用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物。

背景技术

水稻黑条矮缩病是以灰飞虱为主要传播媒介的病毒病，具有暴发性、间歇性、迁移性等特点，水稻一旦感染很难有效控制，被称为水稻的“癌症”。近年来，水稻黑条矮缩病在我国东部江浙地区和亚洲东部国家发生，导致严重减产。选育水稻抗黑条矮缩病品种是防治水稻黑条矮缩病的最为有效、环保的方法之一。在传统抗黑条矮缩病品种选育过程中，每代都需要采用田间接种病菌的方法鉴定中间材料的基因型，而且环境条件会影响到正确中间材料的选择，这样势必影响选育进程；同时如果接种过程操作不当还会造成病原扩散，不利于黑条矮缩病的综合防治，因此抗病品种选育难的问题一直没有彻底解决。

分子标记辅助选择技术(Marker-assisted Selection，MAS)是现代分子生物学和传统遗传育种相结合的新型育种模式，可以利用分子标记在植物发育的任何时期从DNA水平对目标植株进行选择(Tanksley等，RFLP mapping in plant breeding:New tools foran old science.1989,Biotechnology,7:257-263)，从而弥补传统育种中出现的诸多弊端，因此成为解决抗病品种选育难这一问题的有效途径。其中，利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是增加抗病育种准确度与提高育种效率的有效手段。

单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组核苷酸序列中由单个核苷酸水平上的变异而引起的基因组水平上的DNA序列多态性，主要包括单个碱基的缺失、插入、转换及颠换等(唐立群等，SNP分子标记的研究及其应用进展.2012,中国农学通报,28(12):154-158.)。基于SNP位点设计的标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第二代分子标记相比，KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法。因此，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。

水稻黑条矮缩病抗性是由多基因控制的数量性状，其抗性基因多分布于3、6、7、9号染色体上。其中3号染色体QTL位于分子标记RM7和RM5748之间(Wang B X,Jiang L,ChenL M,et al.Screening of Rice Resources against Rice Black-Streaked Dwarf Virusand Mapping of Resistant QTL[J].ActaAgronomicaSinica,2010,36(8):1258-1264)；6号染色体有两个QTLs，qRBSDV6.3位于20Mb处的分子标记Y19.3和Y6之间(Feng Z,Kang H,Li M,et al.Identification of new rice cultivars and resistance loci againstrice black-streaked dwarf virus disease through genome-wide association study[J].Rice,2019,12(1))，qRBSDV6位于0.1Mb处的LOC_Os06g03120基因处(Xiao S,Wang B,Liu Y,et al.Genome-wide association study and linkage analysis on resistanceto rice black-streaked dwarf virus disease[J].Molecular Breeding,2019,39(5))；7号和9号染色体的QTLs分别位于分子标记RG128与R1440之间、RG570与RM215之间(Li A,Pan C,Wu L,et al.Identification and fine mapping of qRBSDV-6,a major QTL forresistance to rice black-streaked dwarf virus disease[J].Molecular Breeding,2013,32(1):1-13)。上述水稻黑条矮缩病抗性QTLs连锁标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但均为SSR标记或InDel标记，检测效率相对较低，并不适用于高通量的分子检测平台。因此，开发适合于高通量分子检测平台的水稻抗黑条矮缩病KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国的育种效率和育种水平具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物。

第一方面，本发明要求保护用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物。

本发明所要求保护的用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为标签序列A和SEQ ID No.1的第22-37位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为标签序列B和SEQ ID No.2的第22-36位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。

所述KASP引物具体用于检测水稻第6号染色体的第1,153,858位点处核苷酸多态性(A或者C)。

进一步地，所述标签序列A的核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第1-21位；所述标签序列B的核苷酸序列可为SEQ ID No.2的第1-21位。

更进一步地，所述引物1具体可为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2具体可为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。

第二方面，本发明要求保护用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的试剂或试剂盒。

本发明所要求保护的用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的试剂或试剂盒中含有第一方面中所述的KASP引物。

进一步地，所述试剂或试剂盒中还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。

所述荧光探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。

所述荧光探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。

在本发明的具体实施方式中，所述荧光基团A为VIC；所述荧光基团B为FAM；所述淬灭基团为Dabcy1。

在本发明中，所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B是存在于2×KASP Mix中的，其中所述2×KASP Mix为英国LGC公司产品。

第三方面，本发明要求保护前文所述的KASP引物或前文所述的试剂或试剂盒在如下任一中的应用：

(A)鉴定或辅助鉴定水稻对黑条矮缩病抗性；

(B)检测或辅助检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型；

(C)比较待测水稻对黑条矮缩病抗性强弱；

(D)选育对黑条矮缩病抗性相对较强的水稻单株或株系或品系或品种；

(E)选育对黑条矮缩病抗性相对较弱的水稻单株或株系或品系或品种。

第四方面，本发明要求保护一种检测或辅助检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型的方法。

本发明所要求保护的检测或辅助检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型的方法，可包括如下步骤：用前文所述的试剂或试剂盒对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描(采用基因分型软件KlusterCaller对扫描数据进行分析)，然后按照如下确定所述待测水稻基因组中水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型：

