一种固定化酶、其制备方法及卡洛芬对映体的拆分方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，尤其涉及一种固定化酶、其制备方法及应用为立体选择性催化酯水解拆分卡洛芬对映体的方法。

背景技术

卡洛芬是一种重要的非甾体高效抗炎药。酶的立体选择性催化反应可直接将化学合成的外消旋体转化成单一对映体。而且酶作为一种天然的高分子催化剂，具有立体选择性高、反应条件温和、无污染等诸多优点，使其在食品、医药、精细化工等工业领域有着极为广阔的应用前景。但游离酶从反应体系中分离难度大，难以循环利用等缺点增加了其作为催化剂的成本；游离酶使用过程中容易变性，并且对温度、pH等反应条件要求较为苛刻，上述不足使游离酶难以在工业中得到更为广泛的应用。因此，固定化酶的概念和技术得以提出和发展。

酶的固定化，即通过化学或物理的处理方法使原来水溶性的酶与固态的水不溶性载体相结合或被载体包埋。载体材料的结构和性能对固定化酶的性能有着巨大的影响，近年来，常用载体按组成可分为高分子载体、无机载体、复合载体以及新型载体等。高分子材料具有使用寿命较短，传质性能较差等不足；无机载体具有稳定性好，成本低，寿命长等优点，但使用无机材料制备的固定化酶的负载率一般而言较低。相较于上述固定化材料，金属有机框架化合物(MOFs)作为一类新型固定化载体日益受到重视。MOFs是一类由金属离子为节点，多齿有机配体作为连接体合成的多孔晶体材料。MOFs结构可针对具体的应用进行设计和调节，具有高比表面积、孔体积、易调节的孔道尺寸，以及良好的热稳定性且合成条件较温和等优点。因此MOFs固定化酶已经成为当前的热点研究方向。常采用的固定化方法主要分为表面吸附、共价连接、孔内包埋以及共沉淀法等。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种固定化酶，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种固定化酶，其包括：

南极假丝酵母脂肪酶(CAL-A)；以及

金属有机框架化合物(MOFs)，用作为所述南极假丝酵母脂肪酶的固定化载体；所述南极假丝酵母脂肪酶通过表面吸附法固定于所述金属有机框架化合物的表面上。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述金属有机框架化合物为沸石咪唑骨架材料(ZIF-8)。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的固定化酶的制备方法，其括以下步骤：

取金属有机框架化合物作为固定化载体；

将南极假丝酵母脂肪酶添加至缓冲液中后，再与金属有机框架化合物进行混合分散，控制反应体系温度搅拌一定时间后得到分散液；

将分散液进行过滤后，再经干燥处理，得到所述固定化酶。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，南极假丝酵母脂肪酶与金属有机框架化合物的体积质量比以mL/mg计为4:(50～300)。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的固定化酶。

本发明实施例的另一目的在于提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

以外消旋卡洛芬酯为反应底物，以上述的固定化酶为催化剂；

通过所述固定化酶选择性催化外消旋卡洛芬酯进行水解反应。

具体的，底物外消旋卡洛芬酯可以从卡洛芬甲酯、卡洛芬乙酯、卡洛芬丁酯、卡洛芬异丁酯、卡洛芬叔丁酯、卡洛芬戊酯、卡洛芬异戊酯、卡洛芬己酯、卡洛芬庚酯、卡洛芬辛酯中进行选择。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述拆分方法具体包括以下步骤：

以缓冲溶液为反应介质，将缓冲溶液与外消旋卡洛芬酯进行混合后，再加入所述固定化酶进行水解反应。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，其pH为4.5～9.5。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，水解反应的温度为30～80℃，反应时间为1～48h。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，每毫升缓冲溶液中，外消旋卡洛芬酯的添加量为0.001～0.1mmol，所述固定化酶的添加量为5～150mg。

本发明利用沸石咪唑骨架材料ZIF-8作为固定化载体，ZIF-8具有MOFs的基本优点以外，还具有优良的疏水性和水溶液稳定性。本发明通过表面吸附法将CAL-A固定于MOFs材料ZIF-8表面，并将固定化酶应用于催化酯的水解反应。本发明利用ZIF-8载体材料优良的疏水性，有效促进了酶与底物的接触，同时载体的疏水性表面与酶之间存在的弱疏水性作用，显著提高了酶的催化活性，且保持高的立体选择性。此固定化酶CAL-A@ZIF-8不仅可以实现与反应体系迅速分离，而且具有较高的热稳定性，以及对pH的耐受度。更重要的是，该技术提高了酶的循环使用性能，显著降低了技术成本，具有操作简便，污染少等优点，符合绿色化学理念。

