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SARS-CoV-2减毒株及其在预防新冠肺炎中的应用

文献发布时间：2023-06-19 09:27:35

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株SARS-CoV-2减毒株及其在预防和/或治疗新冠肺炎中的应用。

背景技术

SARS-CoV-2与SARS-CoV、MERS-CoV同为冠状病毒科冠状病毒属成员。SARS-CoV-2是一种有包膜的RNA病毒，其基因组全长近30kb，两端为5’和3’非编码区，中间为单一开放读码框，编码4个结构蛋白(刺突蛋白S，膜蛋白E，基质蛋白M和核衣壳蛋白N)和16个非结构蛋白。结构蛋白S位于病毒颗粒的表面，呈刺突状，由S1和S2两部分亚基组成。S1主要负责与细胞表面受体结合，S2则参与后续的病毒膜与细胞膜融合过程。在此过程中，S蛋白被宿主蛋白酶切割为S1和 S2也是病毒完成侵入的关键步骤。

然而，野生型SARS-CoV-2的感染力和病毒毒性强，基于野生型SARS-CoV-2的研究需要较高生物安全等级的实验室和研究设备，由于符合条件的实验室和设备有限，使得对新冠病毒的研究和疫苗开发进程受阻。并且，对于研究人员而言，在使用野生型SARS-CoV-2进行研究的过程中也需要面对较高的风险。因此，亟需获取SARS-CoV-2减毒株用于实验研究和疫苗开发生产，提高研究安全性，加快研究进程。另一方面，SARS-CoV-2减毒株还可模拟真实的病毒感染，激活宿主的免疫系统，有望成为新冠肺炎的减毒活疫苗候选株。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的野生型SARS-CoV-2研究风险大，对实验室、设备和研究人员的要求高等问题，提供一株SARS-CoV-2减毒病毒株，该减毒病毒株具有复制能力显著降低，体现出明确的减毒特征等特点。进一步评价了其对动物的免疫保护效果，探索其作为新冠肺炎减毒活疫苗候选株的可行性。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一株SARS-CoV-2减毒株，相比于野生型SARS-CoV-2，所述减毒株的基因组RNA对应的cDNA具有自5’末端起第23597-23617位核苷酸的缺失。

本发明第二方面提供一种包含SARS-CoV-2减毒病毒株的全基因组cDNA的DNA分子，所述 cDNA自5’末端起第23597-23617位核苷酸缺失。

本发明第三方面提供上述减毒株和/或DNA分子在治疗和/或预防新冠肺炎中的应用。

本发明第四方面提供上述减毒株和/或DNA分子在研究和/或制备SARS-CoV-2病毒疫苗中的应用。

本发明第五方面提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物中含有活性成分和辅料，所述活性成分包括上述减毒株和/或DNA分子。

本发明提供的SARS-CoV-2减毒株在体内和体外的复制能力相比野生型毒株有所降低，从而使得对该病毒进行操作的生物安全要求降低，为在生物安全等级较低的(例如可以降低至2级)实验室中完成对SARS-CoV-2的研相关研究和生物安全等级较低的(例如可以降低至2级)实验室中完成新冠灭活和/或减活疫苗的研发和生产提供了可能。同时，该减毒株能够为地鼠提供有效的免疫保护。

附图说明

图1为缺失病毒DEL-7aa的S1/S2连接区序列比对图；

图2为缺失病毒DEL-7aa在细胞中的增殖特征图；

图3为显示缺失病毒DEL-7aa感染细胞后的病毒蛋白表达情况的间接免疫荧光结果图；

图4为缺失病毒DEL-7aa在hACE小鼠肺中的复制能力测试结果图；

图5为灭活后的缺失病毒DEL-7aa对小鼠的免疫保护效果图；

图6为DEL-7aa免疫地鼠后的中和抗体滴度；

图7为DEL-7aa免疫地鼠后，地鼠对病毒感染的保护效果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当能够理解的是，以下具体实施方式仅用于解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明的发明人在研究过程中发现，新冠病毒临床分离株(野生型SARS-CoV-2)在Vero细胞中连续传代后，其基因组核苷酸序列发生突变，具体表现为其S蛋白编码区中的S1/S2切割位点的上游缺失了21个核苷酸，导致S蛋白缺失7个氨基酸残基(也即所述减毒株的基因组RNA对应的cDNA 编码的S蛋白第678-685位氨基酸缺失)。经试验发现，该发生缺失突变的病毒株在细胞和小鼠体内的复制能力显著降低，体现明确的减毒特征。

本发明第一方面提供一株SARS-CoV-2减毒株，相比于野生型SARS-CoV-2，所述减毒株的基因组RNA对应的cDNA具有自5’末端起第23597-23617位核苷酸的缺失。

本发明的SARS-CoV-2减毒株中，除了以上缺失突变，还可以包括一些沉默的点突变，如 G11083T和A17829G，以及疏水性无明显变化的氨基酸突变，如A21768G和G25785T。上述点突变对于该毒株的性能不会产生影响。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述减毒株的基因组RNA对应的cDNA如核苷酸序列SEQ ID NO:1所示。

本发明中，在已知病毒基因组序列的基础上，本领域技术人员能够利用全基因合成等方法构建出相应的减毒株，在此不再赘述。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述减毒株中，S蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

