一种基于无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法

技术领域：

本发明属于哈维弧菌技术领域，具体涉及一种基于有机物无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法。

背景技术：

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖生物的重要条件致病菌，对海水养殖产业造成了巨大的危害。在近几年对南方养殖海水鱼病害调查中发现，海水鱼类弧菌病约90％为哈维弧菌所致，哈维弧菌的危害范围和程度已逐渐取代了溶藻弧菌和创伤弧菌，成为主要的病原弧菌。因此，阐明其致病机制并制备相关疫苗，进行免疫防控迫在眉睫。

致病机制研究以及减毒活疫苗等的研发通常涉及基因敲除的基因工程操作。目前，对于哈维弧菌的基因敲除工作，Teo JW、Bassler BL、Rattanama P等大多数研究者采用转座突变，转座突变的优点是可以对基因组上的任意基因位点进行随机突变，但是其缺点是具有随机性、工作量大、不能定向突变某一确定基因，并且易产生极性效应。而传统的使用大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细菌携带外源基因，并与受体菌的接合转移实现外源载体进入细胞内，并进一步发生同源重组进行定点基因敲除的方法，在哈维弧菌中因大多数菌株不能成功接合转移，而受到阻碍，这限制了该菌的遗传学的研究。

基于以上问题，本专利发明了一种使得哈维弧菌接合转移效率从无到有发生质变的方法，并对其加以应用，成功进行哈维弧菌进行定点基因敲除，这对未来哈维弧菌基因工程改造，研究其致病机制，具有十分重要的意义。

发明内容：

本发明针对因哈维弧菌的接合转化不成功从而难以进行基因敲除的难题，提供了一种基于无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法，该方法通过对接合受体菌哈维弧菌进行有机物无水乙醇或十二烷基磺酸钠处理，使得接合转化效率从无到有，发生质变，开辟了哈维弧菌同源重组定点基因敲除平台。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种基于无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激提高哈维弧菌遗传转化的方法，其是将哈维弧菌经过无水乙醇或者十二烷基磺酸钠刺激处理后再用于遗传转化的受体菌。

所述的将哈维弧菌经过无水乙醇或者十二烷基磺酸钠刺激处理是在含有哈维弧菌的培养液中加入无水乙醇或者十二烷基磺酸钠进行刺激。

所述的无水乙醇，其在含有哈维弧菌的培养液中的终浓度为体积分数2～20％，所述的十二烷基磺酸钠，其在含有哈维弧菌的培养液的终浓度为0.14mM～0.70mM，刺激时间为5-20min。

进一步优选，所述的无水乙醇，其在含有哈维弧菌的培养液中的终浓度为体积分数12％，刺激时间为10min，所述的十二烷基磺酸钠，其在含有哈维弧菌的培养液中的终浓度为0.56mM，刺激时间为10min。

本发明的第二个目的是提供一种基于无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法，其包括以下步骤：

将哈维弧菌作为受体菌，与供体菌进行接合转移，经同源重组实行哈维弧菌的基因敲除，所述的哈维弧菌是经过无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激处理的哈维弧菌。

优选，是将培养至对数早期的哈维弧菌受体菌经无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激处理后，用新鲜培养基洗涤后与培养至对数生长期早期的供体菌进行混匀，离心去上清，菌沉淀后重悬，点种至固体平板上，接合过夜，对哈维弧菌进行基因敲除。

优选，所述的经过无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激处理是在含有哈维弧菌的培养液中加入无水乙醇或十二烷基磺酸钠进行刺激。

优选，所述在含有哈维弧菌的培养液中加入无水乙醇或十二烷基磺酸钠进行刺激，无水乙醇在含有哈维弧菌的培养液中的终浓度为体积分数2～20％，所述的十二烷基磺酸钠，其在含有哈维弧菌的培养液中的终浓度为0.14mM～0.70mM，刺激时间为5-20min。

优选，所述的无水乙醇，其在含有哈维弧菌的培养液中的终浓度为体积分数12％，刺激时间为10min，所述的十二烷基磺酸钠，其在含有哈维弧菌的培养液中的终浓度为0.56mM，刺激时间为10min。

优选，所述的结合转移是在28℃接合过夜，所述的供体菌为携带有待缺失片段上下游同源臂的重组自杀质粒的供体菌。

本发明具有以下优点：

(1)本发明基于有机物无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法，该方法在传统的接合转移法的技术基础上，通过对接合受体菌哈维弧菌进行有机物无水乙醇或者十二烷基磺酸钠的刺激处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，成功对哈维弧菌进行基因敲除；

(2)本发明基于两次同源重组原理进行哈维弧菌的定点基因敲除，操作简单，在接合转化过程对受体菌进行有机物无水乙醇或者十二烷基磺酸钠的刺激处理，使得接合转化效率从无到有，发生质变，开辟了哈维弧菌同源重组定点基因敲除平台，同时，该方法不同于传统的转座插入突变，该方法目的明确，不易产生极性效应，且不引入外源基因，使对目的基因的功能分析更为准确。

附图说明

图1为实施例1和2中分别基于有机物无水乙醇和十二烷基磺酸钠刺激处理的定点基因敲除流程图，其中geneD为待突变基因，D1：UP为待突变基因上游同源臂，D2：DOWN为待突变基因下游同源臂；

图2为实施例1中hsdM(CU052_17285)上下游同源臂的电泳检测结果图，其中泳道M为DL2000 DNA marker，泳道1为hsdM(CU052_17285)上游同源臂扩增结果，泳道2为hsdM(CU052_17285)下游同源臂扩增结果，其他泳道则为其他实验结果；

图3为实施例1和实施例2中pSW7848线性化片段的电泳检测结果图，其中泳道M为DL10000 DNA marker，泳道1为pSW7848线性化扩增结果；

图4为实施例1中重组子电泳检测结果图，其中泳道M为DL10000 DNA marker，泳道1为重组子PCR检测结果；

图5为实施例1中哈维弧菌hsdM(CU052_17285)突变株电泳检测结果图，其中泳道M为DL2000 DNA marker，泳道1为野生株PCR检测结果，泳道2为突变株扩增结果，其他泳道则为其他实验结果；

