特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式PCR引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种用于特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式PCR引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

剑麻(Agave sisalana Perr.ex Engelm)，又称龙舌兰麻，是龙舌兰科龙舌兰属一种多年生草本单子叶旱生植物，其原产墨西哥，现主要在非洲、拉丁美洲、亚洲等地种植。剑麻纤维质地坚韧、耐磨，广泛应用于渔业、运输、冶金等行业，是目前世界上用量最大、范围最广的一种硬质纤维。在我国，剑麻产地主要分布在广东、广西、海南等热带和亚热带地区。我国剑麻总面积约3万hm

紫色卷叶病是剑麻生产的一种毁灭性的病害，该病害给剑麻产业造成巨大的损失。该病于2001年11月份在海南昌江青坎农场(私营企业)麻区零星发生，2002年4月该病便迅速蔓延全场及周边农村麻园，严重田块发病率达80％，造成严重失收；2006年该病又蔓延至广东雷州北和镇个体麻区，2007年便蔓延至广东湛江农垦徐闻、雷州麻区及其周边农村麻园，接着又迅速蔓延至广东廉江及揭阳农垦麻区，2007年10月以后该病大爆发，导致湛江麻区累计淘汰麻田4000hm

植原体为难培养植物病原物，属于细菌界(Bacteria)硬壁菌门(Firmicutes)柔膜菌纲(Mollicutes)非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)植原体暂定属(Candidatus Phytoplasma)。植原体无细胞壁，形态多样，大小为80～800μm[Doi M,(1967).Mycoplasma or PLT group like organism foundin the phloem elements of plants infected with mulberry dwar f,potatowitches’broom,aster yellow,or paulownias witches’broom.Ann Phytopat hol SocJpn,33:259–266]。定殖于植物韧皮部筛管以及刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴、唾腺等组织内，植原体通常在植物体中含量较低，难以人工培养，且分布不均匀。

植原体与世界上的许多植物病害有关，引起多种重要作物的病害。如我国发生的枣疯病、小麦蓝矮病、槟榔黄化病以及国外发生的葡萄黄化病、椰子致死黄化病等[徐启聪(2009)中国各地不同枣树品种上枣疯病植原体的PCR检测及分子变异分析.微生物学报,49(11):1510-1519；Laimer M(2009)Resistance to viruses,phytoplasmas and theirvectors in the grapevine in Europe.a review.J.Plant Pathol.,91(1):7-23；Wu YF(2010)Identification of the phytoplasma associated with wheat blue dwarfdisease in China.Plant Dis.,94(8):977-985；Yang Y(2016)Molecularidentification of a 16SrII-A group-related phytoplasma associated withcinnamon yellow leaf disease in China.J.Phytopathol.,164(1):52-55；Gurr GM(2016)Coconut lethal yellowing diseases：a phytoplasma threat to palms ofglobal economic and social significance.Front.Plant Sci.,7:21.]。虽然，近年的研究表明可对植原体进行体外培养，但其培养条件极其苛刻[Contaldo N(2012)Axenicculture of plant pathogenic phytoplasmas.Phytopathol.Mediterr.,51(3)：607–617；Contaldo N(2016)Development and evaluation of different complex media forphytoplasma isolation and growth.J.Microbiol.Meth.,127:105–110.]，多数实验室很难获得植原体的纯培养。因此，不能像其他的原核或真核生物一样采用传统的分离培养法获得纯培养后，对植原体进行系统的鉴定和分类等研究。因此，建立一种行之有效的检测方法，对寄主植物/昆虫媒介中植原体进行鉴定与监测，这是开展植原体病害病理学、流行学及防治等研究工作必不可少的第一步[范国权(2015)植原体病害研究进展.黑龙江农业科学,(11):148-153；王洁(2017)柿树带化病相关植原体的形态及分子鉴定.植物生理学报,53(2)：219–226；Li S(2015)Occurrence and identification of a new vector of riceorange leaf phytoplasma in South China.Plant Dis.99:1483-1487；López-Romero JC(2018)Biological activities of Agave by-products and their possibleapplications in food and pharmaceuticals.J.Sci.Food Agric.,2018,98:2461–2474.]。然而，在利用植原体通用引物对剑麻紫色卷叶病植株进行巢式PCR检测时，存在通用引物对极其不特异，以及即使大小与预期一致，经测序证实为非植原体的假阳性序列。总之，目前急需一种针对剑麻紫色卷叶病植原体的特异性检测技术。

