一种发酵乳的杂菌检测方法

技术领域

本发明涉及乳制品领域，特别是涉及一种发酵乳的杂菌检测方法。

背景技术

发酵乳产品具有益生功能，越来越成为人们的新宠。但实际生产中常常发生杂菌污染，严重影响的产品质量与安全。发酵乳中杂菌难以被检测鉴定的原因是：发酵菌占绝大多数，而杂菌只占极少，生长条件未知，难以找到合适的培养基以及培养条件去分离培养；特别是杀菌产品。如何除去发酵菌的干扰，快速检测其中的杂菌是当前微生物检测的一大难题。基于16S rRNA基因的高通量测序技术被广泛应用于微生物的组成研究，但发酵乳样品所测的序列绝大部分为发酵菌。杂菌丰度极低，需要增加测序深度，增加检测费用；同时杂菌丰度和测序噪音值相近，难以判断分析。为了减少发酵菌的干扰，降低测序费用，提高检测的准确性与灵敏度，需要去除高丰度的发酵菌。CRISPR-Cas9技术作为近几年发展起来的突破性的技术，引起一场生物研究领域巨变，它作为一种精确且高效的基因编辑工具已经在各个领域得到广泛地应用，表现出了巨大的应用价值。根据干扰菌的16S rRNA基因序列，设计特异的sgRNA精确地切割干扰菌的基因组DNA，这样降低了干扰菌的丰度，富集和提高了杂菌的丰度。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种发酵乳的杂菌检测方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种发酵乳的杂菌检测方法，包括：

1)提供待测样品的菌体基因组DNA样品；

2)通过CRISPR-Cas9体系特异性地切割步骤1)所提供的菌体基因组DNA样品中的发酵菌基因组DNA，以提供经受切割后的基因组DNA样品；

3)通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的测序文库；

4)根据步骤3)所提供的测序文库，获取待测样品中所含的目标杂菌。

在本发明一些实施方式中，所述发酵菌选自嗜热链球菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或多种的组合，所述目标杂菌选自植物乳杆菌、醋酸杆菌、大肠杆菌、假单胞杆菌、氧化葡糖杆菌、短小芽孢杆菌、嗜糖假单胞菌、乳酸乳球菌、双歧杆菌中的一种或多种的组合。

在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，CRISPR-Cas9体系包括sgRNA和Cas9酶，所述sgRNA针对发酵菌基因组DNA上的16S rRNA序列，优选的，所述sgRNA包括第一sgRNA和第二sgRNA，所述第一sgRNA和第二sgRNA的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2。

在本发明一些实施方式中，述步骤3)中，所述测序文库为克隆测序文库；

和/或，目标杂菌的靶标序列是目标杂菌的16S rRNA序列；

和/或，通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的克隆测序文库的方法具体包括：以特异性针对目标杂菌的靶标序列的通用引物扩增步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，以提供目标杂菌的靶标序列的克隆测序文库。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，所述测序文库为高通量测序文库；

和/或，目标杂菌的靶标序列是目标杂菌的16S rRNA序列；

和/或，通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库的方法具体包括：以特异性针对目标杂菌的靶标序列的高通量测序引物扩增步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，以提供目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，所述测序文库为高通量测序文库；

和/或，目标杂菌的靶标序列是目标杂菌的16S rRNA序列；

和/或，通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库的方法具体包括：以特异性针对目标杂菌的靶标序列的通用引物扩增步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，将扩增产物添加接头和标签，以提供目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库的方法具体包括：以特异性针对目标杂菌的靶标序列的通用引物、和特异性针对目标杂菌的靶标序列的高通量测序引物先后扩增步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，以提供目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，所述特异性针对目标杂菌的靶标序列的高通量测序引物的多核苷酸序列包括测序接头和通用引物序列，还包括标签序列和/或探针序列。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，所述特异性针对目标杂菌的靶标序列的高通量测序引物的多核苷酸序列自5’端至3’端依次包括测序接头、标签序列和通用引物序列。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，所述特异性针对目标杂菌的靶标序列的高通量测序引物包括第一扩增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物和第二扩增引物的多核苷酸序列分别包括如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。

在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，所述特异性针对目标杂菌的靶标序列的通用引物包括第三扩增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物和第四扩增引物的多核苷酸序列分别包括如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。