根据本发明的优选实施方式，其中，减毒株的基因组RNA对应的cDNA中，自5’末端起第 23597-23617位缺失的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明第二方面提供一种包含SARS-CoV-2减毒病毒株的全基因组cDNA的DNA分子，所述 DNA分子自5’末端起第23597-23617位核苷酸缺失。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述cDNA的序列如核苷酸序列SEQ ID NO:1所示。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述DNA分子自5’末端起第23597-23617位缺失的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明第三方面提供如上所述的减毒株和/或DNA分子在治疗和/或预防新冠肺炎中的应用。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述应用可以以任意本领域现有的方式或形式进行。例如，利用该减毒株和/或DNA分子通过体外实验(例如细胞实验等)进行SARS-CoV-2致病机理的研究，利用该减毒株和/或DNA分子通过模式生物(例如小鼠等)进行治疗和/或预防新冠肺炎的方法研究，利用该减毒株和/或DNA分子和/或方法通过模式生物(例如小鼠等)进行治疗和/或预防新冠肺炎的药物研究等。

本发明第四方面提供如上所述的减毒株和/或DNA分子在研究和/或制备SARS-CoV-2病毒疫苗中的应用。

由于该减毒株在体内和/体外实验中显示出复制能力降低的特征，提示对该毒株进行操作的生物安全要求可能降低(例如，对其进行研究的实验室生物安全等级要求可能降低至生物安全2级水平等)。

本发明第五方面提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物中含有活性成分和辅料，所述活性成分包括如上所述的减毒株和/或DNA分子。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述活性成分为灭活后的所述减毒株和/或所述DNA分子。

所述灭活可以通过任意本领域现有的制备灭活疫苗的方式进行。例如，根据本发明的优选实施方式，其中，所述灭活的方式可以选自甲醛灭活和/或β-丙内酯灭活。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述活性成分为减活后的所述减毒株和/或所述DNA分子。

所述减活可以通过任意本领域现有的制备减活疫苗的方式进行。例如，根据本发明的优选实施方式，其中，所述减活的方式可以选自连续传代和/或基因工程改造。

所述辅料可以为任意本领域现有用于疫苗制备的辅料。根据本发明的优选实施方式，其中，所述辅料可以选自：吸附剂、防腐剂、稳定剂和乳化剂中的至少一种。

优选地，所述吸附剂选自铝佐剂，例如氢氧化铝凝胶、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾和钾明矾等。

优选地，所述防腐剂选自硫柳汞等。

优选地，所述稳定剂选自明胶、山梨糖醇、糖分子蔗糖和乳糖等。

优选地，所述乳化剂选自泊洛沙姆、聚氧乙烯蓖麻油、吐温等。

以下将通过具体实施例对本发明进行进一步详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于进一步解释和说明本发明，而不用于限制本发明。

以下实施例中，所述新冠病毒临床分离株V34分离自新冠病毒感染的患者的鼻拭子样本。该研究已获得相关人员的知情同意。Vero细胞和Caco-2细胞购自美国生物样本培养物保藏中心(ATCC)。 Huh7细胞购自日本细胞保藏中心(JCRB)。SARS-CoV-2的S蛋白的特异抗体购自Sino Biological 公司。PFA购自武汉塞维尔科技有限公司。hACE2基因敲入小鼠由中国食品药品检定研究院提供。 BALB/c小鼠和地鼠均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠IgG 抗体购自中杉金桥公司。DAPI(6-二脒基-2-苯基吲哚)购自Sigma公司。

以下实施例中采用的其他试剂、材料等均购自正规生物或化学试剂/耗材供应商。

以下实施例中，实时定量RT-PCR通过Roche公司的LightCycler480 Il PCR仪完成。

以下实施例中，所述“室温”在未做特殊说明的情况下指的是25±5℃。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的SARS-CoV-2减毒株(缺失突变株)的发现及其基因组特征。

本实施例中，所述空斑试验的方式为：将含有病毒的细胞培养上清用无血清的DMEM培养基进行10倍系列稀释，将各稀释度液体以250ul/孔加入铺于24孔板中的Vero细胞，于37℃，5％CO

将新冠病毒临床分离株V34(其全基因组RNA对应的cDNA序列如核苷酸序列SEQ IDNO:4 所示)以MOI＝0.1的接种剂量感染铺于6孔板中的Vero细胞(约200000个细胞/孔)。于37℃，5％ CO

将P1毒株以MOI＝0.1的接种剂量感染6孔板中的Vero细胞(约2×10

依照上述方式将该病毒连续在Vero细胞中传代5次，获得第五代毒株，命名为P5(其全基因组RNA对应的cDNA序列如核苷酸序列SEQ ID NO:1所示)。

使用病毒核酸提取试剂盒Viral RNA mini(购自Qiagen)，按照试剂盒操作说明提取V34和P5 毒株的病毒RNA，采用Invitrogen SuperScript III One-Step RT-PCR试剂盒扩增获得其S蛋白基因序列。