发明内容

本发明的目的在于克服现有植原体通用引物在检测剑麻紫色卷叶病植原体时存在大量非特异性条带，以及大量假阳性序列的技术缺陷问题，为了快速、准确地检测与鉴定剑麻紫色卷叶病，本发明提供一组剑麻紫色卷叶病植原体高效分子检测引物以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的剑麻紫色卷叶病的巢式分子检测方法。

本发明的第一个方面是通过对剑麻紫色卷叶病植原体16S rDNA与非特异性以及假阳性序列比对后而设计的用于特异性检测剑麻紫色卷叶病植原的巢式PCR引物组，该巢式引物组由第一轮扩增的上游引物(序列如SEQIDNO：1所示)，第一轮扩增的下游引物的序列如SEQIDNO：2所示,巢式扩增上游引物(SEQIDNO：3)，以及巢式扩增下游引物(SEQIDNO：4)组成。

具体地，所述引物对的序列如下所示：

第一轮扩增上游引物：CTGGATAGGAGACAAGAAGGCAT(SEQIDNO：1)；

第一轮扩增下游引物：GCAACTGATAACCTCCACTGTGT(SEQIDNO：2)。

巢式扩增上游引物：CAATAGGTATGCTTAGGGAGGAG(SEQIDNO：3)；

巢式扩增下游引物：CACTGGTTTTACCCAACGTTTA(SEQIDNO：4)。

本发明的第二个方面是提供一种用于快速、高效检测剑麻紫色卷叶病植原体的试剂盒，其包含本发明的第一个方面所述的巢式PCR引物组。即本发明的第二个方面的试剂盒中包含具有SEQIDNO：1和SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的核苷酸的巢式PCR引物组。所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。

本发明的第三个方面是提供如第一个方面所述的引物对或本发明第二个方面所述的试剂盒在高效检测剑麻紫色卷叶病植原体中的应用。

本发明的第四个方面是提供一种用于高效检测剑麻紫色卷叶病植原体的方法，该方法包括使用本发明第一个方面所述的巢式PCR引物组或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物对进行巢氏PCR扩增的步骤。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

步骤1，从样品中提取DNA；

步骤2，用第一个方面所述的巢式PCR引物组或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物对进行巢氏PCR扩增，得到扩增产物；

步骤3，检测扩增产物，并作出判断。

本发明中，提取待测样品的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。

本发明中，将所述待测样品的基因组DNA进行巢式PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述的巢式PCR扩增的反应体系为：ddH

由此，能够快速、高效、准确地扩增，便于后续步骤的进行。

本发明中，对所述巢式PCR扩增产物进行检测的方法不受特别限制，只要能够有效获得PCR扩增产物的大致的碱基对数目即可。根据本发明的一些具体示例，通过凝胶电泳获得大致的碱基对数目。由此，能够高通量、高效、准确地获得检测结果。

本发明中，步骤3中若检测出现632bp左右的特异性条带则判断为检出紫色卷叶病植原体。

本发明的引物组是利用植原体通用引物R16mF2/R16mR1(R16mF2：CATGCAAGTCGAACGGA/R16mR1：CTTAACCCCAATCATCGAC)和R16F2n/R16R2引物(R16F2n：GAAACGACTGCTAAGACTGG/R16R2：TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG)通过巢式扩增剑麻紫色卷叶病病株，将获得的条带进行克隆测序，获得的植原体序列以及剑麻植株中非植原体的同源性序列，进而将获得的两类序列进行序列比对分析，从而获得紫色卷叶病植原体序列相较于剑麻植株非植原体的4个差异位点区域，最终于差异位点区域设计得到的。

