恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5及其应用

技术领域

本发明涉及基因技术领域，特别涉及恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5及其应用。

背景技术

玉米作为重要的粮食和饲料作物在世界经济的发展中起着不可估量的作用。玉米也是最早利用杂种优势的作物，在解决我国粮食安全问题上起于至关重要的作用。在种子生产过程中需要采用人工或机械等方式去除雄穗，避免种子混杂，这在一定程度上推高杂交种子的生产成本，制约我国种子企业的国际竞争力。我国农业部种子品种质量监测中心于1994年、1995年连续两年对全国各个主要玉米生产基地所生产的杂交种进行随机抽样检测的结果表明，1994年抽查的全部杂交种样品均达不到国家种子质量标准，1995年达到国标的样品数仅占1.2%。种子不合格的主要原因是因母本去雄质量差，杂交种子中混有相当数量的自交系，直接影响杂种优势增产潜能的发挥。在目前的生产情况下，利用细胞质雄性不育的“三系”配套种子生产技术仍然具有较大的利用潜力。

雄性不育具有花粉败育、而雌配子正常的遗传特点，根据其遗传特性可以分为细胞质雄性不育和细胞核雄性不育两种类型。细胞核雄性不育的败育发生减数分裂时期，具有败育彻底，不育性稳定等特点，在利用不育系进行制种中需要利用与核不育基因连锁的胚乳颜色基因或黄绿苗基因进行早期鉴定，由于连锁的紧密程度及人工鉴定的偏差，存在较大的应用风险。为利用核不育基因，美国先锋公司通过巧妙的设计，构建了包含配子致死、颜色显示等基因的载体，通过遗传转化导入母本形成SPT（Seed ProductionTechnology）自交系。SPT自交系自交产生1:1比例的非转基因不育系及SPT可育系两种子代，通过荧光筛选，解决了不育系的繁殖问题，有效杜绝了转基因花粉的扩散。随后水稻也开发了相应的SPT技术，表明该技术在未来杂交育种中广阔的应用前景。玉米中，万向元等有设计发明了多控不育系统用于种子生产。然而，昂贵的大型分选设备对于众多中小种子企业来说仍然是一笔不小的投入。

玉米是最早利用细胞质雄性不育系进行杂交种子生产的作物，根据细胞核基因对细胞质基因不育性的恢复专效性，将不同来源的雄性不育细胞质分为T、C、S三组。CMS-T育性的恢复需要Rfl和Rf2两个显性基因的共同作用，这两对基因表现为显性互补作用，即不育性恢复需要两个显性基因的共同作用，缺一不可，两对显性基因处于纯合或杂合状态时，育性可以得到恢复，当其中任何一对基因为隐性纯合状态时，则表现为雄性不育。研究人员把Rf1定位于第3号染色体短臂端，Rf2定位于第9号染色体靠近Wx基因座位附近区域。S组雄性不育类型是3种雄性不育类型中数量最大的一组，育性恢复基因为显性基因Rf3，定位在第2染色体的长臂上，除Rf3外，研究人员在第1、3、6、8号染色体上也发现了影响CMS-S育性的恢复基因。研究，至少有3对恢复基因与C组不育性恢复有关，分别为Rf4、Rf5、Rf6，并且证明C组中的C、RB、ES、Bb型胞质的育性恢复受显性单基因Rf4控制，并首次把Rf4定位在8号染色体上。C型不育系的育性恢复受两对具有重叠效应的基因Rf4、Rf5控制，两对基因中只要有一个基因为显性基因，育性即可得到恢复。其中恢复基因Rf5还存在一个显性抑制基因Rf-I，该基因被定为在第7染色体上。在玉米不育化制种技术应用方面，河南农业大学在深入解析玉米C型胞质雄性不育与恢复机理的基础上，建立了完善的玉米不育化制种技术体系，先后完成了豫农704、豫玉22、奥玉3301、浚单20等优良玉米杂交种的三系配套技术，并在杂交种子生产中得的了大面积利用。

传统的不育系及恢复系转育主要根据玉米植株散粉期的田间表型鉴定，而且需要转育6-8代才能完成，选择的时效性在一定程度上受到限制。随着现代分子生物学的发展，相关基因的克隆为作物育种提供了强于力的工具，可以有效弥补传统选择技术准确率低和时效性差的缺点，加快了育种进程。河南农业大学从上个世纪70年代开始对玉米C型胞质雄性不育的遗传机理进行了大量研究，克隆了玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4，由于自然存在的恢复材料相对较少，恢复系的分发受到一定的影响。C型胞质具有重叠恢复基因Rf5，因此，筛选到的恢复系材料相对于单一恢复基因及互作效应恢复材料要多，有利于不同地区恢复系的筛选。而恢复基因Rf5的克隆则为不育化制种技术的应用提供了基础支撑。

