一种禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于病毒分子生物学检测领域，具体涉及到一种禽流感病毒H5， H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是禽流行性感冒(Avian influenza，AI)的病原体，在分类学上属正粘病毒科甲(A)型流感病毒属，其核酸为分节段的单股负链RNA。我国主要流行的禽流感病毒属于H5，H7和H9亚型。目前所有的HPAIV都属于H5或H7亚型，并且H5和H7亚型禽流感导致的禽流感被OIE纳入为必须报告的禽流感。H9亚型的禽流感病毒虽属于LPAIV，但是目前认为其对于禽类仍表现出较强的致病性，对其生产性能造成严重危害。另外H5，H7和H9亚型是目前人感染高致病性禽流感(简称人禽流感) 的重要亚型，如H5N1，H7N9，H9N2等严重时可以引起败血症、多脏器衰竭等造成人类死亡。因此，H5，H7和H9亚型禽流感病毒对畜禽养殖和人类健康造成严重威胁，对其进行快速和早期的分亚型鉴定有着重要的意义。

目前对禽流感必须依赖实验室检查进行确诊，实验室检测方法根据检测耗时可以分为传统的病毒分离鉴定和快速检测方法。病毒分离鉴定是病毒诊断的金标准，但其操作繁琐且时效性差。病毒的快速检测是指绕过病毒的分离培养，直接对病毒进行病原学或血清学的检测。检测病毒特异性核酸的病原学诊断方法主要依赖于分子生物学技术，故其又称为病毒的分子生物学诊断。目前对于禽流感病毒分亚型的分子生物学诊断技术主要包括生物传感器技术和核酸扩增技术。生物传感器技术如等离子体共振生物传感器、免疫电化学传感器基和基因芯片等都已经用于禽流感病毒快速鉴定，其具有高通量、高精度以及快速的特点，但是仅仅适用于实验室内的诊断，其检测耗时大概在8h左右，且其在国内的普及度仍有限。核酸扩增技术分为变温核酸扩增如聚合酶链式反应 (polymerase chainreaction,PCR)等和等温核酸扩增如环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)等。基于等温核酸扩增技术的检测方法由于其不需要精密设备，成为现场即时检测的快速诊断方法的主要研究方向，其目前待解决的技术问题主要有假阳性率过高等。基于PCR技术的检测方法是目前使用较为普遍的病毒分子生物学诊断手段。荧光定量 RT-PCR技术(Real-time quantitative RT-PCR)是可定量监测目的基因扩增数量的PCR技术，其具有快速、高敏感性和高特异性的特点，能在短时间内检出痕量核酸过标准曲线定量起始核酸拷贝数而大大缩小了交叉污染率，适于作为高通量快速检测方法的技术基础。

目前兽医临床上已经有较多的荧光定量PCR检测技术可以对禽流感进行诊断。其中单重荧光定量PCR检测技术虽然针对特定亚型的禽流感病毒的鉴定有较高的敏感性和特异性，但是其检测效率较低，检测周期较长，并且在样品采集量限制的条件下，无法诊断单一病料的禽流感多重感染。

虽然目前多重荧光定量PCR检测技术也得以普及，但其在应用过程常常面临交叉污染、假阳性率较高等问题。另外由于多重荧光定量RT-PCR检测方法涉及多个过程在同一体系内先后或同时反应，体系内不同组分之间可能发生相互干扰，如不同引物和探针之间容易发生非特异性结合，造成检测的特异性较低。在检测的敏感性方面，多重荧光定量PCR一般无法达到单重荧光定量 PCR的水平。除引物序列外，体系中的引物浓度、探针浓度与反应过程中的退火温度是影响反应敏感性的重要因素。因为多个扩增反应在同一体系内同时进行，多重荧光定量PCR反应体系和反应程序的优化必须同时顾及多个反应的最适条件，这需要建立综合性的数学模型进行评估。这使得反应体系和反应程序的优化成为一个技术难点。并且综合性的优化也显然难以使其中具体某一单一反应达到其单重荧光定量PCR反应时的敏感度。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种禽流感病毒 H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括，RT-PCR反应液、酶反应液、引物探针混合物、无菌无核酸酶水、阳性对照和阴性对照；试剂盒的组分预装规格为：RT-PCR反应液600μL/管；酶反应液60μL/管；引物探针混合物2880μL/管；无菌无核酸酶水500μL/管；阳性对照100μL/管；阴性对照100 μL/管；所述RT-PCR反应液，包括dNTP、Mg

