肺癌细胞辐射适应性MicroRNA表达谱检测方法

技术领域

本发明涉及癌细胞辐射适应性检测技术领域，具体涉及一种肺癌细胞辐射适应性MicroRNA表达谱检测方法。

背景技术

我国肺癌的发病率和死亡率占城市恶性肿瘤的首位，其发病率和死亡率逐年升高，越来越引起研究者的关注。肺癌常规治疗包括手术、化疗、放疗、生物治疗、分子靶向治疗和中药治疗等。据临床统计，非小细胞肺癌确诊时仅有20％病例能进行根治性手术，在手术切除的病例中5年生存率仅为30％～40％。术后放疗能在一定程度上提高肺癌患者局部控制率和生存率，因此被广泛的应用。放疗是治疗肺癌的常用方法。

放射治疗是肺癌治疗的主要手段，约70％的病人需接受放射治疗。在肺癌的放射治疗中，目前仍延续应用几十年一贯的治疗模式，2Gy/次，每周5次，总剂量60～70Gy/6～7周。

而事实上不同个体对放射适应性是存在差异的，目前针对肺癌细胞的辐射适应性的研究经验很少。放疗在破坏和杀灭癌细胞同时，也不可避免地对常组织细胞造成一定损伤，这已成为增加放疗剂量以提高疗效的一大障碍。因此，低剂量辐射以及高剂量对于肺癌细胞的辐射适应性研究就有了重要技术价值，它可以作为研究肺癌细胞(甚至是普通细胞)放疗技术应用的重要研究资料。同时，肺癌细胞辐射适应性的检测对于改善和指导临床肿瘤放射治疗，增进治疗效果具有重要的理论意义和实用价值，目前，国内外还没有肺癌细胞辐射适应性MicroRNA表达谱检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肺癌细胞辐射适应性MicroRNA表达谱检测方法，以解决现有技术存在的技术问题。

基于上述目的，本发明提供的肺癌细胞辐射适应性MicroRNA表达谱检测方法，包括：

步骤100.标本选择

选择目标肺癌细胞系，利用培养基培养目标肺癌细胞至对数生长期，将目标肺癌细胞分为实验组和对照组；

其中，对于实验组的目标肺癌细胞；

先采用低剂量的不同射线辐照、再采用高剂量的射线辐照实验组的目标肺癌细胞至细胞消化；

对于对照组的目标肺癌细胞；

采用高剂量的射线辐照目标肺癌细胞至细胞消化；

将上述细胞消化后的实验组和对照组进行低温保存；

步骤200.总RNA提取

加入RNA提取试剂至实验组和对照组中的目标肺癌细胞系中，使目标肺癌细胞裂解，对细胞裂解液进行离心、吸取上清，振荡操作后得到水溶解沉淀物；

步骤300.miRNA芯片处理

分别取一定量的实验组和对照组的总RNA，进行芯片杂交，杂交后的芯片进行图像扫描及数据分析，采用聚类分析方法分析不同剂量辐照后肺癌细胞MicroRNA表达谱的差异，得出差异数据。

进一步的，所述步骤100包括：

选择目标肺癌细胞系，采用10％FBS，1％青链霉素的培养基，37℃，5％CO

进一步的，所述步骤100包括：

对于实验组的目标肺癌细胞：

采用X射线分别按照50mGy、200mGy的辐照剂量照射目标肺癌细胞；

停止照射并至少间隔4小时后，再采用20Gy的辐照剂量再次照射目标肺癌细胞至细胞消化后，-80℃低温保存；

对于对照组的目标肺癌细胞：

采用20Gy的辐照剂量照射目标肺癌细胞至细胞消化后，-80℃低温保存。

进一步的，所述步骤200包括如下操作步骤：

步骤201：在实验组和对照组中的目标肺癌细胞中，分别加入RNA提取试剂，使目标肺癌细胞裂解，分别收集相对应的细胞裂解液至实验组和对照组的离心管中；

步骤202：在离心管中分别加入氯仿，振荡，离心；

步骤203：吸取上清，加入异丙醇，转动离心管并混匀；

步骤204：将离心管置于-72℃冰箱冷藏1h；

步骤205：取出离心管离心，弃去上清，在管底形成有白色沉淀，加入75％乙醇并振荡，离心；

步骤206：弃去上清，室温下晾干后，加入经DEPC处理的水溶解沉淀。

进一步的，所述步骤300包括：

步骤301：以辐照条件为50mGy-20Gy、200mGy-20Gy的目标肺癌细胞为实验组，以辐照条件20Gy的目标肺癌细胞为对照组，分别取10μg总RNA，采用微流体芯片进行芯片杂交，杂交后的芯片用微阵列基因芯片扫描仪进行图像扫描，采用生物芯片扫描分析软件进行数据分析，计算两种荧光信号的比值，用t-test进行差异显著性分析，p<0.05为有显著性差异；

