一种能快速降解水中多环芳烃的微生物菌群

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，特别是涉及到一种可以降解多环芳烃的微生物菌群。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是以中性、非极性分子形式广泛存在于环境中的一类持久性有机污染物(POPs)，是最早被发现的环境致癌物之一。水体中PAHs的来源包括工业废水、废弃物、大气的干湿沉降、土壤淋溶，城市地面径流，沥青、煤焦油等随着城市污水、雨水进入水体中和海上石油开采以及船舶泄漏等。PAHs主要以化石燃料(如煤和石油)的泄漏与蒸发、化石燃料和木柴的不完全燃烧排放、工业“三废”以及城市固废等人类活动产物的排放等多种途径进入到河流及沉积物中，由于其会通过环境迁移对水环境中生物体产生遗传毒性和生殖毒性，因此引起全世界的高度重视。1951年，德国学者在西班牙巴塞罗那首次分离了能够降解芳香环类化合物的革兰氏阴性菌——Comamonas testosteroni(ATCC11996)。研究证明：Comamonas testosteroni对环境无害。KF1-Fe(Comamonas testosteroniATCC49202)是从美国分离到的另一株睾丸酮丛毛单胞菌，作为一种模式生物，同样具有水解芳香环类化合物的能力。H5弧菌(Vibrio sp.)是能够降解菲的细菌，在低相对分子质量PAHs的降解中起到重要作用，特别是在低相对分子质量PAHs包括具有较高的水溶性的萘、蒽、菲、芴等物质降解中起到重要作用的降解菌株。S19-1布丘氏菌(Buttiauxella.sp)同样具有水解芳香环化合物的能力。PS恶臭假单胞菌(Psuedomonas putida)是在多环芳烃物质代谢活动过程中能够产生酶来实现对多环芳烃的降解。细菌主要通过产生双加氧酶来催化多环芳烃的加氧反应。LY1假单胞菌(Pseudomonas sp.)和LM1醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)是从畜禽污水中分离得到的能够分解PAHs菌株。JP1施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，能够在有氧和厌氧条件下降解多种多环芳烃。P14红球菌(Rhodococcus sp)是从石油污染物中分离得到的一种PAHs降解菌株。目前国内外主要是从单一菌株的角度出发，研究其降解机理以及对环境中多环芳烃的去除。因此现有技术当中亟需要一种新的技术方案来解决这一问题。

发明内容

本发明提供一种能快速降解水中多环芳烃的微生物菌群，通过复合微生物菌群的协同共生作用提高菌种的环境适应能力和多环芳烃的降解效率，有效降低环境污染带来的生态和人体健康的风险。

本发明采取的技术方案是，包括等量的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni ATCC11996)、KF1-Fe(Comamonas testosteroni ATCC49202)、弧菌H5(Vibrio)、布丘氏菌S19-1(Buttiauxella sp.)，恶臭假单胞菌PS(Pseudomonas putida)、假单胞菌LY1(Pseudomonas sp.)、醋酸钙不动杆菌LM1(Acinetobacter calcoaceticus)、施氏假单胞菌JP1(Pseudomonas stutzeri)、红球菌P14(Rhodococcus sp.)。

本发明所述睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni ATCC11996)其保藏编号为1.3167。

本发明所述KF1-Fe为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni ATCC49202)。

本发明所述弧菌H5和布丘氏菌S19-1均为从德国波罗的海分离。

本发明所述假单胞菌LY1和醋酸钙不动杆菌LM1均为从畜禽粪便中分离得到。

本发明所述施氏假单胞菌JP1为从汕头湾沉积物中分离得到。

本发明所述红球菌P14为从原油污染的沉积物中分离得到。

本发明所述睾丸酮丛毛单胞菌、PS和KF1-Fe通过LB液体培养基培养。

本发明所述弧菌H5、布丘氏菌S19-1、醋酸钙不动杆菌LM1、假单胞菌LY1、施氏假单胞菌JP1和红球菌P14通过含有浓度为2％NaCl的LB液体培养基培养。

本发明的有益效果：通过复合微生物菌群的协同共生作用提高菌种的环境适应能力和多环芳烃的降解效率，有效降低环境污染带来的生态和人体健康的风险，以上9种菌株均能够高效降解多环芳烃，通过菌株之间的协同作用可以提高多环芳烃的降解率。实验证明，本发明复合微生物菌群可明显提高水中多环芳烃的降解率，在降低地表水多环芳烃污染的生态环境风险方面具有重要的应用价值。且本发明具有成本低、操作简单、降解效率高的优点，环境相容性好、减少使用化学试剂、避免二次污染，在多环芳烃污染环境的生物修复方面具有良好的应用前景。因此可用于多环芳烃降解菌剂的商品化生产。

