靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用。

背景技术

肺癌是威胁人类健康和生命的恶性肿瘤之一，其中大约85％的患者是非小细胞肺癌(NSCLC)。化学疗法是肺癌的主要治疗方法，铂类化学药物疗法已成为晚期NSCLC患者的标准治疗方法。但是，临床耐药性仍然是一个挑战，极大地阻碍了治疗效果。因此，对耐药机制的更全面的了解对NSCLC患者的治疗具有重要意义。

外泌体在肺癌的肿瘤发生中起重要作用。外泌体是晚期内体产生的膜结合囊泡，大小在40-160nm范围内，通过与质膜融合并从细胞释放到细胞外空间。外泌体包含不同的生物分子，包括各种类型的蛋白质、DNA和RNA，通过充当微环境中细胞通讯的信使而影响细胞功能。据报道，外泌体递送EphA2等蛋白能够增强胰腺癌的吉西他滨耐药性。因此，外泌体可能能够通过直接将生物分子转移到细胞或修饰微环境来影响细胞功能。

缺氧是大多数恶性肿瘤中常见的现象，被认为是肿瘤微环境中与肿瘤耐药性和肿瘤发生有关的复杂因素。这种现象是由于肿瘤血管的不规则或肿瘤血管距离过长引起的肿瘤细胞供氧不足。肿瘤细胞可以通过多种细胞机制适应这种不利的缺氧环境，从而使肿瘤细胞更具抵抗力和生存能力，这也是其发生化疗耐药的原因之一。其中重要的变化之一是葡萄糖代谢的改变，肿瘤细胞从氧化磷酸化到糖酵解的转变，以满足肿瘤细胞的能量需求，这种被称为Warburg效应的肿瘤代谢重编程被认为是肿瘤的标志特征。丙酮酸激酶M2型(PKM2)是Warburg效应的重要调节蛋白，近年来由于其在促进代谢重编程中的作用而受到广泛关注。PKM2通过催化由磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合成丙酮酸以促进缺氧糖酵解而参与Warburg效应，缺氧糖酵解有助于肿瘤细胞生长，从而导致肺癌的恶性表征。

缺氧肿瘤分泌的外泌体在肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用中起着重要的作用。据报道，缺氧肿瘤细胞的外泌体富含免疫抑制蛋白，可通过介导单核巨噬细胞的M2极化促进肿瘤进展。此外，缺氧可以增加外泌体的产生，从而促进肿瘤的细胞间通讯，这表明外泌体在缺氧肿瘤的恶性表型中发挥重要作用，包括化疗耐药性的发生。因此外泌体和PKM2对肿瘤耐药性的发生具有积极作用。

发明内容

鉴于外泌体和PKM2在缺氧条件下介导非小细胞肺癌化疗耐药性发生中的重要作用，本发明提供了干预PKM2或者外泌体中的PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种靶向外泌体PKM2的物质在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用，所述靶向外泌体PKM2的物质为PKM2抑制剂或含有靶向PKM2的shRNA序列的物质。

进一步地，提供含有PKM2敲低的shRNA的表达载体在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用。含有靶向PKM2的shRNA序列的物质可以干预PKM2的表达。

其中，含有靶向PKM2的shRNA序列的物质可以为含有靶向PKM2的shRNA序列的表达载体，或含有靶向PKM2的shRNA序列的慢病毒。

进一步地，靶向PKM2的shRNA序列的第一条核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示，第二条核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

进一步地，含有靶向PKM2的shRNA序列的表达载体为携带PKM2 shRNA序列的穿梭质粒。

进一步地，含有靶向PKM2的shRNA序列的慢病毒为：将穿梭质粒包装至慢病毒中获得的慢病毒，也称之为PKM2 shRNA慢病毒。

进一步地，提供PKM2的抑制剂在制备改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的药物上的应用。PKM2的抑制剂可以干预PKM2的活性。