图6为实施例2中hsdR(CU052_17265)上下游同源臂的电泳检测结果图，其中泳道M为DL2000 DNA marker，泳道1为hsdR(CU052_17265)上游同源臂扩增结果，泳道2为hsdR(CU052_17265)下游同源臂扩增结果，其他泳道则为其他实验结果；

图7为实施例2中重组子电泳检测结果图，其中泳道M为DL10000 DNA marker，泳道1为重组子PCR检测结果；

图8为实施例2中哈维弧菌hsdR(CU052_17265)突变株电泳检测结果图，其中泳道M为DL5000 DNA marker，泳道1为野生株PCR检测结果，泳道2为突变株扩增结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

本发明所述重组子中间宿主E.coliΠ3813(其可编码pir蛋白，且为2’-Deoxythymidine(Thy)营养缺陷型)及自杀质粒pSW7848(为低拷贝质粒，携带氯霉素抗性，具有需要pir蛋白的R6K复制起始点，转移起始点oriT，以及受阿拉伯糖诱导的毒性基因ccdB)来自法国国家科学研究院巴斯德研究所Didier Mazel教授馈赠，供体菌E.coliGEB883(其可编码pir蛋白，且为2,6-Diaminopimelic acid(DAP)营养缺陷型，并且可编码RP4，用于接合转移)来自巴黎十一大学Annick JACQ教授馈赠；具有氯霉素抗性的表达质粒pSCT32由青岛农业大学陈师勇教授赠送；同源臂及质粒线性化扩增所用DNA聚合酶为Takara公司的高保真酶

(1)E.coliΠ3813的来源参见文献:Le Roux,F.,Binesse,J.,Saulnier D,MazelD.,2007.Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking themetalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicidevector.Appl Environ Microbiol.73,777-784.

(2)自杀质粒pSW7848的来源参见文献:Val,M-E.,Skovgaard,O.,Ducos-Galand,M.,Bland,M.J.,Mazel,D.,2012.Genome engineering in Vibrio cholerae:a feasibleapproach to address biological issues.PLoS Genet.8,e1002472.

(3)E.coli GEB883的来源参见文献:Nguyen,A.N.,Disconzi,E.,Charrière,G.M.,Destoumieux-Garzón,D.,Bouloc,P.,Le Roux,F.,Jacq,A.,2018.csrB geneduplication drives the evolution of redundant regulatory pathways controllingexpression of the major toxic secreted metalloproteases in Vibriotasmaniensis LGP32.mSphere.3,e00582-00518.

(4)表达质粒pSCT32的来源参见文献:Zhang,Y.J.,Chen,G.,Lin,H.,Wang,P.,Kuang,B.,Liu,J.,Chen,S.,2017.Development of a regulatable expression systemfor the functional study of Vibrio vulnificus essential genes.Antonie vanLeeuwenhoek,110(4),607-614.

以下实施例用到的培养基具体如下：

所述的配置添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP(2,6-Diaminopimelic acid)的LB固体平板是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉15g/L、溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入20μg/mL氯霉素(终浓度)以及0.3mM DAP(终浓度)。

所述的添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP的LB液体培养基是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入20μg/mL氯霉素(终浓度)以及0.3mM DAP(终浓度)。

所述的配置LBS固体平板是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 30g/L、琼脂粉15g/L，其余为水，其配制方法是将各组分按其含量混合均匀，灭菌即得。

所述的LBS液体培养基是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 30g/L，其余为水，其配制方法是将各组分按其含量混合均匀，灭菌即得；

所述的LBS+0.3mM DAP固体平板中是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl30g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入DAP，使其终浓度为0.3mM DAP。

所述的LBS+34μg/mL Cm+0.2％D-glμcose固体平板中是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 30g/L、琼脂粉15g/L、溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入34μg/ml氯霉素(终浓度)以及0.2％D-glμcose(终浓度，质量分数)。

所述的LBS+0.2％arabinose固体平板中含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl30g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入0.2％arabinose(终浓度，质量分数)。

所述的LBS+34μg/mL Cm+0.2％arabinose固体平板中是含有酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 30g/L、琼脂粉15g/L、溶剂为水，将各组分按其含量混合均匀，灭菌，然后再加入34μg/mL氯霉素以及0.2％arabinose(终浓度，质量分数)。

一般性说明：

一、大肠杆菌E.coliΠ3813或者E.coli GEB883感受态细胞的制备

(1)E.coliΠ3813或者E.coli GEB883划线至添加0.3mM Thy或者0.3mM DAP的LB固体平板上，于37℃培养过夜；

(2)挑取E.coliΠ3813或者E.coli GEB883单克隆至添加0.3mM Thy或者0.3mMDAP的LB液体培养基中，于37℃、200rpm培养过夜；

(3)1mL过夜菌液稀释至100mL添加0.3mM Thy或者0.3mM DAP的LB液体培养基，于37℃、200rpm培养至OD600nm＝0.6～0.8；

(4)菌液置于冰上冷却10min，于4℃，4000rpm离心15min；

(5)去上清，菌沉淀用50mL灭菌冷却的50mM的CaCl

(6)菌液于4℃，4000rpm离心15min；

(7)去上清，菌沉淀用2.5mL灭菌冷却的含有25％甘油的50mM的CaCl

(8)重悬的细胞用灭菌的1.5mL离心管分装100μL/管，置于-80℃，待用。由此得到大肠杆菌E.coliΠ3813或者E.coli GEB883感受态细胞。

二、等温组装液或者阳性重组质粒转化入大肠杆菌E.coliΠ3813或者E.coliGEB883感受态细胞以及表达质粒pSCT32转化入大肠杆菌E.coli GEB883感受态细胞

(1)取100μLE.coliΠ3813或者E.coli GEB883感受态细胞于冰上融化；

(2)5.0μL等温组装液或阳性重组质粒或表达质粒pSCT32加入到100μL感受态细胞中，轻柔混匀，冰上孵育20min；

(3)42℃热击2min，立即置于冰上孵育2min；

(4)加入1mL添加0.3mM Thy或者0.3mM DAP的LB液体培养基，于37℃、150rpm振摇培养1h；

(5)取100μL菌液涂布在添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM Thy或者0.3mM DAP的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜，直至克隆长出；

