一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法

技术领域

本发明属于流感病毒核酸检测技术领域，具体来说是一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法。

背景技术

流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，春冬季节高发，传播迅速，发病率高，流行期短，易引起暴发流行或大流行，控制难度较大。流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。流感病毒主要经空气飞沫传播，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。由于这些病毒引起的感染症状和流行特点相似，仅靠临床症状对病原进行区分非常不可靠，实验室诊断方法有病毒分离、抗原检测与核酸检测等。

目前国内应用荧光PCR技术进行甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸检测的试剂盒主要为单重核酸检测试剂盒及甲/乙流通用检测试剂盒。这些试剂盒或是不能同时检测甲型流感病毒和乙型流感病毒；或是无法区分甲型流感和乙型流感，且操作时间较长，操作繁琐。而实际临床使用及疾病预防控制系统在追踪和分析病原体时常常要区分病原体种类和型别。

因此，亟需一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便的甲型流感病毒、乙型流感病毒检测方法。

发明内容

1.发明要解决的技术问题

本发明的目的在于解决现有的甲型流感病毒、乙型流感病毒检测不够便捷且难以对结果准确性进行评估的问题。

2.技术方案

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，包括核酸扩增反应液、酶混合液、甲/乙型流感病毒混合反应液、阳性对照液、弱阳性对照液和阴性对照液。

优选的，所述甲/乙型流感病毒混合反应液包括甲型流感病毒上游引物、甲型流感病毒下游引物、甲型流感病毒探针、乙型流感病毒上游引物、乙型流感病毒下游引物、乙型流感病毒探针、内参RNase P上游引物、内参RNase P下游引物、内参RNase P探针和DEPC水。

优选的，所述核酸扩增反应液包括核苷酸混合液、Buffer、MgCl

优选的，所述酶混合液包括DNA聚合酶、逆转录酶、UNG酶、RNA酶抑制剂和稀释液。

优选的，所述阳性对照液包括甲型流感病毒病毒样颗粒、乙型流感病毒病毒样颗粒、RNase P病毒样颗粒和TE缓冲液；所述弱阳性对照液为取1μL的阳性对照液与999μL的TE缓冲液混合制成；所述阴性对照为0.9％的氯化钠溶液。

优选的，所述甲型流感病毒上游引物、甲型流感病毒下游引物、甲型流感病毒探针、乙型流感病毒上游引物、乙型流感病毒下游引物、乙型流感病毒探针、内参RNase P上游引物、内参RNase P下游引物、内参RNase P探针。

优选的，所述内参RNase P上游引物的序列为AGATTTGGACCTGCGAGCG，所述内参RNase P下游引物的序列为GAGCGGCTGTCTCCACAAGT，所述内参RNase P探针序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。

优选的，所述甲型流感病毒上游引物的序列为CTCATGGAATGGCTAAAGACAAG，所述甲型流感病毒下游引物的序列为TCCTCGCTCACTGGGCA，所述甲型流感病毒探针的序列为CCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTT，所述乙型流感病毒上游引物的序列为CACCAGAAGAGGGAGACAATTAG，所述乙型流感病毒下游引物的序列为GTCAGCTATTATGGAGCTGTTAGC，所述乙型流感病毒探针的序列为GGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAA。

一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S100、预处理，分别取出核酸扩增反应液、酶混合液、甲/乙型流感病毒混合反应液、阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；

S200、配置反应液并放在PCR反应管中，每个PCR反应管中20μL；

S300、提取核酸；

S400、加样，在步骤S200配置的反应液中分别加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各5μL，盖紧管盖，瞬时离心；

S500、扩增检测，将步骤S400得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增检测；

S600、结合内参检测结果判断样本检测结果。

优选的，所述步骤S200中的配置反应液为核酸扩增反应液12μL/人份、酶混合液4μL/人份、甲/乙型流感病毒混合反应液4μL/人份。

优选的，所述步骤S500中的荧光定量PCR仪的扩增检测循环参数如下：

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3.有益效果

采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，包括核酸扩增反应液、酶混合液、甲/乙型流感病毒混合反应液、阳性对照液、弱阳性对照液和阴性对照液，其中，甲/乙型流感病毒混合反应液包括甲型流感病毒上游引物、甲型流感病毒下游引物、甲型流感病毒探针、乙型流感病毒上游引物、乙型流感病毒下游引物、乙型流感病毒探针、内参RNase P上游引物、内参RNase P下游引物、内参RNase P探针和DEPC水，其中内参是对产品本身内参的检测，本实施例的内参会参与核酸提取到RT-PCR的过程，可用于对样本采集、保存和运输以及核酸提取过程和扩增过程进行监控，避免假阴性判读结果的出现。