本发明还提供靶向外泌体PKM2的物质和顺铂在制备非小细胞肺癌的药物上的应用，所述靶向外泌体PKM2的物质可以干预PKM2的表达或干预PKM2的活性，在同时使用顺铂的条件下能够增强细胞对顺铂的化疗敏感性。

本发明还提供评价靶向外泌体PKM2对非小细胞肺癌顺铂耐药性的影响的方法，包括以下步骤：

(1)构建PKM2过表达的真核表达载体；

(2)用步骤(1)得到的PKM2过表达载体转染至对顺铂敏感的非小细胞肺癌细胞中并培养；

(3)收集步骤(2)得到的PKM2过表达的细胞系培养后的培养液，通过超速离心法纯化外泌体，得到PKM2过表达的外泌体；

(4)构建两条PKM2敲低的shRNA表达载体，并包装至慢病毒中；

(5)用步骤(4)得到的PKM2 shRNA慢病毒感染至顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中并培养；

(6)收集步骤(5)得到的PKM2 shRNA敲低的耐药细胞系培养后的培养液，通过超速离心法纯化外泌体，得到PKM2敲低的外泌体；

(7)利用步骤(2)和步骤(5)得到的PKM2过表达和敲低的细胞系，同时施加顺铂处理，应用于评价PKM2对非小细胞肺癌顺铂耐药性的影响；

(8)利用步骤(3)和步骤(6)得到的PKM2过表达和敲低的外泌体，与正常的敏感细胞共培养，并施加顺铂处理，应用于评价外泌体携带的PKM2对非小细胞肺癌顺铂耐药性的影响。

进一步地，步骤(1)中所述的PKM2过表达的真核表达载体，所述的PKM2过表达的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，步骤(2)中所述的顺铂敏感的非小细胞肺癌细胞为A549细胞系。

优选的，步骤(5)中所述的顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞为A549经长时间低浓度顺铂诱导而来的A549/CR细胞系。

优选的，所述的A549细胞系，其培养液为90％DMEM基础培养基加10％的胎牛血清，培养条件为37℃、5％CO

优选的，所述的A549/CR细胞系，其培养液为90％DMEM基础培养基加10％的胎牛血清，鉴于肿瘤缺氧与耐药间的相关性，A549/CR细胞系的培养条件设置为37℃、5％CO

本发明还提供靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的方法，包括以下步骤：

将PKM2的shRNA或者PKM2抑制剂，与顺铂联合使用后，应用于抑制耐药细胞系的增殖，或者应用于抑制小鼠皮下肿瘤的生长。

进一步地，PKM2的shRNA通过抑制糖代谢相关基因的mRNA的转录、促进耐药细胞凋亡、增加耐药细胞中的活性氧水平，实现对耐药细胞的抑制作用。

优选地，糖代谢相关基因的mRNA的荧光定量PCR检测引物，其中：

PDK1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:7所示；

MYC的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:9所示；

GLUT1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

LDHA的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

CCND1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

本发明采用PKM2的过表达载体转染顺铂敏感的A549细胞系，并同时使用顺铂处理细胞，分析出PKM2的过表达能够提高A549细胞系的顺铂耐药性。在顺铂耐药的A549/CR细胞系中，通过PKM2 shRNA干预PKM2的表达，或者使用PKM2的抑制剂干预PKM2的活性，在同时使用顺铂的条件下能够增强细胞对顺铂的化疗敏感性，并在体外的细胞实验和体内的小鼠成瘤实验中均得到应用。

本发明通过PKM2 shRNA降低顺铂耐药的A549/CR细胞系中的PKM2表达，并提取其分泌的外泌体，利用PKM2敲低的外泌体处理耐药细胞，在同时使用顺铂的条件下能够增强细胞对顺铂的化疗敏感性。此外，PKM2敲低的外泌体还具有以下用途：

