一种高通量鉴定椰枣树性别的方法

技术领域

本发明属种苗繁育技术领域，涉及一种植物性别鉴定方法，具体涉及一种利用荧光定量PCR技术高通量鉴定椰枣树性别的方法。

背景技术

椰枣(Phoenix dactylifera)又名海枣、伊拉克蜜枣，雌雄异株，原产于西亚和北非，是人类最早驯化的果树之一。椰枣是阿拉伯国家的重要木本粮食作物，被誉为“阿拉伯民族之树”，在中东阿拉伯国家的生态和经济建设中发挥着重要作用。椰枣营养丰富，约三分之二的成分为果糖，被誉为“沙漠面包”，长期以来一直是地中海、红海沙漠地带的主要食品。南美、南亚各国均有引种，其中以伊拉克、埃及、沙特阿拉伯和伊朗栽培面积最大。唐代传入中国，目前在海南、云南和广东等地都有栽培。

椰枣的自然寿命可达100多年，但经济寿命一般为25-30年，在商业种植园中需定期更新，因此，在育苗阶段把控种苗质量至关重要。椰枣目前主要通过分蘖和种子进行种苗繁育，但分蘖的繁殖系数十分有限，并且存在运输不便等问题；椰枣种子的发芽率一般超过80％，具有繁殖系数大、繁殖效率高等优势。椰枣商业种植园以种植雌株、获取果实为主要目的，仅需配置极少量的雄株(2％-3％)作为授粉树，因此，种子育苗需要解决雌雄异株的问题，保证种苗繁育以雌株为主。由于椰枣种苗在定植后一般需要生长5-8年才能开花结果，而在育苗及种植管理过程中需要花费大量的人力、物力和财力，若雄株种植过多则会影响产量，从而造成经济损失，故在种苗繁育阶段解决雌雄异株的问题对于椰枣商业种植、对椰枣产业发展尤为重要。中国专利“一种鉴别椰枣树性别的方法”(专利号：ZL 2018 10250068.3)应用SSR分子标记在育苗阶段对椰枣种苗性别进行早期鉴定，然而其通量相对较低、PAGE电泳检测步骤较复杂、成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量鉴定椰枣树性别的方法，应用荧光定量PCR技术在育苗阶段对椰枣树的性别进行早期鉴定，对于椰枣种苗质量控制及种植业发展具有重要意义，在椰枣种苗繁育等领域应用前景广阔。

本发明所采用的技术方案：

一种高通量鉴定椰枣树性别的方法，其具体步骤如下：

1、从椰枣幼嫩组织中提取DNA；

所述椰枣幼嫩组织是指椰枣的叶片、花序或茎；

2、对所提取的DNA利用引物进行荧光定量PCR扩增，同时获得熔解曲线；所述引物为M1，其序列分别为：

正向引物序列：5'-TGGCAGAGAAGTGATTTGAAGA-3'；

反向引物序列：5'-TAGGCAAGGTGGCTGATTAGTT-3'；

所述引物为M2，其序列分别为：

正向引物序列：5'-TGGCAGAGAAGTGATTTGAAGA-3'；

反向引物序列：5'-CAATTCCCTCGATTTCCTCA-3'；

所述引物为M3，其序列分别为：

正向引物序列：5'-CTTCTGGTTTCCATGTTGTTCA-3'；

反向引物序列：5'-GGTTATTTTGAGTTCCACGAGC-3'；

3、根据荧光定量PCR的熔解曲线情况对椰枣树进行性别鉴定：熔解曲线在75℃～85℃之间内表现单峰的为雄株，双峰的为雌株。

本发明中，所采用的引物序列也可以是由上述引物(M1、M2或M3)序列衍生的序列。

本发明的有益效果：

本发明采用荧光定量PCR技术，通过384孔荧光定量PCR扩增，通量更高，并且直接通过熔解曲线图的单峰或双峰鉴定椰枣树性别，可以在育苗阶段将雄性种苗分离出来，无需凝胶电泳，无需等到多年以后发现不结果时再剔除成年雄株，从而节约了时间和成本，对于椰枣种苗质量及育苗成本控制具有重要意义，在椰枣种苗繁育领域应用前景广阔。

