流感病毒的PA蛋白的C末端引入如SEQ ID NO:140所示的序列，即在其PA蛋白基因编码区的C端、终止密码子之前，引入如SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列，并将其命名为PA-TEVcs+PROTAC-3(或者命名为PA-PTD3)；
SEQ ID NO:140：
GSGGENLYFQGGGGSSHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV；
SEQ ID NO:157
GGTTCTGGTGGTGAGAATCTGTACTTCCAAGGTGGAGGAGGATCCAGCCATGGCTTCCCGCCGGAGGTGGAGGAGCAGGATGATGGCACGCTGCCCATGTCTTGTGCCCAGGAGAGCGGGATGGACCGTCACCCTGCAGCCTGTGCTTCTGCTAGGATCAATGTG
7)将PA-TEVcs+PROTAC-1(PA-PTD1)和PB1-TEVcs+PROTAC-2(PB1-PTD2)进行组合，构建在PA和PB1分别携带一个可切割蛋白水解分子的病毒。
进一步地，发明人还构建了如下的病毒载体：
表3病毒载体
表3(续)病毒载体
按照正常的拯救流感病毒方法，将拯救流感病毒所用的12个质粒共转染稳定细胞系，并使用实施例2中定点突变改造的质粒替换这12个质粒中相应的质粒。对应于六孔板的每个孔，每种质粒加0.2μg。转染后，观察细胞的病变情况，筛选出可以拯救出病毒并且对TEVp具有依赖性的插入位点、蛋白水解靶向分子、可被TEVp切割的连接链linker、以及它们的组合。筛选出的毒株根据蛋白及引入的可切割的蛋白水解靶向分子进行命名。
示例说明，将Ben3 pPolI-WSN-PA质粒上引入可切割蛋白水解靶向分子TEVcs+PROTAC-1之后，将该质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben1 pPolI-WSN-PB2；Ben2 pPolI-WSN-PB1；Ben4 pPolI-WSN-HA；Ben5 pPolI-WSN-NP；Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9 pcDNA 3(neo)-PB2；Ben10 pcDNA 3(neo)-PB1；Ben11 pcDNA3(neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染实施案例1中建立的稳定细胞系，从而拯救出在流感病毒PA基因片段上引入TEVCs+PROTAC-1的突变型流感病毒，命名为PA-TEVcs+PROTAC-1(或者命名为PA-PTD1)。在Ben7 pPolI-WSN-M质粒上的M1蛋白的编码区C端引入可切割蛋白水解靶向分子TEVcs+PROTAC-1之后，将该质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben1 pPolI-WSN-PB2；Ben2 pPolI-WSN-PB1；Ben3 pPolI-WSN-PA；Ben4 pPolI-WSN-HA；Ben5 pPolI-WSN-NP；Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9pcDNA 3(neo)-PB2；Ben10 pcDNA 3(neo)-PB1；Ben11 pcDNA 3(neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染实施案例1中建立的稳定细胞系，从而拯救出在流感病毒M1基因片段上引入TEVCs+PROTAC-1的突变型流感病毒，命名为M1-TEVcs+PROTAC-1(或者命名为M1-PTD1)。
依照同样的方法，可获取其他位点引入可切割的蛋白水解靶向分子的突变型流感病毒，并按照同样的规则进行命名。
按照能否引起细胞病变的标准对构建的所有PROTAC病毒载体进行考察：如果可以引起HEK293T-TEVp和/或MDCK-TEVp细胞病变，说明该PROTAC病毒拯救成功；如果不能引起HEK293T-TEVp和/或MDCK-TEVp细胞病变，说明该PROTAC病毒拯救失败。部分的突变型流感病毒的拯救情况作为示例，可见表4和图4。表4中总结了可以引起MDCK-TEVp细胞发生病变的部分PROTAC流感病毒毒株。图4展示了部分毒株在接种到MDCK-TEVp细胞和正常MDCK细胞后(MOI＝0.01)，感染第二天检测到的细胞上清中的病毒滴度。所述结果表明在流感病毒的8个基因片段上均可引入可选择性切割的蛋白水解靶向分子，其中PA、PB2、PB1、M1等均可以拯救出PROTAC流感病毒。
表4引起MDCK-TEVp细胞发生病变的部分PROTAC流感病毒毒株
发明人从上述突变位点、可切割的蛋白水解靶向分子中，选择了拯救流感病毒效率高、遗传稳定、且在正常宿主细胞最终复制能力明显下降甚至完全消失的突变修饰方式，进行组合，制备含有多个蛋白水解靶向分子的流感病毒，并从中进一步选择优选的毒株，分别命名为M1-TEVcs+PROTAC-1+PROTAC-2(或者M1-PTD6)、M1-TEVcs+PROTAC-2+PROTAC-1(或者M1-PTD5)、PROTAC-V1(表4和图5)。所述M1-TEVcs+PROTAC-1+PROTAC-2为在病毒的M1蛋白的C端引入串联的PROTAC-1和PROTAC-2制备出的含有两种蛋白水解靶向分子的PROTAC毒株；M1-TEVcs+PROTAC-2+PROTAC-1为在病毒的M1蛋白的C端引入串联的PROTAC-2和PROTAC-1制备出的含有两种蛋白水解靶向分子的PROTAC毒株；PROTAC-V1为在病毒的PA蛋白的C端引入TEVcs-PROTAC-1、在病毒的PB1蛋白的C端引入TEVcs-PROTAC-2制备出的含有两个蛋白水解靶向分子的PROTAC毒株(表4)，进一步地，图11提供了根据本发明的方法制备蛋白水解靶向病毒的流程图。
1)含有可切割的蛋白水解靶向分子的PROTAC病毒的拯救
将实施例3的步骤中定点突变改造后的流感病毒的拯救中获得的突变型流感病毒包装质粒共转染实施案例1中的稳定细胞系，6小时候换成新的培养基，培养基中含有1％的FBS和2μg/mL的TPCK-trypsin，并以正常细胞作为对照。此拯救实验采用的阳性对照为野生型流感病毒WSN，除了拯救病毒的质粒不同之外，其余条件均与突变型流感病毒的拯救条件相同。转染完成后，每天观察细胞的状态，用TEVp稳定细胞系中出现病变，而正常细胞不出现病变或者病变较少的突变体为阳性突变体。而野生型流感病毒在TEVp稳定细胞系和正常细胞系中均出现病变。
2)PROTAC流感病毒的纯化
a.当步骤1)拯救突变型PROTAC流感病毒的稳定系细胞完全病变时，或者转染大约4天后，收集细胞上清，于5000g离心10min，用新的稳定细胞系进行大量扩增，待细胞完全病变或者扩增大约4天后，收集细胞上清，过0.45μm的滤膜。
b.使用蔗糖梯度梯度密度离心的方法纯化流感病毒。具体步骤如下：将1)中的病毒液用50mL离心管(高速专用)于10
c.用NTE Buffer(100mM NaCl，10mM Tris-Cl，pH7.4，1mM EDTA)溶解蔗糖，配成20％蔗糖溶液，过0.45μm滤膜。
d.将步骤3)的蔗糖加入到50mL或者15mL离心管中，将2)中的PBS重悬液滴在蔗糖溶液上。11×10
e.沉淀加约15mL NTE buffer，11×10
f.将步骤5)中的沉淀用PBS重悬。