使用本发明的引物对可以在待测样品浓度达10fg/μL时准确地检测出紫色卷叶病植原体，具有较高的灵敏性与特异性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物可以大大缩短对剑麻紫色卷叶病植原体进行鉴定的时间，较快地鉴定出植原体，从而克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。使用本发明的引物对进行检测，具有灵敏度高、特异性强的特点，且本发明的检测方法具有高效、快速和敏感度高的优点。

附图说明

图1为本发明提供的紫色卷叶病植原体特异性引物组的特异性验证

泳道1:DL2000标准分子量；泳道2:ddH

图2为本发明提供的引物对检测剑麻紫色卷叶病植原体的灵敏性

泳道1:DL2000标准分子量；泳道2:ddH

图3本发明检测剑麻紫色卷叶病植原体特异引物与通用巢式PCR引物效果比较

图3A,剑麻紫色卷叶病植原体特异引物对大田典型病株DNA巢式检测；

泳道1:DL2000标准分子量；泳道2:ddH

图3B,植原体通用引物(R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2)对大田典型病株DNA巢式检测；

泳道1:DL2000标准分子量；泳道2:ddH

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进步一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1、检测剑麻紫色卷叶病植原体巢式PCR引物组的获得

1、通用引物巢式PCR扩增与产物克隆

利用植原体通用引物R16mF2/R16mR1(R16mF2：CATGCAAGTCGAACGGA/R16mR1：CTTAACCCCAATCATCGAC)对剑麻紫色卷叶病病样植株DNA进行PCR扩增。

其中，第一轮PCR扩增的反应体系如下：

第一轮PCR扩增的反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟；4℃保存。

第一轮扩增完成后，将产物稀释10倍，并利用R16F2n/R16R2引物(R16F2n：GAAACGACTGCTAAGACTGG/R16R2：TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG)开展巢式扩增；

其中，巢式扩增的反应体系如下：

将扩增所获得的与预期大小一致以及相差不大的所有条带进行切胶回收。回收产物连接pMD18T载体，并于大肠杆菌克隆。挑取单菌落进行分子鉴定，选取3个阳性克隆子于英潍捷基(广州)贸易有限公司测序。

2、特异性位点的获得

将通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2巢式扩增产物克隆后获得的各种序列进行比对分析。所获得的序列大体可分为两大类型，一类为植原体，其核苷酸长度为1246bp(序列表中序列5),彼此之间的序列一致性为100％(表1)，经序列鉴定所获得的植原体均为16SrI-B。另一类为非植原体，在核苷酸长度上比较接近1246bp，介于1228bp～1362bp之间。与植原体序列比较，其序列同源性仅为77.94％～81.66％(表1)。

表1，通用引物(R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2)扩增剑麻紫色卷叶病病株DNA所获植原体与非植原体序列类型

3.引物设计与合成

通过将上述两类序列进行比对分析，17条剑麻紫色卷叶病植原体序列与来自剑麻植株的14种类型的非植原体序列之间，存在4个差异区域。根据分析的结果，于上述区域设计引物。通过多组引物的筛选，最终确定引物组如下：

第一轮扩增正向引物AGF：CTGGATAGGAGACAAGAAGGCAT；(序列表中序列1)

第一轮扩增对反向引物ASR2：GCAACTGATAACCTCCACTGTGT；(序列表中序列2)

巢式正向引物ASF1：CAATAGGTATGCTTAGGGAGGAG；(序列表中序列3)

巢式反向引物ASR1:CACTGGTTTTACCCAACGTTTA(序列表中序列4)。

上述引物委托上海立菲生物技术有限公司(广州)合成。

实施例2、检测剑麻紫色卷叶病植原体引物的特异性

选取剑麻紫色卷叶病的发病植株DNA、以及同寄主病原菌剑麻斑马纹病菌(Phytophthora nicotianae)、剑麻茎腐病菌(Aspergilus niger)、非寄主病原菌咖啡露湿拟漆斑菌(Paramyrothecium roridum)、咖啡棕榈拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)、咖啡腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、咖啡炭疽病菌(Coletotrichumgloeosporioides)、甘蔗赤腐病菌(Coletotrichum falcatum)、甘蔗黑穗病菌(Ustilagoscitaminea)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzae pv.Oryzicola)、枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)等基因组DNA为模板。