(6)用牙签挑取单克隆培养至添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM Thy或者0.3mM DAP的LB液体培养基中，待菌体长出后，PCR检测，并用灭菌的15％的甘油冻存阳性克隆在灭菌冻存管中，-80℃保存待用。

实施例1

以基因hsdM(type I restriction enzyme,M subunit)为例说明基于有机物无水乙醇的刺激对哈维弧菌实现定点基因敲除的步骤(图1)。

hsdM基因(SEQ ID NO.1)ORF全长1500bp，可编码499个氨基酸组成的I型限制修饰系统M亚基HsdM。HsdM是I型限制修饰系统的特异性决定簇(host specificitydeterminant，hsd)之一，负责对非甲基化核苷酸序列进行甲基化修饰酶切(Modificationsubunit，M)，被报道对细菌水平基因转移具有一定的调控作用。

本研究中获得的hsdM基因敲除株为深入研究hsdM基因功能提供了前提，而该基因功能的阐明有助于进一步分析哈维弧菌的水平基因转移调控机制，同时可能作为进一步提高哈维弧菌接合转移效率的潜在靶点。

(1)确定待突变基因hsdM的上下游序列以及自杀质粒pSW7848的插入位点，利用NEB在线软件(http://nebμilder.neb.com/)设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到上游同源臂扩增引物对hsdM-UP-F1/R1、下游同源臂扩增引物对hsdM-DOWN-F1/R1，自杀质粒线性化引物对pSW7848-F/R，重组子质粒检测引物对pSW7848-check-F/R及待突变基因缺失检测引物对hsdM-Del-check-F1/R1；

所述的PCR引物序列如下：

hsdM-UP-F1：aagcttgatatcgaattcgcagattgaaacttcctatatg

hsdM-UP-R1：ccaaggatgagatctatgacatctatcagaag

hsdM-DOWN-F1：atagatctcatccttggtttctgcaaac

hsdM-DOWN-R1：ttggtaacgaatcagaccagaagctttaaacgctc

pSW7848-F：gtctgattcgttaccaattatgacaac

pSW7848-R：gaattcgatatcaagcttatcgatac

pSW7848-check-F：tcactgtcccttattcgcacc

pSW7848-check-R：ctgcttttgagcactacccg

hsdM-Del-check-F1：catgttctgcttgctcaagtg

hsdM-Del-check-R1：cacgggtcctattgatgctt

(2)提取哈维弧菌基因组为模板，基于引物对hsdM-UP-F1/1R和hsdM-DOWN-F1/R1，利用PCR技术获取1003bp的上游同源臂片段UP及1008bp下游同源臂片段DOWN(hsdM(CU052_17285)基因ORF及其上下游序列的如SEQ ID NO.1，如图2所示)，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

所述的PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25.0μL，上游引物F(10μM)2.0μL，下游引物R(10μM)2.0μL，基因组模板(20ng/μL)2.0μL，用ddH

所述的PCR扩增程序如下：

98℃预变性30sec；98℃变性10sec，50℃5sec，72℃5sec，35个循环；72℃延伸7min。

(3)以自杀质粒pSW7848为模板，基于引物对pSW7848-F/R，利用PCR技术获取长度为3309bp的质粒线性化片段(如图3所示)，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25.0μL，上游引物F(10μM)2.0μL，下游引物R(10μM)2.0μL，质粒模板(1ng/μL)2.0μL，用ddH

PCR扩增程序如下：

98℃预变性30sec；98℃变性10sec，53℃15sec，72℃17sec，35个循环；72℃延伸7min。

(4)利用商品化多片段无缝克隆试剂盒ClonExpress MultiS One Step CloningKit将步骤(2)获得的上下游同源臂与步骤(3)获得的质粒片段进行等温组装；

(5)将等温组装液转化入大肠杆菌Escherichia coliΠ3813感受态细胞，基于引物对pSW7848-check-F/R，利用PCR检测后获得阳性重组子pSW7848-△hsdM(hsdM(CU052_17285)基因上下游同源臂与自杀质粒线性化片段等温组装后的重组子序列如SEQ IDNO.2)，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，长度为2295bp(如图4所示)；

PCR扩增体系如下：

2×Premix Taq

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃30sec，72℃2.5min，35个循环；72℃延伸10min。

(6)提取阳性重组质粒pSW7848-△hsdM转化入大肠杆菌E.coli GEB883感受态细胞，得到携带了重组子的pSW7848-△hsdM-E.coli GEB883，并以其作为接合供体菌；

(7)将供体菌pSW7848-△hsdM-E.coli GEB883划线于添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP(2,6-Diaminopimelic acid)的LB固体平板上，于37℃过夜培养活化；

(8)挑取(7)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至对数早期OD600nm＝0.3～0.7；

(9)配置LBS固体平板，对受体菌哈维弧菌进行28℃下过夜培养活化；

(10)挑取(9)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加LBS液体培养基中，28℃、200rpm培养至对数早期OD600nm＝0.3～0.7；

(11)移液器移取0.5mL(10)中准备好的受体菌哈维弧菌至1.5mL无菌离心管中，加入终浓度为体积分数12％的无水乙醇，处理10min，并用新鲜的LBS培养基洗涤4次后与(8)中准备好的0.5mL供体菌混匀，于6000rpm、室温离心3min；

(12)去上清后，菌沉淀用50μL LBS液体培养基重新，点种到LBS+0.3mM DAP固体平板，于28℃培养过夜；

(13)用接菌环刮取过夜接合菌斑，重悬于1mL LBS液体培养基中，11,000rpm、室温离心2min离心，去上清，菌体沉淀用1mL LBS液体培养基重悬；

(14)11,000rpm、2min离心，去上清，菌体沉淀用0.1mL LBS液体培养基重悬，并涂布在LBS+34μg/mL Cm+0.2％D-glucose平板上，28℃倒置培养至克隆长出；