附图说明

图1显示为本发明所提供的测序流程示意图。

图2显示为其他现有技术的测序流程示意图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

本发明发明人经过大量时间研究，提供了一种发酵乳的杂菌检测方法，所述杂菌检测方法可以有效降低待测样品中的发酵菌的丰度，并同时富集杂菌，从而可以有效提升针对发酵乳中杂菌的检测效率和检测灵敏度，在此基础上完成了本发明。

本发明提供一种发酵乳的杂菌检测方法，包括：

1)提供待测样品的菌体基因组DNA样品；

2)通过CRISPR-Cas9体系特异性地切割步骤1)所提供的菌体基因组DNA样品中的发酵菌基因组DNA，以提供经受切割后的基因组DNA样品；

3)通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的测序文库；

4)根据步骤3)所提供的测序文库，获取待测样品中所含的目标杂菌。所述杂菌检测方法中，对于抽提获得的待测样品的菌体基因组DNA，可以通过CRISPR-Cas9体系特异性地切割其中的发酵菌基因组DNA，从而可以降低发酵菌的丰度、并同时富集杂菌，随后可以进一步对样品进行扩增以构建目标杂菌的测序文库，并通过测序文库检测待测样品中所含的目标杂菌。

本发明所提供的杂菌检测方法中，可以包括：提供待测样品的菌体基因组DNA样品。合适的提供待测样品的菌体基因组DNA样品的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以使用各种市售的菌体基因组DNA提取试剂盒(例如，细菌基因组DNA抽提试剂盒、细菌基因组DNA小量纯化试剂盒等)。

上述检测方法中，待测样品通常可以包括发酵乳。发酵乳通常指以生乳或乳粉为原料，经过杀菌(例如，巴氏杀菌)、发酵后所获得的pH值降低的乳制品，发酵过程中可以添加有益菌(例如，发酵剂)。例如，待测样品可以是发酵乳、风味发酵、常温酸奶、冷藏酸奶等。再例如，待测样品可以是符合GB 19302-2010相关标准的各种发酵乳。

本发明所提供的杂菌检测方法中，还可以包括：通过CRISPR-Cas9体系特异性地切割步骤1)所提供的菌体基因组DNA样品中的发酵菌基因组DNA，以提供经受切割后的基因组DNA样品。通过CRISPR-Cas9体系特异性地切割菌体基因组DNA样品中的发酵菌基因组DNA，可以只切割发酵菌基因组DNA，而不切割其他细菌的基因组DNA，从而可以有效降低待测样品中的发酵菌的丰度。

上述检测方法中，发酵菌通常指在发酵乳发酵过程中接种以用于乳制品发酵的菌种，其在待测样品中数量上占比通常较高，甚至可以占到绝大多数。合适的可能存在于发酵乳中的发酵菌的种类对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，发酵菌可以选自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)(例如，德氏乳杆菌保加利亚亚种，Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)等中的一种或多种的组合。目标杂菌则通常指在发酵乳中除发酵菌以外所存在的其他菌种，相对于发酵菌来说，目标杂菌的数量通常较少、或较低，甚至于含量可以低到难以被一些现有的检测方法直接检测。目标杂菌可以是发酵乳中相对于发酵菌来说数量上相对较少的其他菌种，也可以是生产过程中可能引入的各种杂菌。例如，按分子比值计，目标杂菌的总量与发酵菌之间的含量比例可以为0.1～40％、0.1～0.2％、0.2～0.4％、0.4～0.6％、0.6～0.8％、0.8～1％、1～2％、2～4％、4～6％、6～8％、8～10％、10～15％、15～20％、20～25％、25～30％、30～35％、或35～40％。分子比值的计算方法可以具体如下：首先用细菌基因组的DNA总长度除以rRNA基因拷贝数得到各个细菌的rRNA基因所对应的长度，并计算出各个细菌的rRNA基因所对应的rRNA分子量，再用各个细菌的基因组DNA质量除以rRNA分子量来计算各个细菌的分子数，细菌分子数之间的比值即不同细菌的分子比值。再例如，目标杂菌的种类可以为1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、或更多的种类数量。可能存在于发酵乳中的目标杂菌的种类没有特别限制，但是目标杂菌与发酵菌通常是不同的菌种。例如，目标杂菌可以选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、醋酸杆菌(Acetobacterium Balch)、杂菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞杆菌(Pseudomonas sp)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜糖假单胞菌(Pelomonas sp)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、双歧杆菌(Bifidobacterium)等中的一种或多种的组合。