附图说明

图1是使用引物M1对椰枣树性别鉴定的荧光定量PCR熔解曲线图。横坐标表示温度，纵坐标表示荧光强度，F表示雌性椰枣树，M表示雄性椰枣树。

图2是使用引物M2对椰枣树性别鉴定的荧光定量PCR熔解曲线图。横坐标表示温度，纵坐标表示荧光强度，F表示雌性椰枣树，M表示雄性椰枣树。

图3是使用引物M3对椰枣树性别鉴定的荧光定量PCR熔解曲线图。横坐标表示温度，纵坐标表示荧光强度，F表示雌性椰枣树，M表示雄性椰枣树。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。

实施例一

(1)合成用于鉴别椰枣树性别的荧光定量PCR引物M1，其中正向引物序列为：TGGCAGAGAAGTGATTTGAAGA(5'-3')，反向引物序列为：TAGGCAAGGTGGCTGATTAGTT(5'-3')。

(2)使用Dzup(植物)基因组DNA快速抽提试剂盒(产品编号：B518203-0100，生产商：生工生物工程股份有限公司)从叶片、花序或茎等幼嫩组织中提取DNA，具体操作为：

取0.05-0.1g椰枣叶片、花序或茎等幼嫩组织，在研钵中加入液氮迅速研磨成粉末，加入300ul Dzup震荡混匀，室温放置5-10min；加入300ul氯仿，室温静置5min；室温10000rpm离心10min，取上清；在上清液中加入等体积无水乙醇，颠倒混匀后，室温放置2-3min，用枪头挑出沉淀的DNA到新的1.5ml离心管；加入1ml 75％乙醇，漂洗1-3min，12000rpm室温离心2min，弃上清，并重复操作一次；开盖室温倒置5-10min；加入50-100ulddH

(3)使用步骤(1)所述的引物和SGExcel FastSYBR qPCR预混液(含ROX)(产品编号：B532954，生产商：生工生物工程股份有限公司)，对步骤(2)所得的DNA进行荧光定量PCR扩增；反应体系为5ul：2.5ul 2×SGExcel FastSYBR Mixture(With Low Rox)，0.5ul正向引物，0.5ul反向引物，0.5ul DNA，1ul RNase free ddH

(4)根据熔解曲线情况对椰枣种苗进行性别鉴定：在75-85℃之间熔解曲线为单峰的是雄性，双峰的是雌性。

鉴定效果：

实验材料：已经开花或结果的成年椰枣雄株、雌株各48份(用于验证荧光定量PCR鉴定结果的可靠性)。

实验方法：采用本发明所述的鉴定椰枣树性别的方法(提取叶片、花序或茎等幼嫩组织DNA，配制反应体系为5ul后进行荧光定量PCR扩增，获得熔解曲线图。

实验结果：根据荧光定量PCR仪中熔解曲线图75-85℃之间的单、双峰情况(见图1)对成年椰枣树的性别进行鉴定，鉴定实验结果如表1所示，单峰为雄性椰枣，双峰为雌性椰枣。

表1椰枣树性别的鉴定效果

结果表明，对雌、雄成年椰枣树的性别鉴定结果的准确率为100％，且单次通量高，实验试剂成本低，检测周期短，荧光定量PCR完成后直接获得实验结果，不需要再进行电泳观察。

实施例二

(1)合成用于鉴别椰枣树性别的荧光定量PCR引物M2，其中正向引物序列为：TGGCAGAGAAGTGATTTGAAGA(5'-3')，反向引物序列为：CAATTCCCTCGATTTCCTCA(5'-3')。

(2)使用Dzup(植物)基因组DNA快速抽提试剂盒(产品编号：B518203-0100，生产商：生工生物工程股份有限公司)从叶片、花序或茎等幼嫩组织中提取DNA，具体操作为：

取0.05-0.1g椰枣叶片、花序或茎等幼嫩组织，在研钵中加入液氮迅速研磨成粉末，加入300ul Dzup震荡混匀，室温放置5-10min；加入300ul氯仿，室温静置5min；室温10000rpm离心10min，取上清液加入等体积无水乙醇，颠倒混匀后，室温放置2-3min，用枪头挑出沉淀的DNA到新的1.5ml离心管；加入1ml 75％乙醇，漂洗1-3min，12000rpm室温离心2min，弃上清，并重复操作一次；开盖室温倒置5-10min；加入50-100ul ddH