玉米是我国第一大粮食作物，常年播种面积5亿亩左右，年需种量10亿公斤左右，年制种面积维持在250万亩左右。由于本地留守人口少，去雄季节的用工荒已经成为玉米制种进一步发展的限制因子，因此利用已克隆的恢复基因快速实现玉米恢复系的选育，对玉米“三系法”制种的利用具有积极的促进作用，玉米杂交种子生产提供有力的技术支撑与保障。

发明内容

本发明的目的在于提供恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5及其应用，确定了玉米C型胞质不育核恢复基因Rf5的核苷酸及氨基酸序列。利用本发明所述序列，可方便玉米杂交种三系配套材料创制，缩短选育周期，降低选育成本，提高种子生产效率，可以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

恢复玉米C型胞质育性的基因，其为一种分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

（1）SEQ ID NOs：1-5中的任何一个所示的核苷酸序列；

（2）与（1）的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；

（3）与（1）的核苷酸序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；

（4）与（1）的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的核苷酸序列；

（5）编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的氨基酸序列，或者，由于一个或多个氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列；

（6）（1）-（5）任何一个的核苷酸序列的活性片段；或与（1）-（5）任何一个核苷酸序列互补的核苷酸序列；

（7）由SEQ ID NOs：4、5选择性剪切、选择不同转录起始位点或转录终止位点而生成的与SEQ ID NOs 4、5不同的其他核苷酸序列。

进一步地，所述Rf5的启动子序列，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

A、SEQ ID NOs：6-8所示的核苷酸序列；

B、与A的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；

C、与A的核苷酸序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；

D、A-C任何一个的核苷酸序列的活性片段；或与A-D任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

E、由SEQ ID NOs：4、5不同转录起始后引起SEQ ID NOs：6-8相应变化的核苷酸序列。

进一步地，包含所述启动子序列的构建体，以及包含所述构建体的细胞，其中所述细胞为植物细胞，优选玉米细胞。

进一步地，还包括分离的多肽，其有所述的Rf5基因编码，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：

a、SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的核苷酸序列；

b、由于一个或多个（例如1-25个、1-20个，1-15个，1-5个，1-3个）氨基酸残疾的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；

c、与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列；

d、a或b或c所述氨基酸序列的活性片段；

e、由多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

进一步地，还包括一种重组构建体，其含有所述的恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5的多核苷酸序列，其中所述构建体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。

进一步地，还包括一种重组宿主细胞，其含有所述的重组构建体，或在其基因组中整合有所述的可恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5的多核苷酸序列，所述宿主细胞可以选自植物细胞或者微生物细胞，优选植物细胞，最优选玉米细胞，所述细胞可以是分离的、离体的、培养的或者是植物的一部分。

进一步地，多核苷酸或多肽或重组构建体或重组宿主细胞在C型胞质不育材料中的恢复作用。

恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5及其应用，从含有可恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5及其等位变异的重组植物细胞再生转基因植物或者将含有的可恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5及其等位变异的植株与另一植株杂交，或者利用包含Rf5的重组农杆菌细胞转染作物植物获得转基因作物植株，性状包括产生或敲除作物对C型胞质不育的恢复性，其中植株优选是除恢复功能外其他形状不受负向影响的植株，其中作物植物优选是农作物。

进一步地，利用包含Rf5的重组农杆菌细胞转染作物植物获得转基因作物植株，或是适量调节作物植株中Rf5基因的表达水平，或是适量改变RF5蛋白生物学活性，或者将恢复基因的植株与另一植株杂交；其中所述植株优选是除恢复功能外其他形状不受负向影响的植株，其中所述作物植物优选是农作物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明确定了玉米C型胞质的一个育性恢复基因Rf5，该基因位于第2号染色体长臂末端。除编码区差异外，该基因启动子区域因不同转录起始而存在差异，利用本发明所述序列，可方便玉米杂交种三系配套材料创制，缩短选育周期，降低选育成本，提高种子生产效率。

附图说明

图1为本发明对恢复基因Rf5精细定位图；

图2为本发明p3300U-Rf5载体示意图；

图3为本发明p3300U-Rf5载体转化阳性植株与不育系测交结果；

图4为本发明pBLUE411-Rf5载体示意图；

图5为本发明CRISPr/Cas9转化测交不育植株编辑位点检测结果；

图6为本发明CRISPR/Cas9载体转化测交不育表型效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

恢复玉米C型胞质育性的基因，其为一种分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

（1）SEQ ID NOs：1-5中的任何一个所示的核苷酸序列；

（2）与（1）的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；

（3）与（1）的核苷酸序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；

（4）与（1）的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的核苷酸序列；

（5）编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列： SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的氨基酸序列，或者，由于一个或多个（例如1-25个、1-20个，1-15个，1-5个，1-3个）氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列；