(1)抑制糖代谢相关基因GLUT1、MYC、CCND1、PDK1、LDHA的mRNA表达；

(2)抑制顺铂诱导下的A549/CR细胞凋亡；

(3)抑制顺铂诱导下的A549/CR细胞中活性氧的产生。

基于丙酮酸激酶M2型(PKM2)在顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中的表达高于敏感细胞，本发明通过在耐药细胞中干扰PKM2基因，增加顺铂耐药细胞内活性氧的水平并诱导细胞凋亡，实现对耐药细胞治疗的增敏作用，具有重要的临床应用价值。

与现有技术相比，本发明的靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用，具有以下有益效果：

(1)使用shRNA敲低PKM2的含量，增强对耐药非小细胞肺癌细胞的顺铂治疗敏感性；

(2)使用抑制剂降低PKM2的活性，增强对耐药非小细胞肺癌细胞的顺铂治疗敏感性；

(3)使用PKM2敲低的外泌体，增强对耐药非小细胞肺癌细胞的顺铂治疗敏感性。

附图说明

图1A为顺铂敏感的A549细胞系(A549/SEN)和顺铂耐药的A549/CR细胞系(A549/CR)在不同浓度顺铂处理下的细胞生长活力；

图1B为常氧和缺氧条件下顺铂敏感的A549细胞系对不同浓度顺铂的反应性；

图1C为常氧和缺氧条件下顺铂耐药的A549/CR细胞系对不同浓度顺铂的反应性；

图2A为过表达PKM2对顺铂敏感的A549细胞系的细胞增殖的影响；

图2B为两条shRNA分别敲低PKM2，检测其对顺铂耐药的A549/CR细胞系的细胞增殖的影响；

图3A为过表达PKM2对顺铂敏感的A549细胞系对不同浓度顺铂处理下的敏感性；

图3B为两条shRNA分别敲低PKM2对顺铂耐药的A549/CR细胞系的顺铂敏感性的影响；

图4A为顺铂敏感的A549细胞系分泌的外泌体(SENexo)、顺铂耐药的A549/CR细胞系分泌的外泌体(CRexo)、缺氧培养下顺铂耐药的A549/CR细胞系分泌的外泌体(hCRNexo)的电子显微镜图；

图4B为上述三个细胞系分泌的外泌体的粒径分析图；

图4C为上述三个细胞系分泌的外泌体的标志蛋白检测图；

图4D为上述三个细胞系分泌的外泌体中的PKM2表达量检测；

图5A为与上述三种外泌体共培养后的敏感细胞中PKM2表达变化；

图5B为与上述三种外泌体共培养后的敏感细胞中的代谢相关基因的mRNA的表达变化；

图5C为shRNA敲低PKM2后的外泌体影响耐药细胞的耐药性；

图5D为shRNA敲低PKM2后的外泌体影响代谢相关基因的mRNA的表达变化；

图6A为shRNA敲低PKM2后的外泌体影响耐药细胞凋亡；

图6B为shRNA敲低PKM2后的外泌体影响耐药细胞中凋亡相关蛋白的表达；

图6C为shRNA敲低PKM2后的外泌体影响耐药细胞中活性氧的含量；

图7A为PKM2抑制剂与顺铂联用后对顺铂耐药的A549/CR细胞系增殖的影响；

图7B为PKM2抑制剂与顺铂联用后在小鼠体内皮下肿瘤的抑制效果；

图7C为上述小鼠肿瘤体积测量图；

图7D为上述小鼠肿瘤重量测量图；

图7E为上述小鼠的肿瘤活体成像图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实验材料：人非小细胞肺癌细胞A549、H1299和PC9细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，DMEM基础培养基、胎牛血清、青链霉素购自Gibco公司，顺铂、PKM2抑制剂购自Selleck公司，顺铂耐药的A549/CR细胞系是将A549细胞系以递增浓度的顺铂处理10个月后得到的，CCK8试剂盒购自Bimake公司，质粒提取试剂盒购自Qiagen公司，RNA提取试剂盒购自Biomiga公司，反转录试剂和荧光定量PCR试剂购自南京诺唯赞生物公司，细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司，活性氧检测试剂盒购自南京建成生物制品研究所。

