一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的制备及应用

技术领域

本发明属于农业微生物防治领域，具体涉及一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的制备及应用。

背景技术

烟草青枯病是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一，在中国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。近几年来，该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。该病造成的损失已居各类病害的第4位，必须重视该病的防治工作。

烟草青枯病典型症状是叶片枯萎。初发病时，病株多向一侧枯萎，拔出后可见发病的一侧支根变黑腐烂，末显症的一例根系大部分正常。有的先在叶片支脉间局部叶肉产生病变，茎上出现长形黑色条斑，有的条斑扩展到病株顶部或枯萎的叶柄上。发病中期全部叶片萎蔫，条斑表皮变黑腐烂，根部也变黑腐烂，横剖病茎用力挤压切口，从导管溢出黄白色菌脓，病株茎和叶脉导管变黑。后病菌侵入髓部，茎髓部呈蜂窝状或全部腐烂形成空腔，仅留木质部。其中由劳尔氏菌等菌引起的细菌性青枯病是烟草上最严重的土传病害，由于细菌性引起的烟草青枯病不能被传统化学农药等有效的抑制、防治，一定程度上长期使用农药不仅会使其对农药产生抗药性，严重着影响人身安全和引起病变。

基于此，本发明设计了一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的制备及应用，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的制备及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

所采用的有益微生物菌是解淀粉芽孢杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,分类命名：解淀粉芽孢杆菌；Bacillus；保藏号：CGMCC No.6462；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2012年8月21日。

一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的制备，包括以下步骤：

①菌株活化，在无菌环境下将低温保藏的解淀粉芽孢杆菌接种于平板培养基，在9℃下进行活化培养，培养12h后制得活化孢子液；

②扩增培养，将步骤①制得的孢子液进行接种于液体培养基中，进行扩增培养，在20℃下培养至对数成长期后制得活化孢子液菌落；

③发酵培养，将步骤②制得的活化孢子液菌落按照5％比例接种于发酵罐中，在恒温26℃，恒速200r/min，发酵培养24h，制得发酵液；

④超滤浓缩，首先将超滤膜进行酸洗和碱洗，再进行无菌化处理，当完成上述所有步骤后，将步骤③制得的发酵液，使用超滤膜进行过滤，多次过滤后得到超滤浓缩液和低浓度滤液，超滤浓缩液活孢子数≥1000亿/g，低浓度滤液可以通过二次发酵进行重复利用，提高菌种利用率；

⑤喷雾干燥，将步骤④过滤得到的超滤浓缩液加入到干燥罐中进行喷雾干燥处理，实时观测其水分含量，当水分含量低于设定值时，停止干燥，冷却得到解淀粉芽孢杆菌固体，将其粉碎至75目。

优选地，所述步骤①中所述的平板培养基的组成成分及其质量百分比：蛋白胨5.0％，酵母浸膏3.0％，氯化钠1.0％，琼脂粉2.0％，余量为水。

优选地，所述步骤②中所述的液体培养基的组成成分及其质量百分比：蛋白胨3.0％，氯化钠1.0％，磷酸二氢钾0.5％，余量为水。

优选地，所述步骤③中所述的发酵培养基的组成成分及其质量百分比：胰蛋白胨5.0％，酵母浸膏2.0％，葡萄糖1.0％，无水硫酸镁0.5％，醋酸钠1.0％，磷酸二氢钾0.3％，余量为水。

优选地，所述步骤④中采用盐酸浸泡酸洗调整超滤膜流速，氢氧化钠浸泡碱洗用于中和酸洗。

优选地，所述步骤⑤中喷雾干燥，所采用的喷雾干燥其温度在45℃恒定，喷雾速度为20L/h，设定的含水量为5wt％。

一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的应用，所述解淀粉芽孢杆菌主要用于防治烟草青枯病和防治烟草花叶病等。

优选地，使用方法为：将一种解淀粉芽孢杆菌菌粉，按照1：200比例与水充分混合后，结合灌根技术和喷淋等现代农业技术，对烟草进行培育。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明具有以下的有益效果：本发明通过超滤浓缩以及喷雾干燥新技术制备，可以使本发明极大的缩短发酵时间，并且能够在极短的时间内产出本产品，成为一种较之简便和主流的生产方式，本发明解淀粉芽孢杆菌菌剂能够有效的防治烟草青枯病，并且不会产生后继不良后果，本发明就是为了弥补上述阐述的烟草青枯病没有从微生物领域进行防治的缺失，本发明一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌通过恰当的使用方法，让解淀粉芽孢杆菌定值在植物根际、体表等，同病原菌竞争周围的养分、分泌出抗菌物质抑制病原菌的生长繁殖，同时能够强化植物自我调节系统去抵御病原菌的入侵，从而达到生防的目的，本发明一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌，是一种绿色高效的环保型生防菌剂，其能够做到无害化防治、无污染化防治、无毒化防治本发明是一种环境友好型、绿色的生防菌剂，不仅减少环境污染，而且还能避免青枯病对农药出现抗药性发生变异。

附图说明

图1为本发明制备的步骤流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所采用的有益微生物菌是解淀粉芽孢杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,

分类命名：解淀粉芽孢杆菌；Bacillus；

保藏号：CGMCC No.6462；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2012年8月21日。