附图说明

图1为本发明的甲/乙型流感病毒混合反应液的组分图；

图2为本发明的阳性对照液的组分图；

图3为本发明的酶混合液的组分图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述，附图中给出了本发明的若干实施例，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“固设于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件；当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件；本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明；本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

参照附图1-附图3，本实施例的一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒，包括核酸扩增反应液、酶混合液、甲/乙型流感病毒混合反应液、阳性对照液、弱阳性对照液和阴性对照液。

其中，甲/乙型流感病毒混合反应液包括甲型流感病毒上游引物、甲型流感病毒下游引物、甲型流感病毒探针、乙型流感病毒上游引物、乙型流感病毒下游引物、乙型流感病毒探针、内参RNase P上游引物、内参RNase P下游引物、内参RNase P探针和DEPC水。

核酸扩增反应液包括核苷酸混合液、Buffer、MgCl

酶混合液包括DNA聚合酶、逆转录酶、UNG酶、RNA酶抑制剂和稀释液。

阳性对照液包括甲型流感病毒病毒样颗粒、乙型流感病毒病毒样颗粒、RNase P病毒样颗粒和TE缓冲液；所述弱阳性对照液为取1μL的阳性对照液与999μL的TE缓冲液混合制成；所述阴性对照为0.9％的氯化钠溶液。

甲型流感病毒上游引物、甲型流感病毒下游引物、甲型流感病毒探针、乙型流感病毒上游引物、乙型流感病毒下游引物、乙型流感病毒探针、内参RNase P上游引物、内参RNase P下游引物、内参RNase P探针。

内参RNase P上游引物的序列为AGATTTGGACCTGCGAGCG，所述内参RNase P下游引物的序列为GAGCGGCTGTCTCCACAAGT，所述内参RNase P探针序列为TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。

内参引物的TM值在55-60℃之间，GC含量在30-80％，两条引物的TM值差异小于5℃；扩增长度50-150bp之间；引物3’末端自身错配小于3bp；引物在非靶标序列中，无特异结合位点，或特异结合区域大于1000bp。探针的TM值在60-70℃之间，GC含量在30-80％；探针的5’端第一个碱基不能为G；探针无大于3bp的发夹结构。

本实施例的内参是对产品本身内参的检测，本实施例的内参会参与核酸提取到RT-PCR的过程，可用于对样本采集、保存和运输以及核酸提取过程和扩增过程进行监控，避免假阴性判读结果的出现，而现有的甲乙型流感病毒检测试剂中的内参为外源的含有内参基因片段的慢病毒，不参与提取，只参与扩增，这样只能指示扩增的结果是否正常，完全不能避免样品采集，保存运输和核酸提取过程有误而导致的阴性结果的出现。

本实施例的甲型流感病毒上游引物的序列为CTCATGGAATGGCTAAAGACAAG，所述甲型流感病毒下游引物的序列为TCCTCGCTCACTGGGCA，所述甲型流感病毒探针的序列为CCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTT，所述乙型流感病毒上游引物的序列为CACCAGAAGAGGGAGACAATTAG，所述乙型流感病毒下游引物的序列为GTCAGCTATTATGGAGCTGTTAGC，所述乙型流感病毒探针的序列为GGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAA。

在同一反应体系中加入一条或多条不同荧光标记的探针和引物(针对甲型流感病毒的探针标记FAM，针对乙型流感病毒的探针标记VIC，针对内参基因的探针标记ROX)，可在同一反应体系中检测是否存在甲型流感病毒和乙型流感病毒。探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对甲型流感病毒和乙型流感病毒在核酸水平上的检测。

PCR反应过程中，若待检样本包含甲型流感病毒，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含乙型流感病毒，则标记VIC的探针产生荧光信号。另外，每个反应中含有内参基因，则标记的ROX的探针应产生荧光信号。

一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S100、预处理，分别取出核酸扩增反应液、酶混合液、甲/乙型流感病毒混合反应液、阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；

S200、配置反应液并放在PCR反应管中，每个PCR反应管中20μL；

S300、提取核酸；

S400、加样，在步骤S200配置的反应液中分别加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各5μL，盖紧管盖，瞬时离心；

S500、扩增检测，将步骤S400得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增检测；

S600、结合内参检测结果判断样本检测结果。

优选的，所述步骤S200中的配置反应液为核酸扩增反应液12μL/人份、酶混合液4μL/人份、甲/乙型流感病毒混合反应液4μL/人份。

优选的，所述步骤S500中的荧光定量PCR仪的扩增检测循环参数如下：

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以上所述实施例仅表达了本发明的某种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。