实施例1顺铂耐药细胞的诱导和缺氧条件下对顺铂耐受性检测

(1)以非小细胞肺癌细胞A549为亲本细胞株，每次传代培养时加入顺铂至终浓度2ng/ml，然后重复传代和加药至细胞基本适应无死亡时，逐级提高顺铂浓度，10个月后获得顺铂耐药的细胞株A549/CR。

(2)对敏感细胞A549和耐药细胞A549/CR的顺铂半数抑制率(IC50)进行检测，首先通过CCK8方法获得每种细胞在各个浓度下的存活率和抑制率，然后通过Graphpad Prism 7软件制作可变斜率的抑制剂量-响应曲线，计算出IC50值，结果见图1A。

(3)CCK8检测细胞存活率的方法为：将细胞以10

(4)将敏感细胞A549和耐药细胞A549/CR分别培养在常氧(20％O

实施例2敏感细胞中过表达PKM2并检测其细胞增殖

(1)将PKM2基因的编码序列(SEQ ID NO:1)克隆至pcDNA4TO-Flag载体上，经测序确认后获得过表达PKM2的质粒，质粒的提取按照试剂商的说明书进行。

(2)敏感细胞A549在6孔板中种植4×10

(3)通过克隆形成方法检测细胞增殖，具体方法为：敏感细胞A549在12孔板中种植200个细胞/孔，分别转染1μg的PKM2过表达质粒或对照空载质粒，处理14天。弃去培养液，加入200μl 4％多聚甲醛固定细胞，然后弃去液体，用0.1％结晶紫染液对细胞进行染色30min，最后用PBS洗去未结合的结晶紫，对染色的细胞进行拍照和计数，结果见图2A。

实施例3耐药细胞中敲低PKM2并检测其细胞增殖

(1)设计两条靶向PKM2的shRNA序列(shRNA序列#1为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，shRNA序列#2为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)，合成DNA片段并插入至LV3穿梭载体中，获得携带PKM2 shRNA序列的穿梭质粒。将穿梭质粒和包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)共同转染至293T细胞中，转染72小时后收集上清液中的慢病毒并测量病毒滴度。

(2)将携带PKM2 shRNA序列的慢病毒感染至耐药细胞A549/CR中，通过嘌呤霉素筛选获得稳定敲低PKM2的A549/CR细胞系。

(3)将稳定敲低PKM2的A549/CR细胞和对照细胞按每孔10

实施例4顺铂的药物敏感性检测

(1)在A549细胞中分别过表达对照空载和PKM2质粒，同时用1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml的顺铂处理48小时，通过CCK8的方法检测各个浓度下的细胞活力。结果见图3A，PKM2的过表达促进了A549细胞的顺铂耐药性。

(2)将稳定敲低PKM2的A549/CR细胞和对照细胞按每孔10

(3)稳定敲低PKM2的A549/CR细胞分泌的外泌体与A549细胞共同培养在96孔板中，同时用1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的顺铂处理48小时，通过CCK8的方法检测各个浓度下的细胞活力。结果见图5C，外泌体中的PKM2的敲低促进了A549细胞的顺铂敏感性。

实施例5顺铂耐药细胞的外泌体的提取与鉴定

(1)从A549、A549/CR和乏氧培养的A549/CR的去外泌体的条件培养基中获得外泌体。将培养上清液通过0.22μm过滤器过滤，在120,000g下离心90分钟，用PBS洗涤后，在120,000g再离心90分钟收集外泌体沉淀。最后将外泌体沉淀重悬于PBS中，并储存在-80℃冰箱。

(2)将外泌体重悬液滴在铜网，然后用50μl 1％戊二醛固定5分钟，将铜网上滴加醋酸双氧铀50μl，孵育5分钟，将多余的液体用滤纸吸收并干燥。通过透射电子显微镜(FEITecnai G2 Spirit TEM)观察外泌体图像，结果见图4A。