发明人通过对制备出的突变型PROTAC流感病毒M1-TEVcs+PROTAC-1、M1-TEVcs+PROTAC-2、M1-TEVcs+PROTAC-1+PROTAC-2、M1-TEVcs+PROTAC-2+PROTAC-1进行TEVp蛋白的依赖性考察来确认PROTAC病毒的安全性；进行长期的传代培养，来考察该突变型病毒中可切割的蛋白水解靶向分子的稳定性。
具体实验1：将制备的突变型PROTAC流感病毒按照MOI＝0.01的比例感染MDCK-TEVp细胞和正常的MDCK细胞，3-4天后取上清检测病毒的滴度，将PROTAC病毒在MDCK-TEVp细胞中的病毒滴度定为100％，比较PROTAC病毒在MDCK-TEVp细胞和正常MDCK细胞中的相对病毒滴度，可知病毒在两种细胞中的复制能力差异。
具体实验2：将新制备出的突变型PROTAC流感病毒按照MOI＝0.01的比例接种在新的培养基中并感染稳定系细胞，培养基中含有1％FBS、2μg/mL的TPCK-trypsin，并用正常的细胞系作为对照。待TEVp稳定细胞系完全病变后时，取出上清，过0.45μm的滤膜，再按照MOI＝0.01的比例接种在新的培养基中并感染稳定系细胞，同样以正常的细胞系作为对照。如此重复，进行长期的病毒传代。通过基因测序检测引入的蛋白水解靶向分子是否发生了突变。
由图6可知，PROTAC病毒在MDCK-TEVp细胞中可以复制增殖，而在正常的MDCK细胞中的复制能力显著降低甚至不能复制，即具有对TEVp的依赖性，说明该病毒是安全的。由图7可知，经过长期传代，突变型PROTAC病毒毒株中引入的蛋白水解靶向分子没有发生突变。这说明在流感病毒基因中引入的可切割的蛋白水解靶向分子是稳定存在的，进而说明在遗传上是稳定的。
发明人以M1-TEVcs+PROTAC-1和M1-TEVcs+PROTAC-2为代表性毒株，考察了设计的PROTAC流感病毒在正常细胞中的复制能力的减弱是否是由细胞内的泛素-蛋白酶体系统介导的。
具体实验1：将制备的突变型PROTAC流感病毒或野生型病毒感染正常的MDCK细胞(MOI＝0.1)，培养基中补充100nM蛋白酶体抑制剂MG-132或者相同稀释比例的DMSO作为对照。分别在感染后24小时和48小时，收集细胞样品，用western blot检测病毒M1蛋白水平。
具体实验2：将制备的突变型PROTAC流感病毒或野生型病毒感染MDCK-TEVp细胞和正常的MDCK细胞(MOI＝0.01)，培养基中补充不同浓度(0，50，或者100nM)的蛋白酶体抑制剂MG-132或者相同稀释比例的DMSO作为对照。在感染后48小时，将细胞用4％PFA固定，用免疫荧光实验检测病毒NP蛋白水平。
由图8可知，野生型病毒在感染MDCK细胞后，可以大量复制，产生大量的病毒蛋白。相比之下，PROTAC病毒的病毒蛋白M1上修饰了蛋白水解靶向分子TEVcs+PROTAC-1或者TEVcs+PROTAC-2后，在感染后48小时后病毒的M1蛋白会被降解；而培养基中加入蛋白酶体抑制剂MG-132后，蛋白酶体介导的病毒蛋白M1的降解被抑制。该实验结果说明，发明人引入的蛋白水解靶向分子可以介导病毒蛋白的降解；PROTAC病毒在正常细胞中复制能力的降低是由蛋白酶体介导的病毒蛋白的降解引起的，符合发明人的原理。
由图9的免疫荧光实验结果可知，PROTAC病毒在感染MDCK-TEVp细胞后可以大量复制，并合成大量的病毒蛋白。而PROTAC病毒感染正常的MDCK细胞后，无法大量复制，因此检测到较少的病毒蛋白NP的信号；而当细胞的蛋白酶体系统被抑制后，病毒蛋白NP的信号增加，说明当蛋白酶体系统被抑制后，病毒的复制能力增强。该结果与图8的结果相符，进一步证明蛋白水解靶向分子的引入会介导细胞的蛋白酶体对病毒蛋白的降解，进而抑制病毒的复制能力；当细胞的蛋白酶体系统被抑制后，病毒的复制能力会恢复。
以上结果证明，PROTAC病毒的复制能力的降低或者缺陷是由细胞的泛素-蛋白酶体系统介导的；符合发明人对PROTAC病毒的设计预期。
本研究中使用雪貂ferret(中国江苏无锡Cay雪貂农场提供)对PROTAC病毒在动物水平的免疫原性和有效性进行评价。以灭活流感疫苗(IIV)为对照(灭活流感病毒疫苗为发明人根据中国药典提供的方法用同源的流感病毒颗粒制备的)，选择M1-TEVcs+PROTAC-1作为PROTAC病毒的代表，进行PROTAC病毒的免疫原性和保护性评价。
具体实验：
1)将9只4-6个月的的雌性雪貂分成3组，每组3只。
2)接种病毒疫苗：第一组滴鼻接种PBS；第二组滴鼻接种10
3)接种三周后，从每组中采集血清，用于血凝抑制(HI)试验、中和(NT)抗体检测。
4)接种三周后，每组动物鼻腔接种10
6)接种野生型病毒3天后，取其肺组织，用噬斑实验测其中的病毒含量。
结果如图10所示，PROTAC病毒就可以在动物体内诱导高水平的血凝抑制抗体滴度(A)和中和抗体滴度(B)。PROTAC病毒诱导的血凝抑制抗体和中和抗体水平，显著高于由灭活疫苗诱导的抗体水平。PROTAC病毒疫苗的接种可以显著减少动物肺组织中的野生型病毒滴度(C)；PROTAC病毒疫苗提供的保护性显著地优于灭活疫苗。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Gly Ser Thr Gly Gly
1 5
<210> 76
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Gly Met Gly Gly
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Leu Val His Ala Gly
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Ser Leu Gln Thr Gly
1 5
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Pro Val Pro Gly Gly
1 5
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Asn Tyr Lys Ser Gly
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Pro Arg Lys Gln Gly
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Thr Pro Arg Gly Gly
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Gly Cys Ser Gly Gly
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Gly Lys Ala Trp Gly
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Pro Ala Gly Gly Gly
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Val Val Leu Tyr Gly
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Gly Phe Gln Ser Gly
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Arg Val Gln Trp Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Arg Thr Glu Gly Gln Phe Gly Thr Thr Gln Ser Asn Gly Thr Phe
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20 25 30