(15)发生第一次同源重组的接合克隆在相同平板上纯化两次；

(16)接合克隆划线至LBS+0.2％arabinose固体平板上，接合克隆发生第二次同源重组，载体离开受体菌染色体，从而离开受体菌；

(17)重组克隆在LBS+0.2％arabinose平板上纯化，同时划线至LBS+34μg/ml Cm+0.2％arabinose平板上检测其是否具有Cm抗性；

(18)基于引物对hsdM-Del-check-F1/R1对阿拉伯糖抗性，氯霉素敏感性克隆进行PCR检测，获得突变株△hsdM-哈维弧菌，同时以野生株V.harveyi 345的DNA为模板，PCR扩增进行对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，野生株长度为1400bp，突变株长度为428bp(如图5所示)。

PCR扩增体系如下：

2×Premix Taq

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃30sec，72℃3.0min，35个循环；72℃延伸10min。

实施例2

以基因hsdR(type I restriction enzyme,R subunit)为例说明基于有机物十二烷基磺酸钠的刺激对哈维弧菌实现定点基因敲除的步骤(图1)。

hsdR基因(SEQ ID NO.3)ORF全长3063bp，可编码1020个氨基酸组成的I型限制修饰系统R亚基HsdR。HsdR是I型限制修饰系统的特异性决定簇(host specificitydeterminant，hsd)之一，负责对非甲基化及错误甲基化核苷酸序列进行酶切(Restrictionsubunit，R)，被报道对细菌水平基因转移具有一定的调控作用。

本研究中获得的hsdR基因敲除株为深入研究hsdR基因功能提供了前提，而该基因功能的阐明有助于进一步分析哈维弧菌的水平基因转移调控机制，同时可能作为进一步提高哈维弧菌接合转移效率的潜在靶点。

(1)确定待突变基因hsdR的上下游序列以及自杀质粒pSW7848的插入位点，利用NEB在线软件(http://nebμilder.neb.com/)设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到上游同源臂扩增引物对hsdR-UP-F1/R1、下游同源臂扩增引物对hsdR-DOWN-F1/R1，自杀质粒线性化引物对pSW7848-F/R，重组子质粒检测引物对pSW7848-check-F/R及待突变基因缺失检测引物对hsdR-Del-check-F1/R1；

所述的PCR引物序列如下：

hsdR-UP-F1：aagcttgatatcgaattcgctacgggaagtgttgaaattc

hsdR-UP-R1：ttgatgttggccaaagatactgtgcaagc

hsdR-DOWN-F1：tctttggccaacatcaaaccacgaag

hsdR-DOWN-R1：ttggtaacgaatcagacgttcaactaatccatacattaattg

pSW7848-F：gtctgattcgttaccaattatgacaac

pSW7848-R：gaattcgatatcaagcttatcgatac

pSW7848-check-F：tcactgtcccttattcgcacc

pSW7848-check-R：ctgcttttgagcactacccg

hsdR-Del-check-F1：gaatctctcttgggccactg

hsdR-Del-check-R1：cgaacaaaccgtcacagaaa

(2)提取哈维弧菌基因组为模板，基于引物对hsdR-UP-F1/R1和hsdR-DOWN-F1/R1，利用PCR技术获取996bp的上游同源臂片段UP及1005bp下游同源臂片段DOWN(hsdR(CU052_17265)基因ORF及其上下游序列如SEQ ID NO.3，如图6所示)，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

所述的PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25.0μL，上游引物F(10μM)2.0μL，下游引物R(10μM)2.0μL，基因组模板(20ng/μL)2.0μL，用ddH

所述的PCR扩增程序如下：

98℃预变性30sec；98℃变性10sec，55℃(上游同源臂扩增)或者50℃(下游同源臂扩增)5sec，72℃5sec，35个循环；72℃延伸7min。

(3)以自杀质粒pSW7848为模板，基于引物对pSW7848-F/R，利用PCR技术获取长度为3309bp的质粒线性化片段(如图3所示)，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

PCR扩增体系如下：

2×PrimeSTAR Max Premix 25.0μL，上游引物F(10μM)2.0μL，下游引物R(10μM)2.0μL，质粒模板(1ng/μL)2.0μL，用ddH

PCR扩增程序如下：

98℃预变性30sec；98℃变性10sec，53℃15sec，72℃17sec，35个循环；72℃延伸7min。

(4)利用商品化多片段无缝克隆试剂盒ClonExpress MultiS One Step CloningKit将步骤(2)获得的上下游同源臂与步骤(3)获得的质粒片段进行等温组装；

(5)将等温组装液转化入大肠杆菌Escherichia coliΠ3813感受态细胞，基于引物对pSW7848-check-F/R，利用PCR检测后获得阳性重组子pSW7848-△hsdR(hsdR(CU052_17265)基因上下游同源臂与自杀质粒线性化片段等温组装后的重组子序列如SEQ IDNO.4)，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，长度为2259bp(如图7所示)；

PCR扩增体系如下：

2×Premix Taq

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃30sec，72℃2.5min，35个循环；72℃延伸10min。

(6)提取阳性重组质粒pSW7848-△hsdR转化入大肠杆菌E.coli GEB883感受态细胞，得到携带了重组子的pSW7848-△hsdR-E.coli GEB883，并以其作为接合供体菌；

(7)将供体菌pSW7848-△hsdR-E.coli GEB883划线于添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP(2,6-Diaminopimelic acid)的LB固体平板上，于37℃过夜培养活化；

(8)挑取(7)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加有20μg/mL氯霉素和0.3mM DAP的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至对数早期OD600nm＝0.3～0.7；

(9)配置LBS固体平板，对受体菌哈维弧菌进行28℃下过夜培养活化；

(10)挑取(9)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加LBS液体培养基中，28℃、200rpm培养至对数早期OD600nm＝0.3～0.7；

(11)移液器移取0.5mL(10)中准备好的受体菌哈维弧菌至1.5mL无菌离心管中，加入终浓度为0.56mM的十二烷基磺酸钠，处理10min，并用新鲜的LBS培养基洗涤4次后与(8)中准备好的0.5mL供体菌混匀，于6000rpm、室温离心3min；