(3)将外泌体注射至ZetaView PMX仪器中测量外泌体的尺寸分布和浓度，结果见图4B，数据分析使用ZetaView 8.04.02软件进行。

(4)外泌体中的标志蛋白CD63和TSG101的表达是通过western blot检测的，结果见图4C。

实施例6western blot检测顺铂耐药外泌体和细胞中PKM2的表达

(1)10μg外泌体蛋白样本或者10μg与外泌体共培养后的细胞蛋白样本，通过SDS-PAGE电泳进行蛋白质凝胶分离，浓缩胶电压为80V，分离胶电压为120V。

(2)将蛋白凝胶转印至甲醇预处理后的PVDF膜上，转印条件为恒流240V，90min。

(3)PVDF膜在5％的脱脂牛奶中封闭1小时，然后在对应的一抗中4℃孵育过夜。PKM2和β-actin抗体购自Cell Signaling Technology公司，CD63和TSG101抗体购自Proteintech公司。

(4)1×TBST洗3次后，用对应二抗孵育1小时，最后通过凝胶成像系统显像。结果见图4D和图5A，耐药细胞外泌体中的PKM2高表达，并且耐药细胞外泌体被敏感细胞吸收后再次增强敏感细胞中的PKM2表达。

实施例7荧光定量PCR检测糖代谢相关基因的mRNA的表达

(1)提取外泌体(包括敏感细胞外泌体、耐药细胞外泌体和敲低PKM2的耐药细胞外泌体及相应对照组)处理后的A549细胞的RNA，按照试剂商的说明书进行，并对RNA进行定量。

(2)RNA经反转录为cDNA后，对糖代谢相关基因的表达进行荧光定量PCR检测，具体流程按照试剂商的说明书进行，检测基因PDK1引物序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，检测基因MYC引物序列为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，检测基因GLUT1引物序列为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，检测基因LDHA引物序列为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，检测基因CCND1引物序列为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。结果见图5B和图5D，耐药细胞分泌的外泌体能够增强糖代谢相关基因的mRNA的表达，而敲低PKM2的外泌体则可以恢复mRNA的表达。

实施例8外泌体和顺铂处理细胞后的细胞凋亡检测

(1)将敲低PKM2的耐药细胞外泌体及对照外泌体与A549/CR共培养，并用2μg/ml顺铂进行处理，检测处理前后细胞凋亡的情况，并用FlowJo软件进行数据分析。

(2)敲低PKM2的耐药细胞外泌体显著促进了顺铂诱导下的A549/CR细胞凋亡，同时经凋亡相关蛋白的western blot检测数据证实，结果如图6A和6B。

实施例9外泌体和顺铂处理细胞后的活性氧检测

(1)将敲低PKM2的耐药细胞外泌体及对照外泌体与A549/CR共培养，并用2μg/ml顺铂进行处理，按照试剂商的说明书，以DCFH-DA作为活性氧探针，检测处理前后细胞中活性氧的水平，并用FlowJo软件进行数据分析。

(2)敲低PKM2的耐药细胞外泌体显著促进了顺铂诱导下的活性氧产生，结果如图6C。

实施例10 PKM2抑制剂和顺铂对小鼠皮下耐药肿瘤的联合治疗

(1)A549/CR耐药细胞接种至96孔板，分别与20μg/ml顺铂、2μM PKM2抑制剂以及二者的联合用药进行处理，48小时后进行CCK8检测。结果如图7A，相比于单独使用一种药物，顺铂和PKM2抑制剂的联合使用对于耐药细胞具有更显著的抑制作用。

(2)对于小鼠体内实验，将5×10

(3)给药20天后，对小鼠进行活体成像检测，并对小鼠的肿瘤大小和重量进行记录。结果见图7B、7C、7D和7E，相比于单独使用一种药物，顺铂和PKM2抑制剂的联合使用对于小鼠皮下耐药肿瘤具有更显著的抑制作用。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海健康医学院