相关引物名称和序列为：

S22-F(上游引物，SEQ ID NO:6)：

5’-GATTACGCCAAGCTTTACAATCTAGTCAAGCGTGGCAACCG-3’；

S22-R(下游引物，SEQ ID NO:7)：

5’-GATTACGCCAAGCTTCAATAAGTAGGGACTGGGTCTTC-3’；

S23-F(上游引物，SEQ ID NO:8)：

5’-GATTACGCCAAGCTTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGG-3’；

S23-R(下游引物，SEQ ID NO:9)：

5’-GATTACGCCAAGCTTGCACCAAGTGACATAGTGTAGGC-3’；

S24-F(上游引物，SEQ ID NO:10)：

5’-GATTACGCCAAGCTTCCGTGATCCACAGACACTTGAGA-3’；

S24-R(下游引物，SEQ ID NO:11)：

5’-GATTACGCCAAGCTTCAGCAACTGGTCATACAGCAAAGC-3’；

S25-F(上游引物，SEQ ID NO:12)：

5’-GATTACGCCAAGCTTCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAA-3’；

S25-R(下游引物，SEQ ID NO:13)：

5’-GATTACGCCAAGCTTGAGCCACATCAAGCCTACAAGACA-3’。

具体方法为：利用上述引物，采用表1中的反应体系，按照表2中的条件进行RT-PCR扩增。

表1 RT-PCR反应体系

表2 RT-PCR反应条件

*该时间根据扩增序列长度，按照1000bp/60s计算获得。

扩增获得的目的片段由北京诺赛基因公司完成测序。利用Lasergen软件对V34和P5病毒的S 基因进行序列比对，结果如图1所示。从中可以看出，与V34相比，P5毒株S蛋白中的S1/S2切割位点上游缺失21个核苷酸(如SEQ ID NO:3所示)，导致缺失7个氨基酸残基(NSPRRAR)。V34 和P5的S蛋白氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:2所示。

以下实施例中，为表述清晰，分别将V34和P5毒株分别命名为WT和DEL-7aa。

实施例2

本实施例用于说明SARS-CoV-2缺失突变毒株DEL-7aa在不同细胞中的复制能力。

将WT和DEL-7aa毒株以MOI＝0.1的接种剂量分别感染铺于24孔板中的Vero(绿猴肾细胞，约200000个细胞/孔)、Huh7(人肝癌细胞，约200000个细胞/孔)和Caco-2(人肺上皮细胞，约200000 个细胞/孔)。于感染后24h、48h和72h收取上述三种细胞培养上清，同时于各收样时间点用4％PFA 固定细胞，用于后续的间接免疫荧光法检测病毒蛋白表达。使用病毒核酸提取试剂盒Viral RNA mini (购自Qiagen)，按照试剂盒操作说明提取培养上清中的病毒RNA，通过实时定量RT-PCR检测病毒RNA拷贝数，引物和探针的序列如下：

CoV-F3(上游引物，SEQ ID NO:14)：

5’-TCCTGGTGATTCTTCTTCAGGT-3’；

CoV-R3(下游引物，SEQ ID NO:15)：

5’-TCTGAGAGAGGGTCAAGTGC-3’；

CoV-P3(探针，SEQ ID NO:16)：

5’-FAM-AGCTGCAGCACCAGCTGTCCA-BHQ1-3’。

反应体系如表3所示，反应条件如表4所示。

表3实时定量RT-PCR反应体系

表4实时定量RT-PCR反应条件

本实施例中，间接免疫荧光试验的方法如下：将感染了病毒的细胞上清移去，用PBS清洗2次，加入4％多聚甲醛，室温固定4h，将24孔板中的铺有细胞的玻片移入新的24孔板中。将SARS-CoV-2 的S蛋白单抗用PBS缓冲液按1:1500稀释后，与抗原片中的细胞在37℃孵育约1.5h，用PBS缓冲液(10mM K

不同时间点培养上清中的病毒RNA拷贝数的结果如图2所示。从中可以看出，WT和DEL-7aa 在Vero细胞中的增殖能力无明显差异，均能在48h达到10

进一步利用SARS-CoV-2的S蛋白的特异抗体，通过间接免疫荧光试验检测感染后48h细胞内病毒蛋白的表达情况，结果如图3所示。从中可以看出，感染后48h，接种了WT和DEL-7aa的Vero 细胞中均能检测到强烈的荧光信号；同时，WT接种的Huh7和Caco-2中也能检测到明显的荧光信号，但接种了DEL-7aa后，均未在上述2种细胞中检测到荧光信号。上述结果表明，病毒在S蛋白中缺失了7个氨基酸后，其在Huh7和Caco-2这2种人类细胞中的病毒蛋白表达能力受到显著抑制。

实施例3

本实施例用于说明SARS-CoV-2缺失突变株DEL-7aa在小鼠体内的增殖能力。

将WT和DEL-7aa以30000PFU/只的剂量，经滴鼻途径接种6周龄的hACE2基因敲入小鼠，于感染后第5天处死小鼠并取出小鼠的肺组织。用1ml DMEM将肺组织(约0.1g)重悬并研磨，7000 rpm离心10min，留取组织研磨液上清。使用病毒核酸提取试剂盒Viral RNAmini(购自Qiagen)，按照试剂盒操作说明提取上清中的病毒RNA，通过实时定量RT-PCR检测病毒RNA拷贝数。结果如图4所示，从中可以看出，WT在小鼠肺中能增殖到10