Gln Ser Leu Thr Ser Leu
35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Tyr Arg Pro Ile Pro Phe Gln Pro Glu Gly Ala Gly Glu Gly Thr Asp
1 5 10 15
Glu Asp Lys Ser Asn Arg Ile Gly Asn Asn Gly Leu Arg Leu Asn Asp
20 25 30
Gly Asn Gly Asn Gly Gln Leu Ala Pro Ser Pro Thr Pro Gln Gly Thr
35 40 45
Glu Ala Val Arg Ala
50
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Arg Lys Phe Ser Asn Asn Pro Gln Pro Asn Ala Ile Ser Asn Gly Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Arg Pro Gly Glu Gly Ala Thr Gln Gly Ile Val Glu
20 25 30
Glu Glu Val Leu Gln
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Ile Arg Thr Glu Ser Ala Glu Glu Ala Glu Met Ala Ser Val Pro Asn
1 5 10 15
Gly Ser Pro Ser Trp His Pro Gly Ala Ser His Val Val Asn Gly Ala
20 25 30
Ala Gly His Ser Asn
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp His Glu Ile Glu Met Glu Ser Gly Glu Glu Ala Met Glu Pro Ala
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20 25 30
Pro Ser His Val Ile
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Asn Arg Thr Asp Phe Ala Gly Glu Glu Asp Glu Met Asp Gly Val Leu
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Asn Gly Ser Pro Ser Trp His Ala Ala Thr Ser His Ile Val Asn Gly
20 25 30
Ala Thr Val His Gln
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Asn Arg Thr Asp Thr Ala Ala Glu Ala Glu Met Asp Ser Val Leu Asn
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Gly Ser Pro Ser Trp His Pro Pro Ala Gly His Val Val Asn Gly Ala
20 25 30
Thr Val His Arg Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Asn Arg Thr Asp Thr Ala Ala Glu Ala Glu Met Asp Ser Val Leu Asn
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Gly Ser Pro Ser Trp His Pro Pro Ala Gly His Val Val Asn Gly Ala
20 25 30
Ala Val His Arg Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asn Arg Thr Glu Val Leu Glu Gly Ala Glu Ile Pro Ser Thr Val Asn
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Gly Ser Pro Ser Trp His Pro Ala Asp Ser Arg Ala Val Ser Gly Ala
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Thr Gly His Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Leu Pro Ser Thr Val Asn
1 5 10 15
Gly Ser Pro Ser Trp His Pro Ala Asp Ser Arg Ala Gly Ser Gly Ala
20 25 30
Thr Gly His Ser Ser
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Arg Glu Thr Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala
20 25 30
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35
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<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Val Glu Thr Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp Gln Leu Ala Asp Ser Pro Ala
20 25 30
Ile Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val
35 40 45
Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Gln Ala Leu
50 55
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Asp Met Glu Thr Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ile Asn Gly Asn Ala Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala
20 25 30
Val Asn Gly Ala Thr
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Gly Pro Glu Met Glu Thr Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ala Trp His Pro Ala Asp Ser Pro Ala
20 25 30
Val Asn Gly Ala Thr
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Asp Met Glu Thr Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala
20 25 30
Val Asn Gly Ala Thr
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Ala Glu Thr Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala
20 25 30
Val Asn Gly Ala Thr
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Met Glu Thr Pro
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Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Pro
20 25 30
Ala Asn Gly Ala Thr
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Asp Ser Glu Met Glu Thr Pro
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Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ala Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala
20 25 30
Val Asn Gly Ala Thr
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<211> 37
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Asp Ser Glu Met Glu Thr Pro
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Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Val
20 25 30
Val Asn Gly Ala Thr
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Met Glu Thr Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala
20 25 30
Val Asn Gly Ala Thr
35
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
Leu Glu Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Pro Arg Ser Phe Thr Ser Cys
1 5 10 15
Gly Ser Leu Glu
20
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Met
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
Asp Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
Gly Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
Tyr Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
Met Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
Trp Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
Cys Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
Arg Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
Leu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
Arg Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
Ala Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
Gln Asn Leu Ile Phe Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
Arg Asn Leu Tyr Phe Gln Cys
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
Glu Cys Leu Tyr His Gln Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
Glu Arg Leu Tyr Val Gln Met
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
Glu Ser Glu Tyr Cys Gln Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
Glu Val Met Tyr Ser Gln Ala
1 5
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
Glu Phe Leu Tyr Ile Gln Asp
1 5
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
Glu Arg Gly Tyr Gly Gln Val
1 5
<210> 133
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
Glu Val Trp Tyr Cys Gln Cys
1 5
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
Glu Val Ala Tyr Gly Gln Lys
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
Glu Ser Arg Tyr Val Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
Glu Gly Glu Tyr Trp Gln Arg
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
Glu Ser Asn Tyr Gly Gln Met
1 5
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ala Leu
1 5 10 15
Ala Pro Tyr Ile Pro
20
<210> 139
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Arg
1 5 10 15
His Asp Ser Gly Leu Asp Ser Met
20
<210> 140
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Ser
1 5 10 15
His Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu Pro