(12)去上清后，菌沉淀用50μL LBS液体培养基重新，点种到LBS+0.3mM DAP固体平板，于28℃培养过夜；

(13)用接菌环刮取过夜接合菌斑，重悬于1mL LBS液体培养基中，11,000rpm、室温离心2min离心，去上清，菌体沉淀用1mLLBS液体培养基重悬；

(14)11,000rpm、2min离心，去上清，菌体沉淀用0.1mL LBS液体培养基重悬，并涂布在LBS+34μg/mL Cm+0.2％D-glucose平板上，28℃倒置培养至克隆长出；

(15)发生第一次同源重组的接合克隆在相同平板上纯化两次；

(16)接合克隆划线至LBS+0.2％arabinose固体平板上，接合克隆发生第二次同源重组，载体离开受体菌染色体，从而离开受体菌；

(17)重组克隆在LBS+0.2％arabinose平板上纯化，同时划线至LBS+34μg/ml Cm+0.2％arabinose平板上检测其是否具有Cm抗性；

(18)基于引物对hsdR-Del-check-F1/R1对阿拉伯糖抗性，氯霉素敏感性克隆进行PCR检测，获得突变株△hsdR-哈维弧菌，同时以野生株V.harveyi 345的DNA为模板，PCR扩增进行对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，野生株长度为2960bp，突变株长度为428bp(如图8所示)。

PCR扩增体系如下：

2×Premix Taq

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃30sec，72℃3.0min，35个循环；72℃延伸10min。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。如可对受体菌哈维弧菌在2％～20％的无水乙醇或者0.14mM～0.70mM的十二烷基磺酸钠范围内处理5～20min，以对哈维弧菌中任何基因或者核苷酸片段进行敲除。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院机构南海水产研究所、三亚热带水产研究院

<120> 一种基于无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2982

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagattgaa acttcctata tgacgactcg tccaccatct ttgccggtat aaaaaaggat 60