实施例4

本实施例用于说明灭活的SARS-CoV-2缺失突变株DEL-7aa能够为小鼠提供有效的免疫保护。

将β-丙内脂以1:3000的体积比加入含有SARS-CoV-2缺失突变株DEL-7aa的细胞培养上清(其中DEL-7aa的滴度为20000000PFU/ml)，置4℃处理16h。再通过分子筛和亲和纯化层析获取灭活病毒颗粒，进一步与铝佐剂(氢氧化铝)混合，制备获得灭活病毒制剂。将灭活病毒以1.25ug/只和 2.5ug/只的剂量，经肌肉注射途径免疫4周龄BALB/c雌鼠，免疫后第14天，再以相同剂量加强免疫一次。同时设立PBS组作为对照，以与灭活病毒制剂等量的PBS对该组小鼠进行给药。首次免疫后第30天，经滴鼻途径接种新冠病毒株p6(60000PFU/只)至各组小鼠。于感染后第5天取小鼠肺组织和气管。用1ml DMEM将肺组织(约0.1g)和气管组织(约0.03g)重悬并研磨，7000rpm离心 10min，留取组织研磨液上清。使用病毒核酸提取试剂盒Viral RNA mini(购自Qiagen)，按照试剂盒操作说明提取上清中的病毒RNA，通过实时定量RT-PCR检测病毒RNA拷贝数。结果如图5所示，从中可以看出，1.25ug和2.5ug组的小鼠肺组织中的病毒核酸分别比PBS组降低约1000倍和3000倍，气管中的病毒核酸分别降低10倍和1000倍，呈现出明显的保护效果。这说明本发明提供的减毒株 DEL-7aa具有制备用于预防新冠肺炎的疫苗制品的前景。

实施例5

本实施例用于说明SARS-CoV-2缺失突变株DEL-7aa能够为地鼠提供有效的免疫保护。

将10

进一步于接种后30天经滴鼻途径感染野生型SARS-CoV-2，于感染后第5天取地鼠肺组织，用 1ml DMEM将肺组织(约0.1g)重悬并研磨，7000rpm离心10min，留取组织研磨液上清。使用病毒核酸提取试剂盒Viral RNA mini(购自Qiagen)，按照试剂盒操作说明提取上清中的病毒RNA，通过实时定量RT-PCR检测病毒RNA拷贝数。结果如图6和图7所示，接种了缺失突变株DEL-7aa 的地鼠血清中的中和抗体滴度的几何平均值(GMT)分别为776和933，攻毒后PBS组地鼠的肺组织中的病毒核酸含量为109.64RNA拷贝数/g，而免疫组地鼠的肺中未检测到病毒核酸。上述结果表明，SARS-CoV-2缺失突变株DEL-7aa接种地鼠后能产生高水平的中和抗体，并能够为地鼠提供有效的免疫保护。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> SARS-CoV-2减毒株及其在预防新冠肺炎中的应用

<130> YXI64293JSY

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29882

<212> DNA

<213> 减毒株DEL-7aa的全基因组cDNA

<400> 1

attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60

gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120

cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180

ttctgtaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240

cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac 300

acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg 360

agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg 420

cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa 480

acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact 540

cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg 600

cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 660

tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga 720

tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga 780

actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg 840

ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 900

atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg 960

tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca 1020

gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080

ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140

gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg 1200

caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1260

gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga 1320

aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1380

atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1440

cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1500

ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560

ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620

aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680

gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740

aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800

aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860

tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920

tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980

aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040

taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100

gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160

agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat 2220

ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280

ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340

tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400

ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460

tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520

aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580

agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640

aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2700

cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760

agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820

acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880

ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940

actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000

tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060

agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120

agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180

agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240

cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300

agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360

aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420

aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480

aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540

tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600

acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660

gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720

tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780

tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840

aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900

gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960

caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020

cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080

tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140

agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200

gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260

gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320

cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380

ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440

tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500

agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560

gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620

tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680

agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740

ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800

agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860

taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920

ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980

aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040

acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100

acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160

tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220

cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280

caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340

acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400

acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460

gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520

taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580

cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640

agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700

tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760

gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820

acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880

ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940

tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000

tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060

tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120

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gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300

tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360

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aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540

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aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780

ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840

atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900

ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960

gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020

tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080

ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7140

tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200

atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260

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ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380

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ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac 7860

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agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040

tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100

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tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280

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tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400

atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460

tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520

tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580

gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640

tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700

tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760

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ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060

ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac 9120

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tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240

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ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt 9600

gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt 9660

cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720

tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780

tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840

gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa 9900

taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960

tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc 10020

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cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740

ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800

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agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga 10920

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agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttttatgaaa atgccttttt 11100

accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160

gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220

ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac 11280

tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact 11340

aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat 11400

gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 11460

catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 11520

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tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg 11640

ttactttggc ctcttttgtt tactcaaccg ctactttaga ctgactcttg gtgtttatga 11700

ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa 11760

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tatcaaagta gccactgtac agtctaaaat gtcagatgta aagtgcacat cagtagtctt 11880

actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt 11940

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acaagctggt aatgcaacag aagtgcctgc caattcaact gtattatctt tctgtgcttt 13080

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aaaaacagta aagtacaaat aggagagtac acctttgaaa aaggtgacta tggtgatgct 16860