（6）（1）-（5）任何一个的核苷酸序列的活性片段；或与（1）-（5）任何一个核苷酸序列互补的核苷酸序列；

（7）由SEQ ID NOs：4、5选择性剪切、选择不同转录起始位点或转录终止位点而生成的与SEQ ID NOs 4、5不同的其他核苷酸序列。

其中，Rf5和rf5的其中一种cDNA序列如SEQ ID NOs：1-3所示，其相关启动子的核苷酸序列有SEQ ID NOs：6-8所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NOs：9-11所示。具体参见下表1。

表1. SEQ ID NOs：1-11的序列名称及其来源

本发明涉及的可恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5如SEQ ID NOs：1所示。

本发明还涉及Rf5的启动子序列，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

A、SEQ ID NOs：6-8所示的核苷酸序列；

B、与A的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；

C、与A的核苷酸序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；

D、A-C任何一个的核苷酸序列的活性片段；或

E、与A-D任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

F、由SEQ ID NOs：4、5不同转录起始后引起SEQ ID NOs：6-8相应变化的核苷酸序列。

本发明还涉及包含启动子序列的构建体，以及包含所述构建体的细胞，其中所述细胞为植物细胞，优选玉米细胞。

本发明涉及的分离的多肽（也称蛋白质），其有Rf5基因编码，具有PPR保守结构域，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：

a、SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的核苷酸序列；

b、由于一个或多个（例如1-25个、1-20个，1-15个，1-5个，1-3个）氨基酸残疾的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；

c、与SEQ ID NOs：9-11中任何一个所示氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列；

d、a或b或c所述氨基酸序列的活性片段；

e、由本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

其中，RF5蛋白序列及其变体蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NOs：9-11所示，具体参见表1。

本发明还涉及一种重组构建体，其含有本发明所述的恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5的多核苷酸序列。其中所述构建体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。

本发明还涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明重组构建体，或在其基因组中整合有本发明可恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5的多核苷酸序列。所述宿主细胞可以选自植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，优选植物细胞，最优选玉米细胞。细胞可以是分离的、离体的、培养的或者是植物的一部分。

本发明涉及本发明的多核苷酸（即，恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5）或多肽或本发明的重组构建体或本发明的重组宿主细胞在C型胞质不育材料中的恢复作用。

本发明还涉及改良作物性状（例如，产生或敲除作物对C型胞质不育的恢复性）的方法，该方法包括制备含有本发明的可恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5的多核苷酸序列或本发明的构建体的作物植物，例如，所述方法可以包括：从含有本发明的可恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5及其等位变异的重组植物细胞再生转基因植物或者将含有本发明所述的可恢复玉米C型胞质育性的基因Rf5及其等位变异的植株与另一植株杂交，或者利用包含Rf5的重组农杆菌细胞转染作物植物获得转基因作物植株。所述性状包括产生或敲除作物对C型胞质不育的恢复性。其中所述植株优选是除恢复功能外其他形状不受负向影响的植株，其中所述作物植物优选是农作物，例如玉米。

本发明涉及一种改良作物的方法。该方法包括：利用包含Rf5的重组农杆菌细胞转染作物植物获得转基因作物植株，或是适量调节作物植株中Rf5基因的表达水平，或是适量改变RF5蛋白生物学活性，或者将本发明的恢复基因的植株与另一植株杂交；其中所述植株优选是除恢复功能外其他形状不受负向影响的植株，其中所述作物植物优选是农作物，例如玉米。

培育具有恢复玉米C型胞质育性的玉米自交系的方法可以这样进行：利用包含Rf5基因及其等位变异的玉米植株与另一玉米植株杂交，并连续回交获得包含Rf5基因的玉米自交系植株；或是利用包含Rf5基因的重组宿主细胞（例如，农杆菌细胞）转染玉米植株获得含有Rf5基因的转基因玉米植株。

本发明通过深入研究，确定了玉米C型胞质的一个育性恢复基因Rf5，该基因位于第2号染色体长臂末端。除编码区差异外，该基因启动子区域因不同转录起始而存在差异，因此该基因的表达量除影响育性恢复外可能具有其他生长发育上尚未知晓的功能。本发明实施方案以其对玉米C型胞质的恢复功能为基础展开。

植物转化

在特别优选实施方式中，在高等生物体例如植物中表达至少一种本发明的可恢复玉米C型胞质育性的蛋白。可将本发明的恢复基因Rf5的核苷酸序列插入到表达盒中，然后优选地，将该表达盒稳定整合在所述植物基因组中。在另一个优选实施方式中，将所述恢复基因Rf5的核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中。按照本发明转化的植物可以是单子叶或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，洋葱，大蒜，南瓜，苹果，梨，草莓，菠萝，番茄，高粱，向日葵，菜籽油菜，胡萝卜，稻，茄子，黄瓜，拟南芥属。特别优选的是玉米、水稻、小麦、大麦。