一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的制备，其特征在于：包括以下步骤：

①菌株活化，在无菌环境下将低温保藏的解淀粉芽孢杆菌接种于平板培养基，平板培养基的组成成分及其质量百分比：蛋白胨5.0％，酵母浸膏3.0％，氯化钠1.0％，琼脂粉2.0％，余量为水，在9℃下进行活化培养，培养12h后制得活化孢子液；

②扩增培养，将步骤①制得的孢子液进行接种于液体培养基中，液体培养基的组成成分及其质量百分比：蛋白胨3.0％，氯化钠1.0％，磷酸二氢钾0.5％，余量为水，进行扩增培养，在20℃下培养至对数成长期后制得活化孢子液菌落；

③发酵培养，将步骤②制得的活化孢子液菌落按照5％比例接种于发酵罐中，在恒温26℃，恒速200r/min，发酵培养24h，制得发酵液，发酵培养基的组成成分及其质量百分比：胰蛋白胨5.0％，酵母浸膏2.0％，葡萄糖1.0％，无水硫酸镁0.5％，醋酸钠1.0％，磷酸二氢钾0.3％，余量为水；

④超滤浓缩，首先将超滤膜进行酸洗和碱洗，再进行无菌化处理，当完成上述所有步骤后，将步骤③制得的发酵液，使用超滤膜进行过滤，多次过滤后得到超滤浓缩液和低浓度滤液，超滤浓缩液活孢子数≥1000亿/g，低浓度滤液可以通过二次发酵进行重复利用，提高菌种利用率，采用盐酸浸泡酸洗调整超滤膜流速，氢氧化钠浸泡碱洗用于中和酸洗；

⑤喷雾干燥，将步骤④过滤得到的超滤浓缩液加入到干燥罐中进行喷雾干燥处理，实时观测其水分含量，当水分含量低于设定值时，停止干燥，冷却得到解淀粉芽孢杆菌固体，所采用的喷雾干燥其温度在45℃恒定，喷雾速度为20L/h，设定的含水量为5wt％，将其粉碎至75目。

一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的应用，解淀粉芽孢杆菌主要用于防治烟草青枯病和防治烟草花叶病等，使用方法为：将一种解淀粉芽孢杆菌菌粉，按照1：200比例与水充分混合后，结合灌根技术和喷淋等现代农业技术，对烟草进行培育。

实施例2

一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的应用

试验地点及名称：试验地点位于陕西省商洛市烟草试验地；一种解淀粉芽孢杆菌菌剂对烟草青枯病的防治；

试验材料：①本发明解淀粉芽孢杆菌的500倍稀释液；②枯草芽孢杆菌菌剂的500倍稀释液；③市售化学农药；④清水CK对照；

试验处理：选择在商洛市烟草试验地展开田间试验，是由于该地历年种植烟草，青枯病发病严重，土壤肥力中上等，有良好的种植基础等。试验品种为云烟，将上述各个试验材料，在移栽前对烟草茎基部喷淋，每株烟草使用100ml试剂，在移栽后，结合灌根和喷淋技术对烟草进行定期施用，每次施用量皆相同且与以前年度施用量相同，正常培育。每种试剂设置3个试验田，降低试验偶然性误差，每个试验田中烟草为100株，采集到的数据进行处理去平均值记录。

病情分级：以株为单位

0级：全株无病；

1级：茎部偶有褪绿斑，或病侧1/2以下叶片凋萎；

3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2，或病侧1/2～2/3叶片凋萎；

5级：茎部黑色条斑超过茎高1/2，但未达到茎顶部，或病侧2/3以上叶片凋萎；

7级：茎部黑色条斑达到茎顶部，或病株叶片全部凋萎；

9级：病株基本枯死。

将云烟移栽前进行茎基部喷淋，喷淋结束后移栽入相对应的试验田中，再结合灌根和喷淋技术对移栽云烟进行生长培育，在培育50d，80d，120d后进行病情调查及分析病情等级，并进行数据处理记录。具体试验结果如下表一所示：

表一 不同试剂对烟草青枯病的防治效果

通过表一数据可以发现，本发明一种解淀粉芽孢杆菌菌剂对烟草青枯病具有很好的防治效果，并且通过3次病情调查及分析，可以从上述表中看出，本发明能够持久性的对烟草青枯病进行防治，并且防治效果均在82％以上。

实施例3

一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的应用

试验地点及名称：试验地点位于陕西省商洛市烟草试验地；一种解淀粉芽孢杆菌菌剂对烟草花叶病毒的防治；

试验材料：①本发明解淀粉芽孢杆菌的500倍稀释液；②枯草芽孢杆菌菌剂的500倍稀释液；③市售化学农药；④清水CK对照；

试验处理：试验品种为云烟，将上述各个试验材料，在移栽前对烟草茎基部喷淋，每株烟草使用100ml试剂，在移栽后，结合灌根和喷淋技术对烟草进行定期施用，每次施用量皆相同且与以前年度施用量相同，正常培育。每种试剂设置3个试验田，降低试验偶然性误差，每个试验田中烟草为100株，采集到的数据进行处理去平均值记录。(可与实施例二同步进行，但观察间隔期不同，此实施例在移栽培育后的第10d、以及第20d进行调查分析并记录。)

具体对烟草的花叶病毒的防治效果如下如下表二所示：

通过表二的数据可以看出本发明一种能够防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌不仅能够防治烟草青枯病，也能够有效的防治烟草花叶病毒，且防效效率能够达到80.65％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。