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tgctctcatg ccgctgttga tgcactatgt gagaaggcat taaaatattt gcctatagat 17220

aaatgtagta gaattatacc tgcacgtgct cgtgtagagt gttttgataa attcaaagtg 17280

aattcaacat tagaacagta tgtcttttgt actgtaaatg cattgcctga gacgacagca 17340

gatatagttg tctttgatga aatttcaatg gccacaaatt atgatttgag tgttgtcaat 17400

gccagattac gtgctaagca ctatgtgtac attggcgacc ctgctcaatt acctgcacca 17460

cgcacattgc taactaaggg cacactagaa ccagaatatt tcaattcagt gtgtagactt 17520

atgaaaacta taggtccaga catgttcctc ggaacttgtc ggcgttgtcc tgctgaaatt 17580

gttgacactg tgagtgcttt ggtttatgat aataagctta aagcacataa agacaaatca 17640

gctcaatgct ttaaaatgtt ttataagggt gttatcacgc atgatgtttc atctgcaatt 17700

aacaggccac aaataggcgt ggtaagagaa ttccttacac gtaaccctgc ttggagaaaa 17760

gctgtcttta tttcacctta taattcacag aatgctgtag cctcaaagat tttgggacta 17820

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accactgaaa cagctcactc ttgtaatgta aacagattta atgttgctat taccagagca 17940

aaagtaggca tactttgcat aatgtctgat agagaccttt atgacaagtt gcaatttaca 18000

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caaatgttaa gtgacacact taaaaatctc tctgacagag tcgtatttgt cttatgggca 18600