一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。

在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列，由此在转基因植物中引起相应恢复功能蛋白的生物合成。以这种方式，可产生具有恢复功能的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。所有生物体都有特定的密码子使用偏爱性，这是本领域已知的，可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，从有至少约35%，优选多于约45%，更优选多于50%，最优选多于约60%GC含量的编码序列可以最好地实现植物中高水平的表达。

需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。

实施例1：玉米C型胞质恢复基因Rf5序列的获得

来源于凤可1的恢复基因Rf5经过5代连续回交后自交，最终将Rf5基因导入自交系Mo17的背景，得到恢复系，命名为6233，记为Cms-6233。以不育系Cms-CMo17（rf4rf4rf5rf5）和恢复系Cms-C6233（rf4rf4Rf5Rf5）为实验材料，构建Rf5的BC1分离群体。用1500株分离群体对恢复基因Rf5进行初步定位的基础上，扩大分离群体的规模至32,000株，借助于B73的基因组信息开发SSR、Indel等分子标记，对恢复基因Rf5进行了精细定位（图1），将恢复基因Rf5定位在分子标记chr2.09-36与chr2.09-6+1之间，物理距离82,284bp。对候选基因区域内的DNA序列进行生物信息学分析，预测目标区域内共有6个可能的候选基因，其中2个为PPR结构基因，1个转录因子编码基因，2个信号传导相关基因以及1个未知功能基因（表2）。在B73参考基因组更新至第4版本及Mo17基因组序列释放后再次分析发现定位区间仅有一个PPR基因，及原先两个PPR基因中的第一个PPR基因（表2中3号基因）。确定该PPR基因为候选Rf5基因。

表2 定位区间候选基因预测列表

图1. 引物BC1F1群体交换单株中检测结果，最右侧两个样品分别是R和r亲本带型。

表3 引物PCR反应体系

表4 PCR反应程序

标记引物序列：

chr2.09-36F 5' TATTTGTTCTGGTTGTACGTTGG 3'

chr2.09-36R 5' GTTTAGTCGGAATAGTCCACCAG 3'

chr2.09-6+1F 5' TAGACCTTACGACCTGTGTTTGAC 3'

chr2.09-6+1R 5' TATGGGCGTTGCGACTTG 3'。

实施例2：Rf5玉米转基因实验及转基因材料育性分析

本实施例利用恢复系Cms-6233Rf5Rf5四分体花药为材料，反转录扩增得Rf5基因的全长cDNA。

（1）Rf5超表达转基因载体的构建与转化

根据Rf5基因的cDNA序列涉及引物：

p3300U-BamH1-F: 5’-cgcggatccATGCCGTCATGTGCCCGCAT-3’

p3300U-Sacl-R:5’-cgagctcTCACGGACTGGCCTCTGCAA-3’

以Rf5基因全长cDNA为模板，扩增出Rf5全长序列，将PCR产物利用BamhI和SacI双酶切回收目标片段，并连入到用同样两种酶双酶切回收的p3300U载体上，构建成过量表达载体p3300U-Rf5（图2）。采用农杆菌介导的转化法将该载体导入到玉米转化受体自交系C01中。转基因阳性植株与Cms-Mo17rf5rf5不育系进行测交，结果表明含有构建体转基因阳性植株可以恢复玉米C型胞质不育系的育性（图3）。

（2）Rf5编辑载体的构建和转化

根据Rf5基因的CDS序列所对应的氨基酸序列，预测Rf5基因的功能域PPR基序。因此针对PPR基序所对应的的核苷酸序列，按照构建CRISPr载体的要求，涉及了如下的靶点序列：

PPR1:5‘-TACCATACACTACATCGTCTGG-3’

PPR2:5‘-GCGTACCCGTTGAGCATAATGG-3’

根据靶向序列合成相应的寡核苷酸引物序列与crispr载体进行PCR扩增，扩增产物纯化回收，建立BsaI-T4Ligase的酶切链接体系，体系如下表5。

表5 酶切链接体系

取5ul连接产物转化大肠杆菌，Kan板筛选。菌落PCR鉴定阳性克隆，并测序确认（图4）。采用农杆菌介导的转化法将该载体导入到玉米转化受体自交系C01中。转基因阳性植株与Cms-6233Rf5Rf5恢复系进行测交，筛选阳性不育单株进行PCR测序检测，证明目标基因Rf5的PPR区域被编辑（图5）后，导致Rf5恢复功能丧失（图6）。

以上实施例表明，本发明所述核苷酸序列为Rf5基因的真是序列，具有恢复玉米C型胞质不育的育性的功能。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。