上述检测方法中，CRISPR-Cas9体系通常可以包括sgRNA和Cas9酶，sgRNA通常针对发酵菌基因组DNA上的靶标片段，例如，可以是16S rRNA序列。在本发明一具体实施例中，所述sgRNA包括第一sgRNA和第二sgRNA，所述第一sgRNA和第二sgRNA的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

本发明所提供的杂菌检测方法中，还可以包括：通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的测序文库。在通过CRISPR-Cas9体系特异性地切割步骤1)所提供的菌体基因组DNA样品中的发酵菌基因组DNA后，可以对目标杂菌的靶标序列进行扩增(例如，PCR扩增)，以构建目标杂菌的靶标序列的测序文库，以便于根据所构建的文库进行测序，以完成细菌组成的分析。

上述检测方法中，目标杂菌所对应的靶标序列通常可以是能够被用于区分细菌种类的rRNA序列。合适的目标杂菌所对应的靶标序列对于本领域技术人员来说是可以被合理选择的。例如，目标杂菌的靶标序列通常可以是目标杂菌的16S rRNA序列。

上述检测方法中，测序文库可以为高通量测序文库。在靶标序列确定以后，合适的构建目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库的方法具体包括：以特异性针对目标杂菌的靶标序列的高通量测序引物扩增步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，以提供目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库。再例如，通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库的方法具体包括：以特异性针对目标杂菌的靶标序列的通用引物扩增步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，将扩增产物添加接头和标签，以提供目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库。再例如，通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库的方法具体包括：以特异性针对目标杂菌的靶标序列的通用引物、和特异性针对目标杂菌的靶标序列的高通量测序引物先后扩增步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，以提供目标杂菌的靶标序列的高通量测序文库。通常来说，特异性针对目标杂菌的靶标序列的高通量测序引物的多核苷酸序列包括测序接头和通用引物序列，还包括标签序列和/或探针序列。

上述检测方法中，测序文库可以为克隆测序文库。在靶标序列确定以后，合适的构建目标杂菌的靶标序列的克隆测序文库的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，通过步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，构建目标杂菌的靶标序列的测序文库的方法具体包括：以特异性针对目标杂菌的靶标序列的通用引物扩增步骤2)所提供的经受切割后的基因组DNA样品，以提供目标杂菌的靶标序列的克隆测序文库。随后即可根据所提供的测序文库，获取待测样品中所含的目标杂菌，例如，可以将所得扩增产物连接至载体；转化、筛选，挑选菌落。

在本发明一具体实施例中，特异性针对目标杂菌的靶标序列的高通量测序引物包括第一扩增引物和第二扩增引物(例如，P5-16S-F和P7-16S-R)，第一扩增引物和第二扩增引物的多核苷酸序列分别包括如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。

在本发明另一具体实施例中，特异性针对目标杂菌的靶标序列的通用引物包括第三扩增引物和第四扩增引物(例如，16S-F和16S-R)，所述第三扩增引物和第四扩增引物的多核苷酸序列分别包括如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。

本发明所提供的杂菌检测方法中，还可以包括：根据步骤3)所提供的测序文库，获取待测样品中所含的目标杂菌。如上所述，对目标杂菌的靶标序列的测序文库进行测序以后，即可根据测序结果，获知待测样品中所含的目标杂菌。

本发明所提供的杂菌检测方法，相对于现有的测序流程(参见图2)，引入了切割样品基因组DNA的步骤(参见图1)，从而可以高效地排除发酵菌的干扰，快速、灵敏地分析发酵乳中的杂菌污染，具有操作简便、精准删除、灵敏度高、成本低等优点，甚至还可以直接应用第一代测序技术的克隆测序方法快速分析污染菌，及时解决生产问题，从而具有良好的产业化前景。

下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

实施例1

高通量删除测序方法条件优化(一次、二次PCR步骤对比实验：研究切割效率差异(1％))：

植物乳杆菌的基因长度为6.5Mbp，16S rRNA拷贝数为5(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum ST-III，complete sequence(NC_014554.1))，嗜热链球菌基因长度为3.1Mbp，16S rRNA拷贝数为6(Streptococcus thermophilus strain ST3，complete genome(CP017064.1))。校正菌株的基因长度和rRNA拷贝数后，制备植物乳杆菌与嗜热链球菌16S rRNA分子比值为1％的混合模拟样品50ng。根据嗜热链球菌16S rRNA基因序列设计的2段sgRNA序列(sg1：SEQ ID NO.1、sg2：SEQ ID NO.2)，只特异性切割嗜热链球菌，不切割其它细菌。用T7 RNA Polymerase(Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd)体外合成sgRNA，和Cas9(Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd)一起切割混合模拟样品基因组DNA，切割体系(20μL)：0.2g植物乳杆菌，50ng嗜热链球DNA，cas9酶0.5μg，37℃3h，95℃10min灭活。

sg1：GATCACTAATACGACTCACTATAGGCAATTGCTCCACTACAAGAGTTTTAGAGCTAGAAA(SEQID NO.1)

sg2：GATCACTAATACGACTCACTATAGACACATGTCATTTATTTGAAGTTTTAGAGCTAGAAA(SEQID NO.2)