20 25 30
Met Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala Cys
35 40 45
Ala Ser Ala Arg Ile Asn Val
50 55
<210> 141
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro
20 25 30
<210> 142
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Gly Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp
20 25 30
Ser Met
<210> 143
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Gly Ser His Gly Phe Pro Pro Glu
20 25 30
Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu
35 40 45
Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn
50 55 60
Val
65
<210> 144
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ala Leu
1 5 10 15
Ala Pro Tyr Ile Pro Gly Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro
20 25 30
<210> 145
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Arg
1 5 10 15
His Asp Ser Gly Leu Asp Ser Met Gly Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr
20 25 30
Ile Pro
<210> 146
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Gly Ser His Gly Phe Pro Pro Glu
20 25 30
Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu
35 40 45
Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn
50 55 60
Val Gly Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro
65 70 75
<210> 147
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Gly
20 25 30
Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro
35 40
<210> 148
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Gly Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp
20 25 30
Ser Met Gly Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro
35 40
<210> 149
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Gly Ser His Gly Phe Pro Pro Glu
20 25 30
Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu
35 40 45
Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn
50 55 60
Val Gly Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro
65 70 75
<210> 150
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
Met Gly Glu Ser Leu Phe Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser
1 5 10 15
Ser Thr Ile Cys His Leu Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser
20 25 30
Leu Tyr Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu
35 40 45
Phe Arg Arg Asn Asn Gly Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val
50 55 60
Phe Lys Val Lys Asn Thr Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly
65 70 75 80
Arg Asp Met Ile Ile Ile Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro
85 90 95
Gln Lys Leu Lys Phe Arg Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu
100 105 110
Val Thr Thr Asn Phe Gln Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp
115 120 125
Thr Ser Cys Thr Phe Pro Ser Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp
130 135 140
Ile Gln Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg
145 150 155 160
Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr
165 170 175
Asn Asn Tyr Phe Thr Ser Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr
180 185 190
Asn Gln Glu Ala Gln Gln Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp
195 200 205
Ser Val Leu Trp Gly Gly His Lys Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu
210 215 220
Pro Phe Gln Pro Val Lys Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn
225 230 235
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
tcattacaaa caagcacttg 20