综上所述，本发明提出了一种通过表面吸附法将CAL-A固定于MOFs材料ZIF-8表面的方法，并将固定化酶CAL-A@ZIF-8应用于立体选择性催化酯水解拆分卡洛芬对映体，通过固定化提高了酶的热稳定性、对pH的耐受性，以及底物酯的转化率。本发明相比现有技术具有如下优势：

本发明利用酶的立体选择性催化拆分卡洛芬对映体，具有绿色、高效、反应条件温和等优点；制备固定化酶作为催化剂，可强化酶的稳定性和操作范围，降低条件控制的苛刻程度，使该技术工业应用更便利；同时能有效的提高脂肪酶催化活性；也能很好地解决酶的回收和循环利用问题，降低催化剂使用成本。而MOFs作为非常有潜力的一类酶固定化载体，其具有丰富多样的可设计和调节的结构，不仅具有高比表面积和孔体积，而且制备条件温和，能较好地保持酶的活性和选择性。本方法实施操作简便，绿色环保，产物和酶易于分离，酶催化剂的重复使用性能高。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了一种固定化酶，其包括沸石咪唑骨架材料ZIF-8以及通过表面吸附法固定于沸石咪唑骨架材料ZIF-8表面上的南极假丝酵母脂肪酶(CAL-A)。具体的，该固定化酶的制备方法包括以下步骤：

S1、将4mL的CAL-A添加至10mL的磷酸缓冲溶液中(0.05mmol/L，pH＝6.5)中进行溶解后，再加入150mg的ZIF-8，并置于室温下进行搅拌混合分散10h，得到分散液。

S2、将分散液进行过滤，并将过滤的沉淀物用水洗3次后，再经冷冻干燥过夜，即可得到白色的固定化酶CAL-A@ZIF-8。

实施例2

该实施例提供了一种固定化酶，其包括沸石咪唑骨架材料ZIF-8以及通过表面吸附法固定于沸石咪唑骨架材料ZIF-8表面上的南极假丝酵母脂肪酶(CAL-A)。具体的，该固定化酶的制备方法包括以下步骤：

S1、将4mL的CAL-A添加至10mL的磷酸缓冲溶液中(0.05mmol/L，pH＝4.5)中进行溶解后，再加入50mg的ZIF-8，并置于0℃下进行搅拌混合分散2h，得到分散液。

S2、将分散液进行过滤，并将过滤的沉淀物用水洗3次后，再经冷冻干燥过夜，即可得到白色的固定化酶CAL-A@ZIF-8。

实施例3

该实施例提供了一种固定化酶，其包括沸石咪唑骨架材料ZIF-8以及通过表面吸附法固定于沸石咪唑骨架材料ZIF-8表面上的南极假丝酵母脂肪酶(CAL-A)。具体的，该固定化酶的制备方法包括以下步骤：

S1、将4mL的CAL-A添加至10mL的磷酸缓冲溶液中(0.05mmol/L，pH＝9.5)中进行溶解后，再加入300mg的ZIF-8，并置于50℃下进行搅拌混合分散40h，得到分散液。

S2、将分散液进行过滤，并将过滤的沉淀物用水洗3次后，再经冷冻干燥过夜，即可得到白色的固定化酶CAL-A@ZIF-8。

实施例4

该实施例提供了一种固定化酶，其包括沸石咪唑骨架材料ZIF-8以及通过表面吸附法固定于沸石咪唑骨架材料ZIF-8表面上的南极假丝酵母脂肪酶(CAL-A)。具体的，该固定化酶的制备方法包括以下步骤：

S1、将4mL的CAL-A添加至15mL的磷酸缓冲溶液中(0.05mmol/L，pH＝6.5)中进行溶解后，再加入160mg的ZIF-8，并置于室温下进行搅拌混合分散10h，得到分散液。

S2、将分散液进行过滤，并将过滤的沉淀物用水洗3次后，再经冷冻干燥过夜，即可得到白色的固定化酶CAL-A@ZIF-8。

实施例5

该实施例提供了一种固定化酶，其包括沸石咪唑骨架材料ZIF-8以及通过表面吸附法固定于沸石咪唑骨架材料ZIF-8表面上的南极假丝酵母脂肪酶(CAL-A)。具体的，该固定化酶的制备方法包括以下步骤：