分别用2种方案进行高通量测序，分别为一轮PCR法和二轮PCR法。

一轮PCR法：直接用16S rRNA的长引物P5-16S-F、P7-16S-R(测序接头+标签序列+16S RNA通用引物，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)进行一轮PCR扩增(预变性：95℃5min；30个循环：98℃10s、55℃10s、72℃30s；延伸：72℃5min)，再纯化上机测序。

二轮PCR法：先用16S RNA通用引物16S-F、16S-R(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)进行PCR扩增(30个循环：98℃10s、55℃10s、72℃30s；延伸：72℃5min)，再以第一轮PCR产物为模板，用长引物P5-16S-F、P7-16S-R(测序接头+标签序列+16S RNA通用引物)进行第二轮PCR扩增(15个循环：98℃10s、58℃10s、72℃30s；延伸：72℃5min)，再纯化上机测序。

测序统计结果显示一轮PCR法、二轮PCR法植物乳杆菌的序列丰度分别为10％、75％，所以一轮PCR法、二轮PCR法中植物乳杆菌含量由1％分别提高到10％、75％，对应的删除效率分别提高了10、75倍，二轮PCR法删除效率优于一轮PCR。

P5-16S-F：

TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCAGAGTTTGATCMTGGCTCAG(SEQ ID NO.3)

P7-16S-R：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGCCTCCCGTAGGAG(SEQ ID NO.4)

16S-F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG(SEQ ID NO.5)

16S-R：TGCTGCCTCCCGTAGGAG(SEQ ID NO.6)

实施例2

浓度梯度稀释模拟实验(0.1％、0.3％、1％)：

构建植物乳杆菌与嗜热链球菌的16S RNA分子比值(校正16S RNA拷贝数与全基因组碱基数后)为0.1％、0.3％、1％混合模拟梯度实验样品(混合模拟样品中的其他组分参照实施例1)。使用CRISPR-Cas9体系对嗜热链球菌16S rRNA进行特异性切割，切割方法参照实施例1。随后使用二轮PCR法(参照实施例1)，测序分析后，植物乳杆菌含量分别提高到25％、50％、75％，对应的删除效率提高了250、50、75倍。可以用来检测含量只有0.1％的杂菌，甚至可以直接克隆测序(挑取16个克隆测序)，快速鉴定杂菌。

此外，随着植物乳杆菌与嗜热链球菌比率进一步降低，测序噪音值相对升高。随着植物乳杆菌与嗜热链球菌比率进一步降低(小低于0.1％)，删除富集后测序，植物乳杆菌丰度接近测序噪音值(总噪音值约为5％)，难以被分辨检测。噪音值产生的主要原因可能是PCR过程容易受到环境中极微量细菌污染的干扰、taq酶扩增的保真性等问题。taq酶每次扩增的突变率为1×10

实施例3

多株细菌模拟混合删除实验：

根据菌株的基因长度、16S rRNA拷贝数，计算配制与嗜热链球菌比值(校正16SRNA拷贝数以及全基因组序列长度)为0.2％的10株混合模拟样品(Bacillus pumilusCMCC63202；Staphylococcus aureus ATCC25923；Escherichia coli DH5a；Enterococcusfaecalis ACCC10699；Pseudomonas fluorescens Migula AS1.823；Lactobacillusacidophilus NCFM；Listeria monocytogenes ATCC19115；Citrobacter freundii ATCC43864；Lactobacillus casei ZHANG；Lactobacillus rhamnosus GG，每个菌株与嗜热链球菌的比值都是0.2％)，(混合模拟样品中的其他组分参照实施例1)。使用crispr-Cas9体系对嗜热链球菌16S rRNA进行特异性切割，切割方法参照实施例1。随后使用二轮PCR法(参照实施例1)，测序分析。切割前后细菌含量对比详见表1，10株细菌平均含量提高到7.5％，证明切割是特异、准确的，不发生脱靶现象。