剑麻紫色卷叶病发病植株DNA提取采用德国QIAGEN公司的植物DNA提取试剂盒提取；采用真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A Fungal DNA kit,Omega bio-tek)提取剑麻斑马纹病菌(Phytophthora nicotianae)、剑麻茎腐病菌(Aspergilus niger)、咖啡露湿拟漆斑菌(Paramyrothecium roridum)、咖啡棕榈拟盘多毛孢(Pestalotiopsis trachicarpicola)、咖啡腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、咖啡炭疽病菌(Coletotrichum gloeosporioides)、甘蔗赤腐病菌(Coletotrichum falcatum)、甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)菌株菌丝体的DNA。而采用细菌DNA提取试剂盒(BacterialDNA kit,Omega bio-tek)提取试剂盒提取水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.Oryzicola)、枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)基因组DNA。

采用引物对AGF/ASR2进行第一轮PCR扩增实验，以ddH

其中，PCR扩增的反应体系如下：

PCR扩增的反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟；4℃保存。

第一轮扩增完成后，将产物稀释10倍，作为ASF1/ASR1引物巢式PCR扩增的模板进行扩增；

其中，巢式PCR扩增的反应体系如下：

巢式扩增的反应程序为94℃3分钟；94℃30秒，63℃30秒，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟。

PCR扩增产物用质量百分比浓度为1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳条件为120V，40min。具体结果如图1。如图1所示，试验结果与设计分析的相吻合，引物对(第一轮PCR扩增引物AGF/ASR2；巢式扩增引物ASF1/ASR1)仅能从剑麻紫色卷叶病植株DNA中扩增出一条632bp特异性条带，而来自ddH

实施例3：检测剑麻紫色卷叶病相原体引物的灵敏性

剑麻紫色卷叶病植原体16S rDNA重组质粒的构建及提取的方法如下：

用pEASY-T1 Cloning Kit对通用引物(R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2)的PCR产物(序列表中序列5所示的核苷酸)进行克隆，具体操作如下：

(1)加入4μL PCR产物与1μL T1载体混合，轻弹混匀，瞬时离心后，25℃连接15min，结束后将其在冰上。

(2)待Trans-T1感受态细胞似化非化时，取50μL感受态细胞与连接产物轻轻混合，冰浴30min。

(3)从冰上取下离心管，42℃水浴锅中热激60s，再迅速插在冰上2min，于无菌条件下加入250μL的LB液体培养基(不加抗生素)，200rpm、37℃培养1h。

(4)取8μL 500mmol/L的IPTG以及40μL 20mg/mL的X-gal均匀混合后涂抹在新鲜的LB平板中，培养箱中37℃倒置30min。

(5)将培养好的菌液在无菌操作条件下取150μL均匀涂抹在LB平板上，37℃倒置培养过夜。

(6)挑取白色菌落至5μL无菌水中作为模板DNA，进行阳性克隆鉴定。然后在无菌超净工作台上，挑单菌落于已添加AMP的LB液体培养基中，37℃、180rpm的摇床培养12-16h。

(7)将菌液加入2ml离心管中，在室温下10000rpm离心1min，弃上清，保留下部沉淀。直至将菌液离心完。

(8)加入250μL SolutionⅠ(已经提前加入R Nase)，涡旋混匀。然后加入250μLSolutionⅡ，上下轻轻颠倒混匀数次。

(9)加入350μL的SolutionⅢ，上下颠倒混匀直至形成白色絮状沉淀。室温下13000rpm离心10min。

(10)转移上清液至装有2mL收集管的Hi Bind DNA柱子中。室温下10000rpm离心1min，弃去滤液。加入500μL HBC Buffer，室温下10000rpm离心1min，丢掉滤液。