若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号为所述荧光基团A的信号，则所述待测水稻的黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型记为A:A纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:A纯合型)；

若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号为所述荧光基团B的信号，则所述待测水稻的黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型记为C:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为C:C纯合型)；

若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号为所述荧光基团A和所述荧光基团B的信号，则所述待测水稻的黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型记为A:C杂合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:C纯合型)。

进一步地，进行所述PCR扩增时采用的程序可为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置32-40个循环(优选40个循环)。

第五方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法I：一种比较待测水稻对黑条矮缩病抗性强弱的方法，包括如下步骤：采用第四方面所述方法检测待测水稻基因组中水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型，然后按照如下确定所述待测水稻对黑条矮缩病抗性强弱：基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:A纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:A纯合型)的所述待测水稻对黑条矮缩病抗性强于基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:C杂合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:C纯合型)的所述待测水稻对黑条矮缩病抗性强于基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为C:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为C:C纯合型)的所述待测水稻对黑条矮缩病抗性。

方法II：一种选育对黑条矮缩病抗性相对较强的水稻单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：采用第四方面所述方法检测待测水稻基因组中水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型，选择基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:A纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:A纯合型)的所述待测水稻作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:A纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:A纯合型)的水稻，最终获得对黑条矮缩病抗性相对较强的水稻单株或株系或品系或品种。

方法III：一种选育对黑条矮缩病抗性相对较弱的水稻单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：采用权利要求8所述方法检测待测水稻基因组中水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型，选择基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为C:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为C:C纯合型)的所述待测水稻作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为C:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为C:C纯合型)的水稻，最终获得对黑条矮缩病抗性相对较弱的水稻单株或株系或品系或品种。

第六方面，本发明要求保护前文所述的KASP引物或前文所述的试剂或试剂盒或前文所述方法在水稻育种中应用。

在本发明中，所述对黑条矮缩病抗性相对较强是指当所比较的水稻中基因组上其他影响对黑条矮缩病抗性的位点的效应相等时，基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:A纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:A纯合型)的水稻对黑条矮缩病抗性相对于基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:C杂合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:C纯合型)和/或C:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为C:C纯合型)的水稻更强，基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:C杂合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:C纯合型)的水稻对黑条矮缩病抗性相对于基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为C:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为C:C纯合型)的水稻更强。

在本发明中，所述对黑条矮缩病抗性相对较弱是指当所比较的水稻中基因组上其他影响对黑条矮缩病抗性的位点的效应相等时，基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为C:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为C:C纯合型)的水稻对黑条矮缩病抗性相对于基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:C杂合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:C纯合型)和/或A:A纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:A纯合型)的水稻更弱，基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:C杂合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:C纯合型)的水稻对黑条矮缩病抗性相对于基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:A纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:A纯合型)的水稻更弱。

在前文各方面中，所述水稻可为但不限于实施例部分所示材料中的任一种或任几种。

本发明基于与水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6紧密连锁的SNP位点[A/C](水稻参考基因组物理位置为第6条染色体1,153,858bp，参考基因组为Oryza sativaJaponicacultivar:Nipponbare，GenBank:AP014962.1)开发了KASP引物组合KASP_V6：Primer X、Primer Y和Primer R。

本发明的有益效果：

(1)本发明开发的KASP标记与qRBSDV6基因紧密连锁，经过多材料验证，开发的KASP标记表型选择效率与田间鉴定基本一致，可用于水稻不同种质资源中快速、精准的检测抗黑条矮缩病基因qRBSDV6。

(2)本发明开发的分子标记KASP_V6，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中，且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及EB等有毒物质的使用，直接对碱基进行检测，准确性不受扩增片段长度影响，而且简便、快捷、精准，自动化程度高，大大提高了基因选育效率，降低了成本。

(3)本发明所述的KASP标记可在苗期即可进行前景选择和背景选择，减小育种群体的田间种植规模，缩短育种年限，加快育种进程。

附图说明

图1为黑条矮缩抗性基因qRBSDV6的分子标记的开发流程图。

图2为分子标记KASP-qRBSDV6检测材料的分型图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与水稻抗黑条矮缩病qRBSDV6基因紧密连锁KASP标记开发