作为本发明所述禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的一种优选方案，其中：所述引物设计优选包括以下步骤：在GenBank 中获取禽流感病毒的H5、H7和H9亚型的血凝素相关基因序列；用DNAMAN 软件进行基因同源性对比分析确定核酸保守序列区；利用Primer Express5.0软件，按照其引物设计原则，分别针对其特异性目标片段设计特异性引物和荧光探针；所述荧光报告基团优选为FAM、JOE和Cy5，分别标记不同的探针以区别不同亚型血凝素基因的荧光信号；所述荧光淬灭基团优选为BHQ1和BHQ2；优选的H5亚型禽流感病毒HA基因的特异性探针在其5’端和3’端分别携带Cy5荧光报告基团和BHQ2荧光淬灭基团；H7亚型禽流感病毒HA基因的特异性探针在其5’端和3’端分别携带JOE荧光报告基团和BHQ1荧光淬灭基团；H9亚型禽流感病毒HA基因的特异性探针在其5’端和3’端分别携带 FAM荧光报告基团和BHQ1荧光淬灭基团。

作为本发明所述禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的一种优选方案，其中：所述引物探针包括，H9亚型流感病毒的探针、 H9亚型流感病毒的正向引物、H9亚型流感病毒的反向引物、H7亚型流感病毒的探针、H7亚型流感病毒的正向引物、H7亚型流感病毒的反向引物、H5 亚型流感病毒的探针、H5亚型流感病毒的正向引物和H5亚型流感病毒的反向引物，其中，

所述H9亚型流感病毒的探针具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述H9亚型流感病毒的正向引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

所述H9亚型流感病毒的反向引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

所述H7亚型流感病毒的探针具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

所述H7亚型流感病毒的正向引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

所述H7亚型流感病毒的反向引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

所述H5亚型流感病毒的探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；

所述H5亚型流感病毒的正向引物具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

所述H5亚型流感病毒的反向引物具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

作为本发明所述禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的一种优选方案，其中：所述阳性标准质粒的制备方法，包括以下步骤：

A、分别提取H5、H7和H9亚型流感病毒样本的总RNA；

B、将所述步骤A中得到的H5、H7和H9亚型流感病毒的总RNA分别进行反转录，得到H5、H7和H9亚型流感病毒的cDNA；

C、以所述步骤B得到的cDNA为模版，采用表8中所示的有关序列分别作为上游引物和下游引物扩增H5、H7和H9亚型流感病毒的血凝素基因特异性目标片段；

D、将所述步骤C得到的特异性目的片段通过融合PCR的方法获得融合基因全长片段，将3段基因按照H5-HA、H7-HA和H9-HA基因的顺序进行融合，最终获得包含H5、H7和H9亚型禽流感病毒血凝素基因保守区的融合片段。

E、将所述片段连接至pMD18T载体上，然后转入大肠杆菌，得到阳性质粒标准品。

作为本发明所述禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的一种优选方案，其中：所述三重荧光定量RT-PCR方法，其最优反应体系为：体系总体积为20.0μL；其中，RT-PCR用量为反应液10.0μL，反转录酶和Taq酶用量为1.0μL，模板RNA用量为2.0μL，引物H5-F、H5-R、H9-F和 H9-R用量均为0.4μL，H7-F和H7-R用量均为0.6μL，H5和H7探针用量均为 0.1μL，H9探针用量为0.2μL，DEPC水补足20.0μL。

作为本发明所述禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的一种优选方案，其中：所述三重荧光定量RT-PCR方法的最优反应程序为：55℃进行反转录反应15min；95℃预变性30s；执行95℃变性10s，54℃退火和延伸30s后循环，共40个循环，在54℃进行荧光检测。