(11)加入700μL的DNA Wash Buffer，室温下10000rpm离心1mim。重复此步骤1次。

(12)弃滤液，15000rpm下空管离心2min。将柱子转移到1.5mL离心管，加入60μL已经提前预热至65℃的Elution Buffer或dd H20，静至2min，13000rpm离心1min，洗脱质粒DNA，对获得的质粒DNA进行测序验证，鉴定结果含有序列5所示的核苷酸的重组质粒，即为紫色卷叶病菌植原体16S rDNA质粒DNA。

为了进一步验证检测剑麻紫色卷叶病植原体引物的灵敏性。将紫色卷叶病菌植原体16S rDNA质粒DNA起始浓度调整为1ng/μL，按10的数量级逐步向下稀释至10

实施例4：本发明检测剑麻紫色卷叶病植原体特异引物与通用巢式PCR引物效果比较

利用本发明所设计的剑麻紫色卷叶病植原体特异性引物，用实施例2的方法，对从大田采集的46份剑麻紫色卷叶病病株总DNA，进行巢式PCR分子检测。结果本发明的特异性引物组从每份DNA中均检测出唯一预期大小的清晰条带(图3A)，特异性条带检出率为100％(表2)。比较而言，利用通用引物(R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2)对上述46份剑麻紫色卷叶病病株DNA进行巢式PCR分子检测，在供试的46份DNA中，检测出条带为1～8条；只有3个样品检测出特异性条带(图3B)，其特异性条带检出率仅为2.22％(表2)。由此表明，本发明引物对可以应用到剑麻紫色卷叶病病原检测中。

表2，本发明所开发的紫色卷叶病植原体特异性引物与通用引物巢式扩增效果比较

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120>特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式PCR引物组、试剂盒及检测方法

<130>WHOI201068

<160> 5

<170>Patent-In 3.5

<210> 1

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ctggatagga gacaagaagg cat 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gcaactgata acctccactg tgt 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

caataggtat gcttagggag gag 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

cactggtttt acccaacgtt ta 22

<210> 5

<211> 1246

<212> DNA

<213>剑麻紫色卷叶病（Phytoplasma）

<400> 5

gaaacgactg ctaagactgg ataggagaca agaaggcatc ttcttgtttt taaaagacct 60

agcaataggt atgcttaggg aggagcttgc gtcacattag ttagttggtg gggtaaaggc 120

ctaccaagac tatgatgtgt agccgggctg agaggttgaa cggccacatt gggactgaga 180

cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaattt tcggcaatgg aggaaactct 240

gaccgagcaa cgccgcgtga acgatgaagt atttcggtac gtaaagttct tttattaggg 300

aagaataaat gatggaaaaa tcattctgac ggtacctaat gaataagccc cggctaacta 360

tgtgccagca gccgcggtaa tacatagggg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa 420

agggtgcgta ggcggttaaa taagtttatg gtctaagtgc aatgctcaac attgtgatgc 480

tataaaaact gtttagctag agtaagatag aggcaagtgg aattccatgt gtagtggtaa 540

aatgcgtaaa tatatggagg aacaccagta gcgaaggcgg cttgctgggt ctttactgac 600

gctgaggcac gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 660

aacgatgagt actaaacgtt gggtaaaacc agtgttgaag ttaacacatt aagtactccg 720

cctgagtagt acgtacgcaa gtatgaaact taaaggaatt gacgggactc cgcacaagcg 780

gtggatcatg ttgtttaatt cgaaggtacc cgaaaaacct caccaggtct tgacatgctt 840

ctgcaaagct gtagaaacac agtggaggtt atcagttgca caggtggtgc atggttgtcg 900

tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattgttag 960

ttaccagcac gtaatggtgg ggactttagc aagactgcca gtgataaatt ggaggaaggt 1020

ggggacgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacaaacgtg atacaatggc 1080

tgttgcaaag ggtagctgaa gcgcaagttt ttggcgaatc tcaaaaaaac agtctcagtt 1140

cggattgaag tctgcaactc gacttcatga agttggaatc gctagtaatc gcgaatcagc 1200

atgtcgcggt gaatacgttc tcggggtttg tacacaccgc ccgtca 1246