catggctttg agttgacatc tatgaagtat tttgtgaaaa taggacctga gcgcacctgt 18660

tgtctatgtg atagacgtgc cacatgcttt tccactgctt cagacactta tgcctgttgg 18720

catcattcta ttggatttga ttacgtctat aatccgttta tgattgatgt tcaacaatgg 18780

ggttttacag gtaacctaca aagcaaccat gatctgtatt gtcaagtcca tggtaatgca 18840

catgtagcta gttgtgatgc aatcatgact aggtgtctag ctgtccacga gtgctttgtt 18900

aagcgtgttg actggactat tgaatatcct ataattggtg atgaactgaa gattaatgcg 18960

gcttgtagaa aggttcaaca catggttgtt aaagctgcat tattagcaga caaattccca 19020

gttcttcacg acattggtaa ccctaaagct attaagtgtg tacctcaagc tgatgtagaa 19080

tggaagttct atgatgcaca gccttgtagt gacaaagctt ataaaataga agaattattc 19140

tattcttatg ccacacattc tgacaaattc acagatggtg tatgcctatt ttggaattgc 19200

aatgtcgata gatatcctgc taattccatt gtttgtagat ttgacactag agtgctatct 19260

aaccttaact tgcctggttg tgatggtggc agtttgtatg taaataaaca tgcattccac 19320

acaccagctt ttgataaaag tgcttttgtt aatttaaaac aattaccatt tttctattac 19380

tctgacagtc catgtgagtc tcatggaaaa caagtagtgt cagatataga ttatgtacca 19440

ctaaagtctg ctacgtgtat aacacgttgc aatttaggtg gtgctgtctg tagacatcat 19500

gctaatgagt acagattgta tctcgatgct tataacatga tgatctcagc tggctttagc 19560

ttgtgggttt acaaacaatt tgatacttat aacctctgga acacttttac aagacttcag 19620

agtttagaaa atgtggcttt taatgttgta aataagggac actttgatgg acaacagggt 19680

gaagtaccag tttctatcat taataacact gtttacacaa aagttgatgg tgttgatgta 19740

gaattgtttg aaaataaaac aacattacct gttaatgtag catttgagct ttgggctaag 19800

cgcaacatta aaccagtacc agaggtgaaa atactcaata atttgggtgt ggacattgct 19860

gctaatactg tgatctggga ctacaaaaga gatgctccag cacatatatc tactattggt 19920

gtttgttcta tgactgacat agccaagaaa ccaactgaaa cgatttgtgc accactcact 19980

gtcttttttg atggtagagt tgatggtcaa gtagacttat ttagaaatgc ccgtaatggt 20040

gttcttatta cagaaggtag tgttaaaggt ttacaaccat ctgtaggtcc caaacaagct 20100

agtcttaatg gagtcacatt aattggagaa gccgtaaaaa cacagttcaa ttattataag 20160

aaagttgatg gtgttgtcca acaattacct gaaacttact ttactcagag tagaaattta 20220

caagaattta aacccaggag tcaaatggaa attgatttct tagaattagc tatggatgaa 20280

ttcattgaac ggtataaatt agaaggctat gccttcgaac atatcgttta tggagatttt 20340

agtcatagtc agttaggtgg tttacatcta ctgattggac tagctaaacg ttttaaggaa 20400

tcaccttttg aattagaaga ttttattcct atggacagta cagttaaaaa ctatttcata 20460

acagatgcgc aaacaggttc atctaagtgt gtgtgttctg ttattgattt attacttgat 20520

gattttgttg aaataataaa atcccaagat ttatctgtag tttctaaggt tgtcaaagtg 20580

actattgact atacagaaat ttcatttatg ctttggtgta aagatggcca tgtagaaaca 20640

ttttacccaa aattacaatc tagtcaagcg tggcaaccgg gtgttgctat gcctaatctt 20700

tacaaaatgc aaagaatgct attagaaaag tgtgaccttc aaaattatgg tgatagtgca 20760

acattaccta aaggcataat gatgaatgtc gcaaaatata ctcaactgtg tcaatattta 20820

aacacattaa cattagctgt accctataat atgagagtta tacattttgg tgctggttct 20880

gataaaggag ttgcaccagg tacagctgtt ttaagacagt ggttgcctac gggtacgctg 20940

cttgtcgatt cagatcttaa tgactttgtc tctgatgcag attcaacttt gattggtgat 21000

tgtgcaactg tacatacagc taataaatgg gatctcatta ttagtgatat gtacgaccct 21060

aagactaaaa atgttacaaa agaaaatgac tctaaagagg gttttttcac ttacatttgt 21120

gggtttatac aacaaaagct agctcttgga ggttccgtgg ctataaagat aacagaacat 21180

tcttggaatg ctgatcttta taagctcatg ggacacttcg catggtggac agcctttgtt 21240

actaatgtga atgcgtcatc atctgaagca tttttaattg gatgtaatta tcttggcaaa 21300

ccacgcgaac aaatagatgg ttatgtcatg catgcaaatt acatattttg gaggaataca 21360

aatccaattc agttgtcttc ctattcttta tttgacatga gtaaatttcc ccttaaatta 21420

aggggtactg ctgttatgtc tttaaaagaa ggtcaaatca atgatatgat tttatctctt 21480

cttagtaaag gtagacttat aattagagaa aacaacagag ttgttatttc tagtgatgtt 21540

cttgttaaca actaaacgaa caatgtttgt ttttcttgtt ttattgccac tagtctctag 21600

tcagtgtgtt aatcttacaa ccagaactca attaccccct gcatacacta attctttcac 21660

acgtggtgtt tattaccctg acaaagtttt cagatcctca gttttacatt caactcagga 21720

cttgttctta cctttctttt ccaatgttac ttggttccat gctatacgtg tctctgggac 21780

caatggtact aagaggtttg ataaccctgt cctaccattt aatgatggtg tttattttgc 21840

ttccactgag aagtctaaca taataagagg ctggattttt ggtactactt tagattcgaa 21900

gacccagtcc ctacttattg ttaataacgc tactaatgtt gttattaaag tctgtgaatt 21960

tcaattttgt aatgatccat ttttgggtgt ttattaccac aaaaacaaca aaagttggat 22020

ggaaagtgag ttcagagttt attctagtgc gaataattgc acttttgaat atgtctctca 22080

gccttttctt atggaccttg aaggaaaaca gggtaatttc aaaaatctta gggaatttgt 22140

gtttaagaat attgatggtt attttaaaat atattctaag cacacgccta ttaatttagt 22200

gcgtgatctc cctcagggtt tttcggcttt agaaccattg gtagatttgc caataggtat 22260

taacatcact aggtttcaaa ctttacttgc tttacataga agttatttga ctcctggtga 22320

ttcttcttca ggttggacag ctggtgctgc agcttattat gtgggttatc ttcaacctag 22380

gacttttcta ttaaaatata atgaaaatgg aaccattaca gatgctgtag actgtgcact 22440

tgaccctctc tcagaaacaa agtgtacgtt gaaatccttc actgtagaaa aaggaatcta 22500

tcaaacttct aactttagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac 22560

aaacttgtgc ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg 22620

gaacaggaag agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcatc 22680

attttccact tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac 22740

taatgtctat gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg 22800

gcaaactgga aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt 22860

tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta 22920

tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta 22980

tcaggccggt agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca 23040

atcatatggt ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact 23100

ttcttttgaa cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt 23160