作为本发明所述禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的一种优选方案，其中：所述最优反应体系和最优反应程序的确定方法为：用MODDE 12.1(Umetrics,Sweden)软件，根据响应曲面优化设计法对该反应体系和反应程序进行系统设计和分析，构造对应响应面以获取最优区。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种禽流感病毒 H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种禽流感病毒H5， H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法，包括，在避光条件下，取出包装盒中各组分，在室温15～25℃下放置，其温度平衡至室温 15～25℃，瞬时离心后，备用；根据待检样品、阴性以及阳性对照的数量，按比例取相应量的试剂，加入离心管中充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心后分装至每个反应管，18μL/管；吸取已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各2μL加入到对应反应管中；将反应管盖好盖子后放入荧光定量PCR仪，选择检测通道，并按照优选的反应程序：55℃进行反转录反应15min；95℃预变性30s；执行95℃变性10s，54℃退火和延伸30s后循环，共40个循环，在54℃进行荧光检测，进行扩增反应；根据不同荧光曲线的荧光信号颜色和信号强度来判断属于禽流感病毒亚型的类别；根据扩增结果可判定禽流感病毒亚型的定性鉴定；根据得到的Ct值和提供的标准曲线进行样品病毒滴度的定量判定。

作为本发明所述禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒使用方法的一种优选方案，其中：所述根据待检样品、阴性以及阳性对照的数量，按比例取相应量的试剂，其中，试剂中RT-PCR反应液10μL，酶反应液1μL，引物探针混合物3.2μL，无菌无核酸酶水3.8μL。

作为本发明所述禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒使用方法的一种优选方案，其中：所述选择检测通道，其中，Cy5通道检测H5，VIC通道检测H7，FAM通道检测H9。

作为本发明所述禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒使用方法的一种优选方案，其中：所述根据扩增结果可判定禽流感病毒亚型的定性鉴定，其中，Ct值＜35且扩增曲线为典型S型则判定为阳性；无 Ct值显示、无典型的S型扩增曲线或Ct值≥35则判定为阴性；

所述根据得到的Ct值和提供的标准曲线进行样品病毒滴度的定量判定，其中，标准曲线：

H5：y＝-3.5479x+40.485；

H7：y＝-3.5111x+38.736；

H9：y＝-3.5411x+40.114；

x为对应HA亚型的标准毒株的核酸拷贝数(copies/μL)的对数；y为Ct 值。

本发明有益效果：

(1)本发明提供了一种同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，其组分包括RT-PCR反应液,酶反应液,引物探针混合物,无菌无核酸酶水,阳性对照和阴性对照。所述试剂盒能在短时间内同时对检测待测样品中H5、H7和H9亚型禽流感病毒进行分亚型定量鉴定。在H5、 H7和H9禽流感病毒的临床实验室诊断和流行病学调查中有良好的应用潜力和应用价值。

(2)本发明所提供的禽流感病毒H5、H7、H9亚型荧光定量RT-PCR检测方法是一种禽流感病毒的分子生物学快速检测方法。该方法在保证单管多检的高检测效率和低成本的前提下，同时具备了交叉污染率低、操作简便、具荧光监控性、检测效率高、高特异性、高敏感性、高稳定性的特点，为H5、H7 和H9亚型禽流感病毒的快速分亚型鉴定提供了有效的技术手段。

(3)本发明所提供的禽流感病毒H5、H7、H9分亚型检测手段是一种实时荧光定量RT-PCR方法。该方法直接利用RNA作为模板进行检测，使得反转录和PCR扩增过程在同一体系内完成，中途无需其他操作，避免多步操作导致试验误差和样品交叉污染。另外本发明所述试剂盒采用阳性质粒标准品作为阳性对照，该质粒同时融合了H5、H7和H9亚型禽流感病毒血凝素基因序列保守区，降低了试剂盒成本，避免了采用标准病毒液作为对照时可能造成的环境污染以及样品的交叉污染导致的假阳性。克服了荧光定量PCR交叉污染率、假阳性率较高的问题，降低了实验误差，缩短了检测周期，且操作简便，提高了检测效率。