ggtcgaactt cgagagaacc aaacttcaat tggttgttaa atcttatgct ataccctttc 120

tcattcttgt taatccatgc tttaccgtaa tagacacgaa aatggtcttc gaacacttga 180

atatcttgac catcaaccgc tacaaagaaa tcttgtatcg gcatagttcc ttcaccagga 240

acttgaatcg tcatcggctc attgtttagg aaagccgata ctagtgaaga tagcctgcgg 300

ctgggttgaa tctttcgctt gccatcttct gatgtagctg gacgtctagt ttttacatca 360

tcgctttggg ttaggtcatc gggttcttga acatcagggc gtttagcact tggcggactc 420

acatccaacc ttaccgcatt gtcaatatat tcatcagcat ctgaatagat atcatcttct 480

atagatctac gccttttgct cggttcaata tctttttgga tttcgcagga ttcacaatgc 540

tctcccacga tcttgtagta gggatctcgt ttccttctgt gcttaggttt atctaagttt 600

gcacaggtaa cttgtgcttc acagctctct ccgggacatt tgaacgcaaa ctttgaagat 660

ataacattct tatagcgtcc atccgcgtca ctggcactaa tgtttttttt gaggtccaat 720

gaataagctt tctctaattt catagctcaa agccttcttt aattagaagt gcttcaagtt 780

catgttctgc ttgctcaagt gccgataact ttttctgaaa atctttcaga gcctcttcga 840

cagaaatcgt ctcttcttct agcggctttt gtacataacg agcaatgtta aaattgaaat 900

cgttctcttc aatctcgcta tgtggcaccc aacgtgcaac accttcaatg tcgtctgcct 960

tagggccttt ggtacgcatc ttctgataga tgtcatagat ctcatcagct tgaggctctg 1020

ataaggtgtt ttgcgctcgg ccttttgtaa agatctcttc cgcattcaca atcagaacat 1080

ggtctttatg ctcttctggt cttgctttac gcaatacgag aatacaagca gggatgcctg 1140

taccgtagaa caggtttgaa gccacgccga ttaccgccac gatgcggttc tcttttaata 1200

gcttggttct gattttacct tcagcaccac cacggaaaag caccccgtgt ggcagtacta 1260

ccgccaatcg ccctttatca ttcaatgaag caaacatatg ctgcacccaa gcgaaatccc 1320

cgttcgtttt tggtgctaag ccaaagcttg ctcggccata aggatcactt gtccaataat 1380

catggcccca ctcttttaag ctgaatggtg ggttagcgat tacgcagtca aaatcttcta 1440

gtcggtcatt tttcaggaac ttaggatcac gaagtgtatc accacgaaca atttcaaagt 1500

cttcttgccc gtgtaggaac aagttcattc gagcaatcgc ttcagttgtc agattcttct 1560

cttgaccttt gattttaagt agacgtgggt cgccaccgtt ctctttaaca tggtgaatgg 1620

tttcaagcag cataccgcct gtaccacaag ccgggtcata aacactttca ttcgcttgcg 1680

ggtctagaat attaaccata agacgaacaa tagtacgtgg ggtatagaac tcgcctgctt 1740

tcttatttgc tttatcagca aagcgcttga tgaggtattc ataagcacgg cccatatcat 1800

cattacgcac actcgataca ccaaggttaa ccttgttgaa atggttgagt agtgtcgata 1860

acagttcatc tgatagacgc tctttgttgg tccagctcgc atcaccaaaa atgccatgca 1920

gctgtgggtt ttctagctca atgccacgga atgaatcttt tagggcttgg ccaatatcct 1980

tggtttctgc aaacacatct ttccaatgac agttagctgg aatttggatg cggtgaaaca 2040

tatcgctttt tgcaagctct tcgtcaccca cttgctccat cgcctcttcg aactcttcat 2100

cgtaaacatc acagatacgc ttaaagaata ggattgggaa gatgtaggtt ttgtagtctg 2160

aagcatcaat aggacccgtg attatatggg ccgcatgcca aaggtgtgct tctaagtctt 2220

tgagatttat taatgtcatt gcttgctctt attctcttct atctacgctt caaggtcttc 2280

acgtttgaag cgccaagaac caccgacttt gaaaccagga agctttcctt cgcttgctaa 2340

tctgtatgct gttttttcgg ccaactttag gtaagcagcc acctctttca aggttaaaat 2400

ttggtctacc attcagagtg ttatctcatg ttggttttat tcatcagaat taatggtgag 2460

agaatatggg aaaatcggat aatagacaat gacgaaggtt gtacttgcca gccaatagtc 2520

ttatcaaatt gataaaccta aagtgggctg agaactgctt cgatactaag cggtaaacga 2580

ggcgtacttt tacgcgattt aaagtgtgat cttcaatctc agttttacag tacctgacat 2640

acccacctaa ttcttcacat taccagtctt gcctttctta aaaaccatca ttattggcat 2700

taaaactacc aattgcgacc aattaacacc accatctacc actcttcata gagctgaaga 2760

ataagcgcct tgattcactt aattgctaga atctcctgtt atttggtcaa ggaatcggca 2820

gcaatgaatc cactgctaca agagcactca acacaagctt atcctcgaat tggtaaaatt 2880

tacgaaatcc attcagacaa atctcgcgtt aaagtcaatt ttcacgggaa tccaatcgga 2940

cagcctatat gggcgatcat aggtagagcg tttaaagctt ct 2982

<210> 2

<211> 5319

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caattgatat cgcgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattgggtac cagcgctttt 60

ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt ttcggtatat ccatcctttt 120

tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga ctttccttgg tgtatccaac 180

ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc gagcgggtgt tccttcttca 240

ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga ggctggccgg 300

cgtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcgcagat tgaaacttcc tatatgacga 360