ggttaaaaac aaatgtgtca atttcaactt caatggttta acaggcacag gtgttcttac 23220

tgagtctaac aaaaagtttc tgcctttcca acaatttggc agagacattg ctgacactac 23280

tgatgctgtc cgtgatccac agacacttga gattcttgac attacaccat gttcttttgg 23340

tggtgtcagt gttataacac caggaacaaa tacttctaac caggttgctg ttctttatca 23400

ggatgttaac tgcacagaag tccctgttgc tattcatgca gatcaactta ctcctacttg 23460

gcgtgtttat tctacaggtt ctaatgtttt tcaaacacgt gcaggctgtt taataggggt 23520

tgaacatgtc aacaactcat atgagtgtga catacccatt ggtgcaggta tatgcgctag 23580

ttatcagact cagactagtg tagctagtca atccatcatt gcctacacta tgtcacttgg 23640

tgcagaaaat tcagttgctt actctaataa ctctattgcc atacccacaa attttactat 23700

tagtgttacc acagaaattc taccagtgtc tatgaccaag acatcagtag attgtacaat 23760

gtacatttgt ggtgattcaa ctgaatgcag caatcttttg ttgcaatatg gcagtttttg 23820

tacacaatta aaccgtgctt taactggaat agctgttgaa caagacaaaa acacccaaga 23880

agtttttgca caagtcaaac aaatttacaa aacaccacca attaaagatt ttggtggttt 23940

taatttttca caaatattac cagatccatc aaaaccaagc aagaggtcat ttattgaaga 24000

tctacttttc aacaaagtga cacttgcaga tgctggcttc atcaaacaat atggtgattg 24060

ccttggtgat attgctgcta gagacctcat ttgtgcacaa aagtttaacg gccttactgt 24120

tttgccacct ttgctcacag atgaaatgat tgctcaatac acttctgcac tgttagcggg 24180

tacaatcact tctggttgga cctttggtgc aggtgctgca ttacaaatac catttgctat 24240

gcaaatggct tataggttta atggtattgg agttacacag aatgttctct atgagaacca 24300

aaaattgatt gccaaccaat ttaatagtgc tattggcaaa attcaagact cactttcttc 24360

cacagcaagt gcacttggaa aacttcaaga tgtggtcaac caaaatgcac aagctttaaa 24420

cacgcttgtt aaacaactta gctccaattt tggtgcaatt tcaagtgttt taaatgatat 24480

cctttcacgt cttgacaaag ttgaggctga agtgcaaatt gataggttga tcacaggcag 24540

acttcaaagt ttgcagacat atgtgactca acaattaatt agagctgcag aaatcagagc 24600

ttctgctaat cttgctgcta ctaaaatgtc agagtgtgta cttggacaat caaaaagagt 24660

tgatttttgt ggaaagggct atcatcttat gtccttccct cagtcagcac ctcatggtgt 24720

agtcttcttg catgtgactt atgtccctgc acaagaaaag aacttcacaa ctgctcctgc 24780

catttgtcat gatggaaaag cacactttcc tcgtgaaggt gtctttgttt caaatggcac 24840

acactggttt gtaacacaaa ggaattttta tgaaccacaa atcattacta cagacaacac 24900

atttgtgtct ggtaactgtg atgttgtaat aggaattgtc aacaacacag tttatgatcc 24960

tttgcaacct gaattagact cattcaagga ggagttagat aaatatttta agaatcatac 25020

atcaccagat gttgatttag gtgacatctc tggcattaat gcttcagttg taaacattca 25080

aaaagaaatt gaccgcctca atgaggttgc caagaattta aatgaatctc tcatcgatct 25140

ccaagaactt ggaaagtatg agcagtatat aaaatggcca tggtacattt ggctaggttt 25200

tatagctggc ttgattgcca tagtaatggt gacaattatg ctttgctgta tgaccagttg 25260

ctgtagttgt ctcaagggct gttgttcttg tggatcctgc tgcaaatttg atgaagacga 25320

ctctgagcca gtgctcaaag gagtcaaatt acattacaca taaacgaact tatggatttg 25380

tttatgagaa tcttcacaat tggaactgta actttgaagc aaggtgaaat caaggatgct 25440

actccttcag attttgttcg cgctactgca acgataccga tacaagcctc actccctttc 25500

ggatggctta ttgttggcgt tgcacttctt gctgtttttc agagcgcttc caaaatcata 25560

accctcaaaa agagatggca actagcactc tccaagggtg ttcactttgt ttgcaacttg 25620

ctgttgttgt ttgtaacagt ttactcacac cttttgctcg ttgctgctgg ccttgaagcc 25680

ccttttctct atctttatgc tttagtctac ttcttgcaga gtataaactt tgtaagaata 25740

ataatgaggc tttggctttg ctgtaaatgc cgttccaaaa acccattact ttatgatgcc 25800

aactattttc tttgctggca tactaattgt tacgactatt gtatacctta caatagtgta 25860

acttcttcaa ttgtcattac ttcaggtgat ggcacaacaa gtcctatttc tgaacatgac 25920

taccagattg gtggttatac tgaaaaatgg gaatctggag taaaagactg tgttgtatta 25980

cacagttact tcacttcaga ctattaccag ctgtactcaa ctcaattgag tacagacact 26040

ggtgttgaac atgttacctt cttcatctac aataaaattg ttgatgagcc tgaagaacat 26100

gtccaaattc acacaatcga cggttcatcc ggagttgtta atccagtaat ggaaccaatt 26160

tatgatgaac cgacgacgac tactagcgtg cctttgtaag cacaagctga tgagtacgaa 26220

cttatgtact cattcgtttc ggaagagaca ggtacgttaa tagttaatag cgtacttctt 26280

tttcttgctt tcgtggtatt cttgctagtt acactagcca tccttactgc gcttcgattg 26340

tgtgcgtact gctgcaatat tgttaacgtg agtcttgtaa aaccttcttt ttacgtttac 26400

tctcgtgtta aaaatctgaa ttcttctaga gttcctgatc ttctggtcta aacgaactaa 26460

atattatatt agtttttctg tttggaactt taattttagc catggcagat tccaacggta 26520

ctattaccgt tgaagagctt aaaaagctcc ttgaacaatg gaacctagta ataggtttcc 26580

tattccttac atggatttgt cttctacaat ttgcctatgc caacaggaat aggtttttgt 26640

atataattaa gttaattttc ctctggctgt tatggccagt aactttagct tgttttgtgc 26700

ttgctgctgt ttacagaata aattggatca ccggtggaat tgctatcgca atggcttgtc 26760

ttgtaggctt gatgtggctc agctacttca ttgcttcttt cagactgttt gcgcgtacgc 26820

gttccatgtg gtcattcaat ccagaaacta acattcttct caacgtgcca ctccatggca 26880

ctattctgac cagaccgctt ctagaaagtg aactcgtaat cggagctgtg atccttcgtg 26940

gacatcttcg tattgctgga caccatctag gacgctgtga catcaaggac ctgcctaaag 27000

aaatcactgt tgctacatca cgaacgcttt cttattacaa attgggagct tcgcagcgtg 27060

tagcaggtga ctcaggtttt gctgcataca gtcgctacag gattggcaac tataaattaa 27120

acacagacca ttccagtagc agtgacaata ttgctttgct tgtacagtaa gtgacaacag 27180

atgtttcatc tcgttgactt tcaggttact atagcagaga tattactaat tattatgagg 27240

acttttaaag tttccatttg gaatcttgat tacatcataa acctcataat taaaaattta 27300

tctaagtcac taactgagaa taaatattct caattagatg aagagcaacc aatggagatt 27360

gattaaacga acatgaaaat tattcttttc ttggcactga taacactcgc tacttgtgag 27420

ctttatcact accaagagtg tgttagaggt acaacagtac ttttaaaaga accttgctct 27480

tctggaacat acgagggcaa ttcaccattt catcctctag ctgataacaa atttgcactg 27540

acttgcttta gcactcaatt tgcttttgct tgtcctgacg gcgtaaaaca cgtctatcag 27600

ttacgtgcca gatcagtttc acctaaactg ttcatcagac aagaggaagt tcaagaactt 27660