(4)本发明提供了H5、H7、H9亚型禽流感病毒的三重荧光定量RT-PCR 优化的引物和探针系列、最佳反应体系及反应程序。本发明进行了引物和探针序列的设计和优选，提高了其目标片段的保守性，以及其与之的结合率。进一步的，本发明采用了响应曲面优化设计法对该反应体系和反应程序进行系统设计和分析，建立了引物浓度、探针浓度和退火温度三变量的响应曲面模型，进而筛选出了引物与探针间干扰最小、扩增条件相近和扩增效率最高的组合，以及与之相配合的最优的退火温度。在保证了多重检测、低成本的前提下，使得检测特异性和敏感性最大化。该三重荧光定量RT-PCR方法的对于样品中H5、 H7和H9亚型病毒核酸拷贝数的敏感性可分别达到50copies/μL、50copies/μL 和50copies/μL，克服了多重荧光定量RT-PCR单一反应敏感性较低的不足。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明实施例3中三重荧光定量RT-PCR标准曲线图(其中A为 H5扩增曲线；B为H5标准曲线；C为H7扩增曲线；D为H7标准曲线；E 为H9扩增曲线；F为H9标准曲线)。

图2为本发明实施例5中三重荧光定量RT-PCR的特异性试验结果(其中 A为H5检测特异性；B为H7检测特异性；C为H9检测特异性)。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

在本实例中，所述H1-H8，H10-H13亚型禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒(avianinfectious bronchitis virus,IBV)和禽传染性法氏囊病病毒(infectious bursaldisease virus,IBDV)均由农业部病毒学重点实验室分离并保存。其中H5 与H7亚型毒株是重组构建的低致病性毒株。该低致病性重组毒株以A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(简称PR8)六个基因片段作为骨架，H5亚型毒株的HA 和NA基因片段来源于A/chicken/Jiangsu/k0101/2010(H5N1)，H7亚型毒株的 HA和NA基因片段来源于A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3))。在本实例中， H9亚型毒株(A/chicken/Zhejiang/A2013/2017(H9N2))、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV-LASOTA)和J亚群禽白血病病毒(avian leukosisvirus-J subgroup,ALV-J)由本实验室分离并保存。病毒株详细信息如表1所示(表中 H5与H7毒株是以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)六个基因片段作为骨架构建的低致病力毒株)：

表1病毒株详细信息

在本实例中，所述RT-PCR反应液以及RT-PCR酶反应液优选自诺唯赞 (VazymeBiotech Co.,Ltd)提供的最优扩增反应液及酶反应液(Q222-CN-GSI)，其中2×one step Qprobe mix作为RT-PCR反应液，one step Q probe enzyme mix 作为酶反应液。

在本实例中，所述多重荧光定量PCR扩增优选在LightCycler96荧光定量 PCR仪上，产自Roche Diagnostics公司。若使用其他荧光定量PCR仪，实验者应注意使用仪器应具有470/510nm、530/565nm、630/665nm的激发/检测波长。

本发明试剂盒应试剂应避光密封储存于-20℃条件下；试剂盒有效期为9 个月，避免反复冻融；本发明H5、H7和H9的特异性引物包括H5、H7和H9 亚型禽流感病毒血凝素基因的正向引物和反向引物；本发明所述H5、H7和 H9的特异性探针为H5、H7和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的Taqman荧光探针。所述的TaqMan荧光探针标记包含一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。在本发明中，所述引物和探针的来源均是利用引物设计软件得到的。在本发明对引物合成没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的合成方法即可。

本发明三重荧光定量RT-PCR检测方法对样本的要求为：畜禽鼻拭子、咽拭子、禽泄殖腔拭子、血样、脏器、组织样品等经提取纯化后的核酸。建议使用商业化的试剂盒提取和纯化样本中的RNA。提取和纯化后的RNA建议立即检测，否则请于-70℃以下冻存，保存时间不超过6个月。

实施例1：

禽流感H5，H7、H9亚型引物及探针设计

本实例参考了GenBank数据库中公开发表的禽流感病毒的H5，H7和H9 亚型的血凝素相关基因序列，通过DNAMAN软件进行基因同源性对比分析，确定其核酸保守序列区作为特异性的目标片段。利用Primer Express5.0软件，分别针对其特异性目标片段设计特异性引物和荧光探针。通过试验对比证明，优选的特异性引物和荧光探针对于反应的特异性的提高有显著的积极作用。

本发明中H5亚型禽流感病毒HA基因的特异性探针在其5’端和3’端分别携带Cy5荧光报告基团和BHQ2荧光淬灭基团；H7亚型禽流感病毒HA 基因的特异性探针在其5’端和3’端分别携带JOE荧光报告基团和BHQ1荧光淬灭基团；H9亚型禽流感病毒HA基因的特异性探针在其5’端和3’端分别携带FAM荧光报告基团和BHQ1荧光淬灭基团。