(3)使用步骤(1)所述的引物和SGExcel FastSYBR qPCR预混液(含ROX)(产品编号：B532954，生产商：生工生物工程股份有限公司)，对步骤(2)所得的DNA进行荧光定量PCR扩增；反应体系为10ul：5ul 2×SGExcel FastSYBR Mixture(With Low Rox)，1ul正向引物，1ul反向引物，0.5ul DNA，3.5ul RNase free ddH

(4)根据熔解曲线情况对椰枣种苗进行性别鉴定：在75-85℃之间熔解曲线为单峰的是雄性，双峰的是雌性。

鉴定效果：

实验材料：已经开花或结果的成年椰枣雄株、雌株各10份(用于验证荧光定量PCR鉴定结果的可靠性)。

实验方法：采用本发明所述的鉴定椰枣树性别的方法(提取叶片、花序、茎等幼嫩组织DNA，配制反应体系为10ul后进行荧光定量PCR扩增，获得熔解曲线图。

实验结果：根据荧光定量PCR仪中熔解曲线图75-85℃之间的单、双峰情况(见图2)对成年椰枣树的性别进行鉴定，鉴定实验结果如表2所示，单峰为雄性椰枣，双峰为雌性椰枣。

表2椰枣树性别的鉴定效果

结果表明，对雌、雄成年椰枣树的性别鉴定结果的准确率为100％，且单次通量高，实验试剂成本低，检测周期短，荧光定量PCR完成后直接获得实验结果，不需要再进行电泳观察。

实施例三

(1)合成用于鉴别椰枣树性别的荧光定量PCR引物M3，其中正向引物序列为：CTTCTGGTTTCCATGTTGTTCA(5'-3')，反向引物序列为：GGTTATTTTGAGTTCCACGAGC(5'-3')。

(2)使用Dzup(植物)基因组DNA快速抽提试剂盒(产品编号：B518203-0100，生产商：生工生物工程股份有限公司)从叶片、花序或茎等幼嫩组织中提取DNA，具体操作为：

取0.05-0.1g椰枣叶片、花序或茎等幼嫩组织，在研钵中加入液氮迅速研磨成粉末，加入300ul Dzup震荡混匀，室温放置5-10min；加入300ul氯仿，室温静置5min；室温10000rpm离心10min，取上清加入等体积无水乙醇，颠倒混匀后，室温放置2-3min，用枪头挑出沉淀的DNA到新的1.5ml离心管；加入1ml 75％乙醇，漂洗1-3min，12000rpm室温离心2min，弃上清，并重复操作一次；开盖室温倒置5-10min；加入50-100ul ddH

(3)使用步骤(1)所述的引物和SGExcel FastSYBR qPCR预混液(含ROX)(产品编号：B532954，生产商：生工生物工程股份有限公司)，对步骤(2)所得的DNA进行荧光定量PCR扩增；反应体系为20ul：10ul 2×SGExcel FastSYBR Mixture(With Low Rox)，1ul正向引物，1ul反向引物，1ul DNA，7ul RNase free ddH

(4)根据熔解曲线情况对椰枣种苗进行性别鉴定：在75-85℃之间熔解曲线为单峰的是雄性，双峰的是雌性。

鉴定效果：

实验材料：已经开花或结果的成年椰枣雄株、雌株各10份(用于验证荧光定量PCR鉴定结果的可靠性)。

实验方法：采用本发明所述的鉴定椰枣树性别的方法(提取叶片、花序或茎等幼嫩组织DNA，配制反应体系为20ul后进行荧光定量PCR扩增，获得熔解曲线图。

实验结果：根据荧光定量PCR仪中熔解曲线图75-85℃之间的单、双峰情况(见图3)对成年椰枣树的性别进行鉴定，鉴定实验结果如表3所示，单峰为雄性椰枣，双峰为雌性椰枣。

表3椰枣树性别的鉴定效果

结果表明，对雌、雄成年椰枣树的性别鉴定结果的准确率为100％，且单次通量高，实验试剂成本低，检测周期短，荧光定量PCR完成后直接获得实验结果，不需要再进行电泳观察。

以上所述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。