S1、将4mL的CAL-A添加至8mL的磷酸缓冲溶液中(0.05mmol/L，pH＝6.5)中进行溶解后，再加入140mg的ZIF-8，并置于室温下进行搅拌混合分散10h，得到分散液。

S2、将分散液进行过滤，并将过滤的沉淀物用水洗3次后，再经冷冻干燥过夜，即可得到白色的固定化酶CAL-A@ZIF-8。

实施例6

该实施例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.005mmol外消旋卡洛芬甲酯、25mg上述实施例1提供的固定化酶CAL-A@ZIF-8加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、75℃的条件下进行水解反应24h，得到(R)-卡洛芬等产物。

实施例7

该实施例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.005mmol外消旋卡洛芬甲酯、25mg上述实施例1提供的固定化酶CAL-A@ZIF-8加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、65℃的条件下进行水解反应24h，得到(R)-卡洛芬等产物。

实施例8

该实施例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.005mmol外消旋卡洛芬甲酯、25mg上述实施例1提供的固定化酶CAL-A@ZIF-8加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝7.0，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、75℃的条件下进行水解反应24h，得到(R)-卡洛芬等产物。

实施例9

该实施例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.005mmol外消旋卡洛芬甲酯、25mg上述实施例1提供的固定化酶CAL-A@ZIF-8加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、75℃的条件下进行水解反应48h，得到(R)-卡洛芬等产物。

实施例10

该实施例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.005mmol外消旋卡洛芬甲酯、25mg上述实施例1提供的固定化酶CAL-A@ZIF-8加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、75℃的条件下进行水解反应24h后，再将反应体系固液分离，固体部分冷冻干燥后回收固定化酶CAL-A@ZIF-8，再在相同条件下进行催化水解反应，并重复反应三次后，得到(R)-卡洛芬等产物。

实施例11

该实施例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.001mmol外消旋卡洛芬辛酯、150mg上述实施例1提供的固定化酶CAL-A@ZIF-8加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝4.5，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、30℃的条件下进行水解反应48h，得到(R)-卡洛芬等产物。

实施例12

该实施例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.1mmol外消旋卡洛芬乙酯、5mg上述实施例1提供的固定化酶CAL-A@ZIF-8加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝9.5，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、80℃的条件下进行水解反应1h，得到(R)-卡洛芬等产物。

对比例1

该对比例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.005mmol外消旋卡洛芬甲酯、22mg游离脂肪酶(南极假丝酵母脂肪酶)加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、75℃的条件下进行水解反应24h，得到(R)-卡洛芬等产物。

对比例2

该对比例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.005mmol外消旋卡洛芬甲酯、22mg游离脂肪酶(南极假丝酵母脂肪酶)加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、65℃的条件下进行水解反应24h，得到(R)-卡洛芬等产物。

对比例3

该对比例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.005mmol外消旋卡洛芬甲酯、22mg游离脂肪酶(南极假丝酵母脂肪酶)加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝7.0，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、75℃的条件下进行水解反应24h，得到(R)-卡洛芬等产物。

对比例4

该对比例提供一种卡洛芬对映体的拆分方法，其包括以下步骤：

将0.005mmol外消旋卡洛芬甲酯、22mg游离脂肪酶(南极假丝酵母脂肪酶)加入到10mL反应管中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，0.1mmoL/L)作为反应介质，然后置于转速500rpm、75℃的条件下进行水解反应48h，得到(R)-卡洛芬等产物。

实验例：

对上述实施例6～10以及对比例1～4得到的(R)-卡洛芬进行产率和对映体过剩量测定，其测定结果如表1所示，其测试方法如下：

产物的光学纯度和底物转化率采用美国Waters 1525高效液相色谱仪分析，Inertsil ODS-3色谱柱(150×4.6mm i.d.，5μm)，柱温保持在35℃。流动相由甲醇和含20mmo/L磷酸二氢钠和25mmo/L HP-β-CD的水相组成(pH＝5.50，用氢氧化钠调节)，二者体积比为35:65。检测波长273nm；流动相的流速设定为1mL/min；(R)-CP的保留时间少于(S)-CP。

表1

综上所述，本发明通过表面吸附法将CAL-A固定于MOFs材料ZIF-8表面的方法，可以提高酶的热稳定性、对pH的耐受性，将该固定化酶CAL-A@ZIF-8应用于立体选择性催化酯水解拆分卡洛芬对映体，可以提高底物酯的转化率和R产物的产率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。