H9亚型流感病毒的探针具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

H9亚型流感病毒的正向引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

H9亚型流感病毒的反向引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

H7亚型流感病毒的探针具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

H7亚型流感病毒的正向引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

H7亚型流感病毒的反向引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

H5亚型流感病毒的探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；

H5亚型流感病毒的正向引物具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

H5亚型流感病毒的反向引物具有如SEQ ID No.9所示。核苷酸序列引物及探针序列如表2所示。

本案例中设计所获引物与探针均由上海生工生物工程有限公司合成。

表2引物及探针序列

实施例2：

三重荧光定量RT-PCR反应体系及程序的优化

本发明针对该三重荧光定量RT-PCR反应体系的各探针用量、各引物浓度及反应程序中的反应参数(退火温度)进行优化。

本实例中优选采用响应曲面优化设计法对该反应体系和反应程序进行系统设计和分析，构造对应响应面以获取最优区。本实例采用了MODDE 12.1 (Umetrics,Sweden)软件，在中心复合设计中优选出中心复合表面设计作为响应曲面模型，采用最速下降法寻找最优区域，共设计17个优化实验(如表3 所示)。

表3三重荧光定量RT-PCR体系优化实验设计表

选择标定EID

根据等高线图和反应曲面图模型分析和系统试验结果，三重荧光定量 RT-PCR最佳反应体系为20.0μL，其中RT-PCR反应液(2×one step Q probe mix)10.0μL，酶反应液(One step Q probe enzyme mix)1.0μL，模板RNA用量为2.0μL，引物H5-F、H5-R、H9-F和H9-R各0.4μL(0.2μM)，H7-F和 H7-R各0.6μL(0.3μM)，H5和H7探针各0.1μL(0.05μM)，H9探针各0.2 μL(0.1μM)，DEPC水补足20.0μL，如表4所示。

表4三重荧光定量RT-PCR反应体系

其反应程序为：55℃进行反转录反应15min；95℃预变性30s；执行95℃变性10s，54℃退火和延伸30s后循环，共40个循环，在54℃进行荧光检测，如表5所示。此时获得Ct值最小且荧光强度最大。

表5三重荧光定量RT-PCR反应程序

实施例3：

标准曲线的绘制

分别以10倍连续梯度稀释的标定核酸拷贝数的H5，H7和H9标准毒株基因组RNA为模板，根据优化后的反应体系和程序进行三重荧光定量RT-PCR 扩增，每个反应设置3个重复，同时设置阳性和阴性对照，分别以H5，H7和 H9毒株标准RNA起始核酸拷贝数的对数作X轴，Ct值作为Y轴绘制标准曲线，通过标准曲线对未知样品进行定量，并得出反应的扩增效率和标准曲线的斜率及相关性系数。结果如图1所示(其中A为H5扩增曲线；B为H5标准曲线；C为H7扩增曲线；D为H7标准曲线；E为H9扩增曲线；F为H9标准曲线)，

本研究建立方法的H5标准曲线方程为y＝-3.5479x+40.485，H7标准曲线方程为y＝-3.5111x+38.736，H9标准曲线方程为y＝-3.5411x+40.114(x为对应 HA亚型的标准毒株的核酸拷贝数(用copies/μL表示)的对数；y为Ct值)。根据早期优化过程所得标准曲线，H5，H7和H9扩增效率(E)分别为1.03， 0.93和0.89，且标准曲线的R

实施例4：

敏感性试验

4.1H5，H7和H9标准毒株核酸起始拷贝数的标定

分别取H5，H7和H9标准病毒尿囊液提取RNA，通过NanoDrop 2000超微量分光光度计测定其浓度及分析其纯度，根据RNA标准品拷贝数计算公式分别计算出其拷贝数，然后将H5、H7和H9标准品核酸起始拷贝数统一标定为5×10

4.2敏感性试验

本实例通过采用所述方法对以10倍梯度稀释的标定核酸起始拷贝数的 H5，H7和H9毒株RNA模板进行测定，以确定该方法的极限敏感度。其中所述H5、H7和H9标准毒株的核酸起始拷贝数均标定为5×10