ctcgtccacc atctttgccg gtataaaaaa ggatggtcga acttcgagag aaccaaactt 420

caattggttg ttaaatctta tgctataccc tttctcattc ttgttaatcc atgctttacc 480

gtaatagaca cgaaaatggt cttcgaacac ttgaatatct tgaccatcaa ccgctacaaa 540

gaaatcttgt atcggcatag ttccttcacc aggaacttga atcgtcatcg gctcattgtt 600

taggaaagcc gatactagtg aagatagcct gcggctgggt tgaatctttc gcttgccatc 660

ttctgatgta gctggacgtc tagtttttac atcatcgctt tgggttaggt catcgggttc 720

ttgaacatca gggcgtttag cacttggcgg actcacatcc aaccttaccg cattgtcaat 780

atattcatca gcatctgaat agatatcatc ttctatagat ctacgccttt tgctcggttc 840

aatatctttt tggatttcgc aggattcaca atgctctccc acgatcttgt agtagggatc 900

tcgtttcctt ctgtgcttag gtttatctaa gtttgcacag gtaacttgtg cttcacagct 960

ctctccggga catttgaacg caaactttga agatataaca ttcttatagc gtccatccgc 1020

gtcactggca ctaatgtttt ttttgaggtc caatgaataa gctttctcta atttcatagc 1080

tcaaagcctt ctttaattag aagtgcttca agttcatgtt ctgcttgctc aagtgccgat 1140

aactttttct gaaaatcttt cagagcctct tcgacagaaa tcgtctcttc ttctagcggc 1200

ttttgtacat aacgagcaat gttaaaattg aaatcgttct cttcaatctc gctatgtggc 1260

acccaacgtg caacaccttc aatgtcgtct gccttagggc ctttggtacg catcttctga 1320

tagatgtcat agatctcatc cttggtttct gcaaacacat ctttccaatg acagttagct 1380

ggaatttgga tgcggtgaaa catatcgctt tttgcaagct cttcgtcacc cacttgctcc 1440

atcgcctctt cgaactcttc atcgtaaaca tcacagatac gcttaaagaa taggattggg 1500

aagatgtagg ttttgtagtc tgaagcatca ataggacccg tgattatatg ggccgcatgc 1560

caaaggtgtg cttctaagtc tttgagattt attaatgtca ttgcttgctc ttattctctt 1620

ctatctacgc ttcaaggtct tcacgtttga agcgccaaga accaccgact ttgaaaccag 1680

gaagctttcc ttcgcttgct aatctgtatg ctgttttttc ggccaacttt aggtaagcag 1740

ccacctcttt caaggttaaa atttggtcta ccattcagag tgttatctca tgttggtttt 1800

attcatcaga attaatggtg agagaatatg ggaaaatcgg ataatagaca atgacgaagg 1860

ttgtacttgc cagccaatag tcttatcaaa ttgataaacc taaagtgggc tgagaactgc 1920

ttcgatacta agcggtaaac gaggcgtact tttacgcgat ttaaagtgtg atcttcaatc 1980

tcagttttac agtacctgac atacccacct aattcttcac attaccagtc ttgcctttct 2040

taaaaaccat cattattggc attaaaacta ccaattgcga ccaattaaca ccaccatcta 2100

ccactcttca tagagctgaa gaataagcgc cttgattcac ttaattgcta gaatctcctg 2160

ttatttggtc aaggaatcgg cagcaatgaa tccactgcta caagagcact caacacaagc 2220

ttatcctcga attggtaaaa tttacgaaat ccattcagac aaatctcgcg ttaaagtcaa 2280

ttttcacggg aatccaatcg gacagcctat atgggcgatc ataggtagag cgtttaaagc 2340

ttctgtctga ttcgttacca attatgacaa cttgacggct acatcattca ctttttcttc 2400

acaaccggca cgaaactcgc tcgggctggc cccggtgcat tttttaaata ctcgcgagaa 2460

atagagttga tcgtcaaaac caacattgcg accgacggtg gcgataggca tccgggtagt 2520

gctcaaaagc agcttcgcct gactaatgcg ttggtcctcg cgccagctta agacgctaat 2580

ccctaactgc tggcggaaaa gatgtgacag acgcgacggc gacaagcaaa catgctgtgc 2640

gacgctggcg atatcaaaat tgctgtctgc caggtgatcg ctgatgtact gacaagcctc 2700

gcgtacccga ttatccatcg gtggatggag cgactcgtta atcgcttcca tgcgccgcag 2760

taacaattgc tcaagcagat ttatcgccag cagctccgaa tagcgccctt ccccttgccc 2820

ggcgttaatg atttgcccaa acaggtcgct gaaatgcggc tggtgcgctt catccgggcg 2880

aaagaaaccc gtattggcaa atattgacgg ccagttaagc cattcatgcc agtaggcgcg 2940

cggacgaaag taaacccact ggtgatacca ttcgcgagcc tccggatgac gaccgtagtg 3000

atgaatctct cctggcggga acagcaaaat atcacccggt cggcagacaa attctcgtcc 3060

ctgatttttc accaccccct gaccgcgaat ggtgagattg agaatataac ctttcattcc 3120

cagcggtcgg tcgataaaaa aatcgagata accgttggcc tcaatcggcg ttaaacccgc 3180

caccagatgg gcgttaaacg agtatcccgg cagcagggga tcattttgcg cttcagccat 3240

acttttcata ctcccaccat tcagagaaga aaccaattgt ccatattgca tcagacattg 3300

ccgtcactgc gtcttttact ggctcttctc gctaacccaa ccggtaaccc cgcttattaa 3360

aagcattctg taacaaagcg ggaccaaagc catgacaaaa acgcgtaaca aaagtgtcta 3420

taatcacggc agaaaagtcc acattgatta tttgcacggc gtcacacttt gctatgccat 3480

agcattttta tccataagat tagcggatcc tacctgacgc tttttatcgc aactctctac 3540

tgtttctcca tacccgtttt tttggatgga gtgaaacgat gcagtttaag gtttacacct 3600

ataaaagaga gagccgttat cgtctgtttg tggatgtaca gagtgatatt attgacacgc 3660

ccgggcgacg gatggtgatc cccctggcca gtgcacgtct gctgtcagat aaagtctccc 3720

gtgaacttta cccggtggtg catatcgggg atgaaagctg gcgcatgatg accaccgata 3780

tggccagtgt gccggtctcc gttatcgggg aagaagtggc tgatctcagc caccgcgaaa 3840

atgacatcaa aaacgccatt aacctgatgt tctggggaat ataagagctc cagcttttgt 3900

tccctttagt gagggttaat tgcgcgcaat tcccatgtca gccgttaagt gttcctgtgt 3960

cactcaaaat tgctttgaga ggctctaagg gcttctcagt gcgttacatc cctggcttgt 4020

tgtccacaac cgttaaacct taaaagcttt aaaagcctta tatattcttt tttttcttat 4080

aaaacttaaa accttagagg ctatttaagt tgctgattta tattaatttt attgttcaaa 4140

catgagagct tagtacgtga aacatgagag cttagtacgt tagccatgag agcttagtac 4200

gttagccatg agggtttagt tcgttaaaca tgagagctta gtacgttaaa catgagagct 4260

tagtacgtga aacatgagag cttagtacgt actatcaaca ggttgaactg ctgatcttca 4320

gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg atcagatctg atatcgtcgc agaccaaaac 4380

gatctcaaga agatcatctt attaatcaga taaaatattt ctaggcacca ataactgcct 4440

taaaaaaatt acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc attaagcatt 4500

ctgccgacat ggaagccatc acaaacggca tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc 4560

accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc 4620

atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa 4680

aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta acacgccaca 4740

tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat 4800

gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact atcccatatc 4860

accagctcac cgtctttcat tgccatacga aattccggat gagcattcat caggcgggca 4920

agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag 4980

gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc 5040

tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt 5100

ttctccattt tagcttcctt agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa tacgcccggt 5160

agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcat 5220

tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg atttatttat 5280

tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt tattcggcg 5319

<210> 3

<211> 4533

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctacgggaa gtgttgaaat tcgccatgac agagcaagaa cgtttagaga atgaaggtct 60