tactctccaa tttttcttat tgttgcggca atagtgttta taacactttg cttcacactc 27720

aaaagaaaga cagaatgatt gaactttcat taattgactt ctatttgtgc tttttagcct 27780

ttctgctatt ccttgtttta attatgctta ttatcttttg gttctcactt gaactgcaag 27840

atcataatga aacttgtcac gcctaaacga acatgaaatt tcttgttttc ttaggaatca 27900

tcacaactgt agctgcattt caccaagaat gtagtttaca gtcatgtact caacatcaac 27960

catatgtagt tgatgacccg tgtcctattc acttctattc taaatggtat attagagtag 28020

gagctagaaa atcagcacct ttaattgaat tgtgcgtgga tgaggctggt tctaaatcac 28080

ccattcagta catcgatatc ggtaattata cagtttcctg tttacctttt acaattaatt 28140

gccaggaacc taaattgggt agtcttgtag tgcgttgttc gttctatgaa gactttttag 28200

agtatcatga cgttcgtgtt gttttagatt tcatctaaac gaacaaacta aaatgtctga 28260

taatggaccc caaaatcagc gaaatgcacc ccgcattacg tttggtggac cctcagattc 28320

aactggcagt aaccagaatg gagaacgcag tggggcgcga tcaaaacaac gtcggcccca 28380

aggtttaccc aataatactg cgtcttggtt caccgctctc actcaacatg gcaaggaaga 28440

ccttaaattc cctcgaggac aaggcgttcc aattaacacc aatagcagtc cagatgacca 28500

aattggctac taccgaagag ctaccagacg aattcgtggt ggtgacggta aaatgaaaga 28560

tctcagtcca agatggtatt tctactacct aggaactggg ccagaagctg gacttcccta 28620

tggtgctaac aaagacggca tcatatgggt tgcaactgag ggagccttga atacaccaaa 28680

agatcacatt ggcacccgca atcctgctaa caatgctgca atcgtgctac aacttcctca 28740

aggaacaaca ttgccaaaag gcttctacgc agaagggagc agaggcggca gtcaagcctc 28800

ttctcgttcc tcatcacgta gtcgcaacag ttcaagaaat tcaactccag gcagcagtag 28860

gggaacttct cctgctagaa tggctggcaa tggcggtgat gctgctcttg ctttgctgct 28920

gcttgacaga ttgaaccagc ttgagagcaa aatgtctggt aaaggccaac aacaacaagg 28980

ccaaactgtc actaagaaat ctgctgctga ggcttctaag aagcctcggc aaaaacgtac 29040

tgccactaaa gcatacaatg taacacaagc tttcggcaga cgtggtccag aacaaaccca 29100

aggaaatttt ggggaccagg aactaatcag acaaggaact gattacaaac attggccgca 29160

aattgcacaa tttgccccca gcgcttcagc gttcttcgga atgtcgcgca ttggcatgga 29220

agtcacacct tcgggaacgt ggttgaccta cacaggtgcc atcaaattgg atgacaaaga 29280

tccaaatttc aaagatcaag tcattttgct gaataagcat attgacgcat acaaaacatt 29340

cccaccaaca gagcctaaaa aggacaaaaa gaagaaggct gatgaaactc aagccttacc 29400

gcagagacag aagaaacagc aaactgtgac tcttcttcct gctgcagatt tggatgattt 29460

ctccaaacaa ttgcaacaat ccatgagcag tgctgactca actcaggcct aaactcatgc 29520

agaccacaca aggcagatgg gctatataaa cgttttcgct tttccgttta cgatatatag 29580

tctactcttg tgcagaatga attctcgtaa ctacatagca caagtagatg tagttaactt 29640

taatctcaca tagcaatctt taatcagtgt gtaacattag ggaggacttg aaagagccac 29700

cacattttca ccgaggccac gcggagtacg atcgagtgta cagtgaacaa tgctagggag 29760

agctgcctat atggaagagc cctaatgtgt aaaattaatt ttagtagtgc tatccccatg 29820

tgattttaat agcttcttag gagaatgaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 29880

aa 29882

<210> 2

<211> 1266

<212> PRT

<213> 减毒株DEL-7aa的S蛋白

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile Arg Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Val Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr

675 680 685

Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser

690 695 700

Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu

705 710 715 720

Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys

725 730 735

Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe

740 745 750

Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp

755 760 765

Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr

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Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro

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Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe

805 810 815

Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp

820 825 830

Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe

835 840 845

Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala

850 855 860

Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr

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Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala

885 890 895

Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn

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Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln

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Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val

930 935 940

Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser

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Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg

965 970 975

Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly

980 985 990

Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala

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Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser

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Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys

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Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val

1040 1045 1050

Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe

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Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro

1070 1075 1080

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Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp

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Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys

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<212> DNA

<213> 减毒株DEL-7aa的S基因发生缺失突变的核苷酸序列

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<212> DNA

<213> 分离株V34的全基因组cDNA

<400> 4