实验结果如表6所示，该三重荧光定量RT-PCR方法对于样品中H5、H7 和H9亚型病毒核酸拷贝数的敏感性可分别达到50copies/μL、50copies/μL和 50copies/μL。

表6三重荧光定量RT-PCR的敏感性

实施例5：

特异性试验

本实例中计划验证该检测方法对于各HA亚型甲型流感病毒，以及家禽以及鸟类常见的其他重要病毒性病原的分子生物学鉴定是否存在交叉反应性。本实例分别对以下病毒性病原的核酸进行了检测：H1-H13亚型的禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒J亚型。

本实例以H1、H2、H3、H4、H5，H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、 H13亚型AIV、IBV、NDV、IBDV和ALV-J病毒的RNA作为模板，在同一个反应中设置三个重复试验和阴性、阳性对照，以最佳反应条件进行三重荧光定量RT-PCR方法测定，以检验方法对H5，H7和H9病毒的RNA的特异性。结果如图2所示(其中A为H5检测特异性；B为H7检测特异性；C为H9检测特异性)。本研究所使用的特异性Taqman荧光探针能特异性地检测H5，H7 和H9亚型AIV，出现特异性荧光曲线，与其他HA亚型(H1-H13)AIV以及其他的禽类常见重要病毒性传染病(传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、新城疫病毒和禽白血病病毒J亚群)均不产生非特异性扩增。说明本方法具有良好的特异性。

实施例6：

重复性试验

将实施例4的4.1中标定的H5，H7和H9亚型毒株作10倍倍比稀释后，分别选择其低、中和高拷贝数(H5亚型选择5×10

表7三重荧光定量RT-PCR的重复性

实施例7：试剂盒的组装

7.1质粒标准品的准备

本实例中，所述阳性质粒标准品的制备方法优选包括以下步骤：

分别提取H5、H7和H9亚型流感病毒样本的总RNA，将所得到的H5、H7和H9亚型流感病毒的总RNA分别进行反转录，得到H5、H7和H9亚型流感病毒的cDNA。将该cDNA作为模版，利用表8中所示的有关序列分别作为上游引物和下游引物扩增H5，H7和H9亚型流感病毒的血凝素基因特异性目标片段。扩增的各段基因片段切胶回收纯化，借助融合PCR的方法融合所得基因，将3段基因按照H5-HA、H7-HA和H9-HA基因的顺序进行融合，所用引物见表8。

表8融合PCR引物

首先将H5-HA和H7-HA基因片段融合，融合体系如下：高保真酶缓冲液 25μL，dNTP1μL，H5-HA基因(100ng)1μL，H7-HA基因(100ng)1μL，灭菌水21μL，总体系为50μL，按照下列反应程序进行融合：95℃预变性30s， 95℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸1min，扩增20个循环，72℃总延伸5 min。用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的PCR产物。鉴定符合融合目的者按下列程序进行扩增：高保真酶1μL，高保真酶缓冲液25μL，dNTP 1μL，PCR 产物2μL，通用载体H5 UP-F2 2μL，通用载体H5 DOWN-F1757 2μL，灭菌水17μL，总体系为50μL，反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸1min，扩增30个循环，72℃总延伸5min。切胶回收获得 H5-HA和H7-HA基因融合产物。

最后将H9-HA和融合产物按照上述条件进行融合，以获得包含H5，H7 和H9亚型AIVHA基因序列保守区的融合产物，在pMD18-T载体上连接纯化后的PCR产物，转化宿主菌E.coli DH5α感受态细胞并进行培养。选择阳性经过测序分析鉴定后，提取质粒DNA并测定浓度，计算并确定该质粒中目的基因片段的拷贝数，并作为质粒标准品的母液。

在本实例中，经测序证明重组质粒插入融合基因片段与目的基因序列完全一致，说明重组质粒构建成功。提取质粒标准品母液，通过NanoDrop 2000测定浓度后计算拷贝数，依次10倍倍比稀释，建立质粒标准品，质粒标准品浓度为0.05ng/μL-0.5ng/μL，拷贝数介于10

7.2试剂盒其他组分的准备

所述试剂盒的其他组分按照表9所示的组成关系和规格预装量进行配置组装。该试剂盒至于避光环境下-20℃或以下温度进行保存。

表9三重荧光定量RT-PCR试剂盒组分

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京农业大学

<120> 一种禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用

<130> 1

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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