aagagaacga cgtaaatcag attctccaag aaggcaagag caacaaaggc aaatgcgtat 120

gaacttagct gttttaaact caatgaaaga agaaatggtc acatagctat gtgacatttc 180

taacttgcgg tactatgtga cattttaaaa ttgttgcaac atcttcttct ttttgagctt 240

gacctactaa gctcacatat gctttatcaa ctttaatatc aaaagagact tttgttgaat 300

catcctcttc aaattcactt tcgatgacat aaccgttgtg acgcaagaat ttgcgtacca 360

aaccattttg gttaccagta gtagataaaa atattagtag cttcgccagc gacttgtcat 420

agtaaaaaca atctaggttt agtgcccttt tatcttttcg ttctgtgttt aagtaatgag 480

caaaacgttc cgaatagctt tcattttggc cagacgaaaa acacactacc ttaaattctt 540

cgtacagtga gccctttagt ttttcatcaa agatagactt taaaattgtt gatttaccag 600

agccattccc accgatgaaa gtagcaattt tgtcaaactt tagctcctgt ggttggtcat 660

gaaggacatt tggtggtaag ggaagtgaaa tagttgccat taataatgtt cctcaatata 720

accgtacgcc ttggcgaaca gctctttatc ttttcctaag ccaaactgag caagagtcag 780

tagcagcgcc ttttgaatct ctcttgggcc actgttcgag ctttgccaac ctttaaagcg 840

cttggctttt acaatcttat ctatctgctc tactacatca ccgattagct ttggtgtgct 900

ctcggggcga gtttctaaga acagttttgt tagtgcttgt ttgttatctt cttgagttac 960

tggtgaatcg cccgtttcac gttcggcttg cacagtatct ttggccgtat caagcagccc 1020

ttttaaccag tcgattgctt tgattacgcc tgcttcataa tcttggcgta acttttctaa 1080

gcgctcgccg agagcaatga acttcggatt accgctacca cgcaggcgcc ccattagatc 1140

gatttctaac tggcttgcgc gcttctcttg ctctttctca gtcaacgtga agatagcgtg 1200

ctcatccata accagctcat caatatcatc acgaatgcga ttaatatcag tatgttcgtg 1260

aatcatcttg atggtttctg gacctaacgc tgcccacacg agagagcctg tttgtcctac 1320

tgggcgaatt gattcataga tttgaaccag ccacttataa tcagctctgt aaggtgtaag 1380

gaaagcatct gggttaatcg cagtccataa cttagctaac actccgaaag aggctgcaaa 1440

ctcatcacgc ttctcattag tcggtaagca agcttgcgct gccatgatgc cttcaaagcc 1500

gtcgatagtt ctatcgacgt tagggaagaa gcttaaacac ttatctaact gagctggcag 1560

tagctctttt aaggcctcga taccttctac cacggcgtcg atctcttcag gatcgtaagc 1620

gagtgcggta cgcaagttct caaacacgcc taaataatca atgatgaggt ccatttgctt 1680

gctaacattg tccgtctcgt acaaacggtt agtgcgacac attgcttgca acaaagtatg 1740

gtcacgtaat ggcttatcta ggtacatgca gtaacagatc ggcgcgtcaa aaccagtcaa 1800

cagctttgcg gtaacaatca gcaattgaag tggttgtttt ggatctttgt aatcctcaat 1860

caggctcttc tgcttttggt cattaccatc aatctcttgc caacgttcaa agtcggactc 1920

tttgataggc agctcaaggt cttgcttcca tttacgccag tctttattga ccttaccttt 1980

cttactatca tcttcatctt tgatcggtgc ttggtcgacg ttcatgacca cttcaaccgc 2040

atcaaagcct agtttcttac caagtaagta atacatctga acgcaggcgt ctcggtcata 2100

gactacgacc atgcctttca tctgttttgg ctttacatgg cttacaaagt gattggcaat 2160

atcttcgctt actgccgcca ttcgtttagg cgccttcaac ataatcgcta agcggccagc 2220

acgtttagac aatgccattt tctcatcatc atccaggtcg ttgtctttga ccatttgttc 2280

aaaggcttca tcaatcgctg cacgatctac acgaagctca gccaaacgag gctcaaactt 2340

cactgcattg gtcgctttat ctcgtatgga ttgcttgtag ctgtagcggt tcatataacg 2400

cccttcatcc tcttcggcac caaagagttt gaaggtattg cggtcgatac cagaaatcgg 2460

cgtacctgtt aaaccataga agtgagcgtg aggtagcgcc cagcgcattt tgtcgccgag 2520

ggagccctct tgagtacggt gtgcttcatc caccagcacg ataatgttgt cacgactgtt 2580

tagaccgttt tcattgctct catcgatttc gacatcttta aacttgaaaa ctgtagtgat 2640

caaaatgccg cgactatctt gttctatgtg ctcgccaagc tttctacagc tttgtacttt 2700

gatgaggttt ttaacatctg ccccaccgaa ggtttcattg atttggctat cgagatctcg 2760

acggtctacc acaatcagta ctgtagggtt ttttaacttg ttatcagcac gaagcatacg 2820

agcggcatag agcataagta aggacttacc tgagccttgg aagtgccaga taagtccttt 2880

tttcggataa ccatttttta cacgctcaac aatttgtttt gcagcttcaa attgcggata 2940

acgcggcaat attttaatgc gtttaggtgg cgtgtcttta gctgtcttca ccgttgaaaa 3000

gagtgcaaat gactccaaca tttgaagcaa ggtttctgga ttcaacaatc cttcacagct 3060

atcaagtacg gtagctaaac ttgctggaat ttcatctcgc tgttcggttt tgtgccatgg 3120

accccagtct ttcactcgcg cattaattgc accataagca aaggtgcgtc cttcagaagc 3180

aaagcacaga aggtttggca cgaagaacgg ctcaacattt ttccaataat gcttttgacc 3240

acccataaaa tcagcagcgc catcttgcca agtcacactt ggacgagtag cggattttac 3300

ttcccccacc actagcggga taccgttcac gtaaagaacg atatcgaaaa acacttctgt 3360

tgcagcaatg aaatgaacct gctgagaaac aacaaaatgg ttgttttcag gggtatcaaa 3420

gtcaatcagc ttgatggtga tatggtcgcc attctcacca aatggtaggc ttttatctgc 3480

catcaaccat tcatgaaaat tctcattggc tttgactaag cctgtatgtt ttgcttccaa 3540

catcaaacca cgaagtctgt agatcacttc atcggcataa tcgcgattgt taccaatatc 3600

cgggtttaac gaacaaagcg cgtctttaag ccaggtatcg acgaaaatat cgtgagtttg 3660

cttgggtaag ctctcaccat ggcagtaatt ccactttact ccgcttaagc tttttaaacg 3720

gtcaataatc ccattttctg tgacggtttg ttcgttaaac atattaaaga gcctcaaata 3780

cttgcacttg cattttcttt agtttttctt tctttactga caattcatcc cttatttttt 3840

ctagattcct atataaacca aatatttcac cctgtttttc aagtggaatt tgaggaacta 3900

aacaagatag tatttctttt tttgataaat gaggaatatc cattcctttt tgctgagaca 3960

atagatgccc tttcacaaaa tgagaattca tcaaaaccca gagaaaatct gctgatattt 4020

ctttgaagtt gttgaaccta cctactcgct gaactaatag acttggtaga tcatctactc 4080

ctatcctact aaccttaaaa ccagagccga caaaagggcg atccattgca actattacat 4140

cgccttcatc aagcatgtag tccgaataat tctttgctat ttcatactga atacattttc 4200

tctcatcacc ccatacaggt ttacaaaccc caacatttgc gcctctaagc agtgaaatac 4260

catcttcaac aaagtctttg cttttaaaag gaaaccctac ctgcatatca accaaatcag 4320

atagtggaac taatttatga tctgtgttac caagtgcctc tgtggtgtaa gcggctatga 4380

ggttgattaa actacgctcc actgcataag cagtgttttc tacttcgata attttggttc 4440

caattttcgc aagagatttt tgtacctcta atggcggcaa aggaaattga tactcagaaa 4500

tatctttcca attaatgtat ggattagttg aac 4533

<210> 4

<211> 5310

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caattgatat cgcgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattgggtac cagcgctttt 60

ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt ttcggtatat ccatcctttt 120

tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga ctttccttgg tgtatccaac 180

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ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga ggctggccgg 300

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tgacagagca agaacgttta gagaatgaag gtctaagaga acgacgtaaa tcagattctc 420

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aaaattgttg caacatcttc ttctttttga gcttgaccta ctaagctcac atatgcttta 600

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