表1混合菌株删除测序结果

实施例4

酸奶缩包原因分析：

草莓大果粒酸奶(蒙牛乳业股份有限公司)冷藏过程中部分样品(约0.1％)发生缩包现象，首先排除罐装、温度等变化引起包装中的空气体积变化而产生缩包的原因。草莓酸奶由白砂糖、牛奶、稳定剂等添加嗜热链球菌发酵至凝乳，再添加草莓果酱、香精制作而成。对生产中用到的所有原料做了各种常规微生物检测(包括霉菌、酵母、好氧性细菌等)，均未发现异常微生物存在。抽提3个缩包酸奶样品的基因组DNA(细菌基因组DNA抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司))，用Cas9-sRNA特异性切割嗜热链球菌、且不切割其它细菌(具体方法参照实施例1)。使用实施例1中的二轮PCR法进行扩增、测序，分析结果详见表2：

表2缩包酸奶删除后测序结果

所测的3个缩包酸奶样品中嗜热链球菌序列丰度降低到46％，杂菌含量提高到33％。这证明设计的删除方法特异性强，只特异地切割发酵菌，但不切割其它细菌(如大肠杆菌、氧化葡糖杆菌等)。从实验结果看，3个样品都有氧化葡糖杆菌(丰度为12％)，为耐酸专性好氧菌，在生长中会消耗密封包装中空气中的氧气，引起缩包。

氧化葡糖杆菌在常规培养检测中难以被检测的原因是：氧化葡糖杆菌含量少，生长缓慢；而酸奶中的发酵菌含量高，生长快，严重干扰了氧化葡糖杆菌的分离鉴定。

氧化葡糖杆菌主要分布在水果以及果园的土壤中，其可能来源是生产过程中所使用的草莓果酱。但在对草莓果酱的相关微生物检测未发现异常微生物，其原因是氧化葡糖杆菌生长缓慢，同时果酱已灭菌，活菌含量极低，难以被检测鉴定。微生物检测方法具体如下：霉菌和酵母检测用PDA培养基，25～28℃培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果；好氧菌落总数检测用LB平板37培养2天，观察菌落生长情况；厌氧乳酸菌检测用MRS培养基，37厌氧培养3天，观察菌落生长情况。

将上述草莓果酱接种到空白酸奶中(20杯，3次)，空白酸奶的制备方法具体为：新鲜的纯牛奶(光明乳业股份有限公司)，加入7％的白砂糖，65℃15MPa均质后，90℃条件下灭菌10min。冷却至40～45℃，接入0.02％的酸奶发酵菌粉(美国杜邦公司)，42℃发酵4～6h至凝乳，4℃下冷藏即可。密封，25℃放置2周，未出现缩包。这可能是因为缩包酸奶只占极少数(约为0.1％)，理论上必须做上千次实验，才能出现氧化葡糖杆菌污染引起缩包模拟样品，直接溯源困难。但是在后续生产过程中，在加强了果酱的灭菌之后，产品未进一步出现缩包问题，间接证明氧化葡糖杆菌来源于草莓果酱。

实施例5

酸奶缩包克隆测序分析：

将实施例4中缩包酸奶抽提的基因组DNA，用Cas9-sRNA特异性切割嗜热链球菌、且不切割其它细菌后，再用16S RNA通用引物16S-F、16S-R进行PCR扩增。PCR扩增条件为：30个循环：98℃10s、55℃10s、72℃30s；延伸：72℃5min。用PCR纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)纯化后，连接T载体(Takara Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd)，转化，蓝白斑筛选后，挑选20个菌落克隆测序，结果详见表3：

表3缩包酸奶克隆测序结果

3个样品都有氧化葡糖杆菌，含量异常(丰度为10％以上)，可以直接克隆检测。高通量测序往往需要2周以上时间才能获得结果，且需要专门的软件分析，时间长，费用高；而克隆检测只需要3-4天即可获得结果，不需要专门软件分析，时间短，费用低。因此删除后富集杂菌后在克隆测序，可以快速简便获得检测结果，解决产品质量突发事件。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 光明乳业股份有限公司

<120> 一种发酵乳的杂菌检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatcactaat acgactcact ataggcaatt gctccactac aagagtttta gagctagaaa 60

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatcactaat acgactcact atagacacat gtcatttatt tgaagtttta gagctagaaa 60

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacactcttt ccctacacga cgctcttccg atcagagttt gatcmtggct cag 53

<210> 4

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atctgctgcc tcccgtagga g 81

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgctgcctcc cgtaggag 18