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
taggcatgcg aataattatc 20
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
ccacatcgct cagacaccat 20
<210> 154
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
ggcaacaata tccactttac cagagt 26
<210> 155
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggatctg gagcattggc cccctacatt 60
cca 63
<210> 156
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggatctg gagatcgcca cgattcaggg 60
ctcgattcca tg 72
<210> 157
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggaggag gatccagcca tggcttcccg 60
ccggaggtgg aggagcagga tgatggcacg ctgcccatgt cttgtgccca ggagagcggg 120
atggaccgtc accctgcagc ctgtgcttct gctaggatca atgtg 165
<210> 158
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggatctg gagaaaacct ctattttcag 60
tcaggtagtg gtgcattggc cccctacatt cca 93
<210> 159
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggatctg gagaaaacct ctattttcag 60
tcaggtagtg gtgatcgcca cgattcaggg ctcgattcca tg 102
<210> 160
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggaggag gatccgaaaa cctctatttt 60
cagtcaggta gtggtagcca tggcttcccg ccggaggtgg aggagcagga tgatggcacg 120
ctgcccatgt cttgtgccca ggagagcggg atggaccgtc accctgcagc ctgtgcttct 180
gctaggatca atgtg 195
<210> 161
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggatctg gagcattggc cccctacatt 60
ccaggtagtg gtgcccttgc accatatatc ccc 93
<210> 162
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggatctg gagatcgcca cgattcaggg 60
ctcgattcca tgggatctgg agcattggcc ccctacattc ca 102
<210> 163
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggaggag gatccagcca tggcttcccg 60
ccggaggtgg aggagcagga tgatggcacg ctgcccatgt cttgtgccca ggagagcggg 120
atggaccgtc accctgcagc ctgtgcttct gctaggatca atgtgggatc tggagcattg 180
gccccctaca ttcca 195
<210> 164
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggatctg gagaaaacct ctattttcag 60
tcaggtagtg gtgcattggc cccctacatt ccaggtagtg gtgcccttgc accatatatc 120
ccc 123
<210> 165
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggatctg gagaaaacct ctattttcag 60
tcaggtagtg gtgatcgcca cgattcaggg ctcgattcca tgggtagtgg tgcccttgca 120
ccatatatcc cc 132
<210> 166
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggaggag gatccgaaaa cctctatttt 60
cagtcaggta gtggtagcca tggcttcccg ccggaggtgg aggagcagga tgatggcacg 120
ctgcccatgt cttgtgccca ggagagcggg atggaccgtc accctgcagc ctgtgcttct 180
gctaggatca atgtgggtag tggtgccctt gcaccatata tcccc 225
<210> 167
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ala Leu
1 5 10 15
Ala Pro Tyr Ile Pro Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp Ser Met
20 25 30
<210> 168
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Ser
1 5 10 15
His Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu Pro
20 25 30
Met Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala Cys
35 40 45
Ala Ser Ala Arg Ile Asn Val Gly Ser Gly Ala Leu Ala Pro Tyr Ile
50 55 60
Pro
65
<210> 169
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggatctg gagcattggc cccctacatt 60
ccagatcgcc acgattcagg gctcgattcc atg 93
<210> 170
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
ggttctggtg gtgagaatct gtacttccaa ggtggaggag gatccagcca tggcttcccg 60
ccggaggtgg aggagcagga tgatggcacg ctgcccatgt cttgtgccca ggagagcggg 120
atggaccgtc accctgcagc ctgtgcttct gctaggatca atgtgggatc tggagcattg 180
gccccctaca ttcca 195