黑条矮缩抗性基因qRBSDV6的分子标记的开发流程见图1。根据文献报道，获得一个与qRBSDV6基因紧密连锁的SNP位点Chr6：1,153,858(Xiao S,Wang B,Liu Y,etal.Genome-wide association study and linkage analysis on resistance to riceblack-streaked dwarf virus disease[J].Molecular Breeding,2019,39(5))。本发明以Chr6：1,153,858(参考基因组为Oryza sativa Japonica cultivar:Nipponbare；GenBank:AP014962.1)为参考位点，获得水稻黑条矮缩的抗感基因型。

根据该SNP位点在NCBI获取Chr6：1,153,750-1,153,950范围序列，利用Oligo7.56软件(优选使用Oligo7.56，其他与引物设计相关的生物信息类软件也可以达到相同目的)设计KASP引物，共开发了3对KASP标记，利用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测后，挑选出1对基因分型良好的KASP引物(针对分子标记KASP_V6)用于后续验证。

用于检测分子标记KASP_V6的KASP引物具体如下：

Primer X：5’-gaaggtcggagtcaacggattATGGCACGTGGGTGGA-3’(SEQ ID No.1，小写字母部分为特异荧光标签序列VIC)；

Primer Y：5’-gaaggtgaccaagttcatgctTGGCACGTGGGTGGC-3’(SEQ ID No.2，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；

Primer R：5’-CGTAGGGGCGGTGCAG-3’(SEQ ID No.3)。

上游引物Primer X用于扩增水稻基因组Chr6：1,153,858为A的情况，Primer Y用于扩增水稻基因组Chr6：1,153,858为C的情况；下游引物Primer R为通用引物。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:A纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:A纯合型)的片段。

上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型记为C:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为C:C纯合型)的片段。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ IDNo.3所示的单链DNA分子扩增黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型记为A:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:C纯合型)的片段。

实施例2、用KASP引物检测SNP分子标记KASP_V6基因型方法的建立及应用

1、DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用常规CTAB法。

2、KASP反应测试

KASP标记扩增及反应体系：

(1)荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex检测：

5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA50ng，引物混液0.07μL(引物混液配比：正向引物PrimerX、Primer Y 100pmol·L

以上反应体系为AB-Q6 Flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

(2)选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测

1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL 0.8μL，引物混液0.03μL(引物混液配比：正向引物PrimerX、Primer Y 100pmol·L

以上反应体系为Douglas Scientific公司ArrayTape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。

其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg

扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，设置40个循环。

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

3、结果分析

采用基因分型软件KlusterCaller对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测水稻基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A还是C)：若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析靠近Y轴(VIC信号)，则待测水稻基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:A纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:A纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析靠近X轴(FAM信号)，则待测水稻基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为C:C纯合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为C:C纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析位于X轴和Y轴中间(同时有VIC和FAM信号)，则待测水稻基因组中黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型为A:C杂合型(即水稻第6号染色体的第1,153,858位点处碱基为A:C杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。

4、标记分型数据分析

为了验证KASP_V6标记的可靠性，对23份品种进行田间发病表型调查，具体如下：每份材料种植50株，株行距13.5cm×25cm。在幼苗期每天人工释放灰飞虱，以使材料充分感病。秧龄30天时进行表型鉴定，发现植株较群体内的正常株明显矮缩、叶色浓绿僵硬，则判定为受黑条矮缩病侵染，统计各材料的黑条矮缩病发病率；然后，采用上述方法利用KASP_V6对同样的材料进行分子标记检测。采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台进行检测，为了保证准确性，实验设计2次重复。扩增结果表明，KASP_V6标记在23份品种中能够获得稳定的PCR产物，并且能够检测到A-VIC和C-FAM两个等位位点(图2)。与发病表型结果进行一致性分析，根据发病等级与基因型的对应关系(A:A代表抗，A:C代表中感，C:C代表高感)，两者结果不同即算作不一致(计算公式y＝(n-x)/n，n代表样本总数，x代表不一致样本数量，y代表一致性比例)，结果表明标记KASP_V6与发病表型结果的一致性为91.3％(表1)。

因此，本发明所述的KASP_V6标记可用于水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的分子标记辅助育种。

表1、23份水稻测试品种的表型与基因型

注：表中发病率P＝0.00表示材料表型为免疫，0.01≤P＜0.30表示材料的表型为抗病，0.30≤P＜0.60表示材料的表型为中感，P≥0.60表示材料的表型为高感；‘A:A’表示纯合抗病基因型；‘C:C’表示纯合感病基因型；‘A:C’表示杂合抗病基因型；‘*’表示无检测信号。“W5686”记载于“Xiao S,Wang B,Liu Y,et al.Genome-wide association studyand linkage analysis on resistance to rice black-streaked dwarf virus disease[J].Molecular Breeding,2019,39:73”一文。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 常熟市农业科学研究所；扬州大学

<120> 用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物

<130> GNCLN202461

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gaaggtcgga gtcaacggat tatggcacgt gggtgga 37

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc ttggcacgtg ggtggc 36

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cgtaggggcg gtgcag 16