附图说明

图1是本发明的微生物菌群与单菌对水中多环芳烃菲降解情况柱状示意图；

图2是本发明的微生物菌群与单菌对水中多环芳烃苯并[a]芘降解情况柱状示意图。

具体实施方式

一种能快速降解水中多环芳烃的微生物菌群，其特征是：包括等量的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni ATCC11996)、KF1-Fe(Comamonas testosteroniATCC49202)、弧菌H5、布丘氏菌S19-1、恶臭假单胞菌PS、假单胞菌LY1、醋酸钙不动杆菌LM1、施氏假单胞菌JP1以及红球菌P14。

所述睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni ATCC11996)其保藏编号为1.3167。

KF1-Fe为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni ATCC49202)。

所述弧菌H5和布丘氏菌S19-1均为从德国波罗的海分离。

所述假单胞菌LY1和醋酸钙不动杆菌LM1均为从畜禽粪便中分离得到。

所述施氏假单胞菌JP1为从汕头湾沉积物中分离得到。

所述红球菌P14为从原油污染的沉积物中分离得到。

所述睾丸酮丛毛单胞菌、PS和KF1-Fe通过LB液体培养基培养。

所述弧菌H5、布丘氏菌S19-1、醋酸钙不动杆菌LM1、假单胞菌LY1、施氏假单胞菌JP1和红球菌P14通过含有浓度为2％NaCl的LB液体培养基培养。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置四次重复实验，结果取平均值

多环芳烃标准品：购买于Supelco公司。

多环芳烃储备液的配制：分别称取89mg菲标准品溶和126mg苯并[a]芘标准品溶解于10mL的无水乙醇中，得到50mM的多环芳烃溶液，保存于4℃冰箱中。

LB培养基：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1L。121℃、20min高压灭菌。

色谱纯乙腈：购买于Fisher scientific公司。

实施例1、菌种的培养及菌群的制备

睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni ATCC11996)，KF1-Fe，H5，S19-1，PS，LM1，LY1，JP1和P14九个菌种，分别从各菌种母液中取200μL菌液，加入2mL的LB培养基；H5和S19-1的LB培养基中加入2％的NaCl。将上述九种菌液在27℃，180r/min摇床培养，过夜，分别用LB培养基将上述九种培养后的菌液调OD

实施例2、复合菌群降解水中多环芳烃的响应特征测试：

(1)水中多环芳烃在菌群中的降解：

将1ml复合菌液与1ml LB培养基混合后，人为地加入0.1mM的多环芳烃溶液，在27℃，180r/min摇床培养2天。

(2)水中多环芳烃的提取：

由于多环芳烃易溶于氯仿，因此我们采用氯仿萃取法提取水中或经过微生物菌群降解后的水中多环芳烃。即每毫升水加入1mL氯仿，并转移至离心管中，振荡20分钟。在4000r/min条件下离心10分钟。取下相500μL，13000r/min条件下离心10分钟，取下相澄清液300μL，真空干燥，待测。

(3)将上述经氯仿萃取得到的样品溶于乙腈中，采用高效液相色谱(HPLC，Waterse2695)测定雌激素降解情况。检测器为UV(2988Water Detector)，色谱柱为C18柱(5μm粒径、4.6mm×250mm，Waters)，流动相为乙腈：水＝75：25(体积比)，检测波长为254nm，流速为1mL/min，柱温30℃，进样量10μL。

通过高效液相色谱结果计算出多环芳烃的降解率。每种对照均重复4次。结果如图1所示，表明复合微生物菌群可以高效降解水中的多环芳烃。经过2天的菌群降解，人为加入的高浓度多环芳烃(0.1mM)的降解率可达80％以上。