<120> 靶向外泌体PKM2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcgaagc cccatagtga agccgggact gccttcattc agacccagca gctgcacgca 60

gccatggctg acacattcct ggagcacatg tgccgcctgg acattgattc accacccatc 120

acagcccgga acactggcat catctgtacc attggcccag cttcccgatc agtggagacg 180

ttgaaggaga tgattaagtc tggaatgaat gtggctcgtc tgaacttctc tcatggaact 240

catgagtacc atgcggagac catcaagaat gtgcgcacag ccacggaaag ctttgcttct 300

gaccccatcc tctaccggcc cgttgctgtg gctctagaca ctaaaggacc tgagatccga 360

actgggctca tcaagggcag cggcactgca gaggtggagc tgaagaaggg agccactctc 420

aaaatcacgc tggataacgc ctacatggaa aagtgtgacg agaacatcct gtggctggac 480

tacaagaaca tctgcaaggt ggtggaagtg ggcagcaaga tctacgtgga tgatgggctt 540

atttctctcc aggtgaagca gaaaggtgcc gacttcctgg tgacggaggt ggaaaatggt 600

ggctccttgg gcagcaagaa gggtgtgaac cttcctgggg ctgctgtgga cttgcctgct 660

gtgtcggaga aggacatcca ggatctgaag tttggggtcg agcaggatgt tgatatggtg 720

tttgcgtcat tcatccgcaa ggcatctgat gtccatgaag ttaggaaggt cctgggagag 780

aagggaaaga acatcaagat tatcagcaaa atcgagaatc atgagggggt tcggaggttt 840

gatgaaatcc tggaggccag tgatgggatc atggtggctc gtggtgatct aggcattgag 900

attcctgcag agaaggtctt ccttgctcag aagatgatga ttggacggtg caaccgagct 960

gggaagcctg tcatctgtgc tactcagatg ctggagagca tgatcaagaa gccccgcccc 1020

actcgggctg aaggcagtga tgtggccaat gcagtcctgg atggagccga ctgcatcatg 1080

ctgtctggag aaacagccaa aggggactat cctctggagg ctgtgcgcat gcagcacctg 1140

attgcccgtg aggcagaggc tgccatctac cacttgcaat tatttgagga actccgccgc 1200

ctggcgccca ttaccagcga ccccacagaa gccaccgccg tgggtgccgt ggaggcctcc 1260

ttcaagtgct gcagtggggc cataatcgtc ctcaccaagt ctggcaggtc tgctcaccag 1320

gtggccagat accgcccacg tgcccccatc attgctgtga cccggaatcc ccagacagct 1380

cgtcaggccc acctgtaccg tggcatcttc cctgtgctgt gcaaggaccc agtccaggag 1440

gcctgggctg aggacgtgga cctccgggtg aactttgcca tgaatgttgg caaggcccga 1500

ggcttcttca agaagggaga tgtggtcatt gtgctgaccg gatggcgccc tggctccggc 1560

ttcaccaaca ccatgcgtgt tgttcctgtg ccgtga 1596

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgggcccga ggcttcttca agaagttcaa gagacttctt gaagaagcct cgggcttttt 60

tg 62

<210> 3

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aattcaaaaa agcccgaggc ttcttcaaga agtctcttga acttcttgaa gaagcctcgg 60

gc 62

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggaggcag aggctgccat ctattcaaga gatagatggc agcctctgcc tttttttg 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aattcaaaaa aaggcagagg ctgccatcta tctcttgaat agatggcagc ctctgcct 58

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagagccact atggaacacc a 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggaggtctca acacgaggt 19

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acacccttct cccttcg 17

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgctccaca tacagtcc 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctccggtatc gtcaacacgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagccaaaga tggccacgat 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcagcatag ctgttccact ta 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agctgatcct ttagagttgc ca 22

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcgaggaaca gaagtgc 17

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagttgtcgg tgtagatgc 19