其中，采用聚类分析方法分析不同剂量辐照后肺癌细胞MicroRNA表达谱的差异；

步骤302：筛选出50mGy-20Gy和200mGy-20Gy的实验组与20Gy照射剂量的对照组相比较，得出表达有共同显著差异趋势的microRNA的差异数据。

进一步的，还包括：

步骤400.采用qRT-PCR实验方法对表达有共同显著差异趋势的microRNA进行验证。

进一步的，所述步骤400还包括：检测经步骤100处理后的实验组和对照组中，目标肺癌细胞的DNA损伤情况。

进一步的，所述步骤400还包括：检测经步骤100处理后的实验组和对照组中，目标肺癌细胞的凋亡情况。

进一步的，在步骤300之前，还包括：

步骤220.总RNA样本质量检测：

步骤221：琼脂糖凝胶电泳分别分析实验组和对照组的RNA降解程度以及污染程度；

步骤222：采用超微量分光光度计分别检测实验组和对照组的RNA的纯度；

步骤223：采用荧光计分别对实验组和对照组的RNA浓度进行定量；

步骤224：采用生物分析仪分别检测实验组和对照组的RNA的完整性。

采用上述技术方案，相比于现有技术，本发明提供的肺癌细胞辐射适应性MicroRNA表达谱检测方法，设置实验组和对照组，其中，对于实验组依次采用低剂量、高剂量的射线辐照目标肺癌细胞至细胞消化；对于对照组采用高剂量的射线辐照目标肺癌细胞至细胞消化；然后对实验组和对照组进行总RNA提取；再进行miRNA芯片处理，得出不同剂量辐照后的肺癌细胞MicroRNA表达谱的差异数据；可用于治疗前预判对细胞进行x射线放射治疗的有效性，判断在治疗过程中个体对x射线放射适应性变化，从而能够及时调整治疗方案，改善和指导临床肿瘤放射治疗，增强个体辐射的适应性能力，对于增进治疗效果具有重要的实用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是差异表达miRNA聚类分析热图；

图2是qRT–PCR验证miRNA的表达水平图；

图3是低剂量X射线辐射后A549细胞DNA损伤情况图；

图4是流式检测X射线照射24小时后A549细胞凋亡率示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请的目的在于，提供一种肺癌细胞辐射适应性MicroRNA表达谱检测方法。该检测方法的研究，对于低剂量辐射以及高剂量对于肺癌细胞的辐射适应性研究有重要技术价值，它可以作为研究肺癌细胞(甚至是普通细胞)放疗技术应用的重要研究资料。需要说明的是，本实施例中的目标肺癌细胞为人肺癌细胞A549，即A549细胞。

本申请实施例提供的肺癌细胞辐射适应性MicroRNA表达谱检测方法，包括如下步骤：

步骤100.标本选择

选择目标肺癌细胞系，采用10％FBS，1％青链霉素的培养基，37℃，5％CO

将目标肺癌细胞分为实验组和对照组；

其中，对于实验组的目标肺癌细胞，以两个实验组为例：

采用X射线按照50mGy的辐照剂量照射第一个实验组的目标肺癌细胞细胞；采用X射线按照200mGy的辐照剂量照射第二个实验组的目标肺癌细胞细胞；

照射4小时后对两个实验组分别采用20Gy的辐照剂量照射目标肺癌细胞至细胞消化后，采用冰箱-80℃低温保存。

对于对照组的目标肺癌细胞，采用高剂量的射线辐照目标肺癌细胞至细胞消化；具体的，采用20Gy的辐照剂量照射对照组的目标肺癌细胞至细胞消化后，-80℃低温保存。

将上述细胞消化后的实验组和对照组进行低温保存。

步骤200.总RNA提取

加入RNA提取试剂至实验组和对照组中的目标肺癌细胞系中，使目标肺癌细胞裂解，对细胞裂解液进行离心、吸取上清，振荡操作后得到水溶解沉淀物；

具体的，对总RNA提取包括以下步骤：

步骤201：在实验组和对照组中的目标肺癌细胞中，分别加入1mL的RNA提取试剂(Trizonl)，反复吹打细胞数次，使目标肺癌细胞裂解，分别收集相对应的细胞裂解液至实验组和对照组的离心管中；

步骤202：在实验组和对照组的离心管中分别加入800μl的氯仿，振荡，1600g，离心10分钟；

步骤203：吸取上清，加入2.4ml(0.6倍体积)的异丙醇，上下转动离心管，强烈混匀；

步骤204：将离心管置于-72℃冰箱冷藏1h；

步骤205：取出离心管1600g离心20分钟，弃去上清，在管底形成有白色沉淀，加入75％乙醇4ml并振荡，1600g离心20分钟；

步骤206：弃去上清，倒立离心管于吸水纸上，室温下晾干后，加入经200μl经DEPC(即diethypyrocarbonate，中文名为焦碳酸二乙酯)处理的水溶解沉淀。

步骤220.总RNA样本质量检测：

步骤221：琼脂糖凝胶电泳分别分析实验组和对照组的RNA降解程度以及污染程度；

步骤222：采用超微量分光光度计(Nanodrop)分别检测实验组和对照组的RNA的纯度(OD260/280比值)；

步骤223：采用荧光计(Qubit)分别对实验组和对照组的RNA浓度进行定量；

步骤224：采用生物分析仪(Agilent 2100)分别检测实验组和对照组的RNA的完整性。

步骤300.miRNA芯片处理

分别取一定量的实验组和对照组的总RNA，进行芯片杂交，杂交后的芯片进行图像扫描及数据分析，采用聚类分析方法分析不同剂量辐照后肺癌细胞MicroRNA表达谱的差异，得出差异数据。采用美国LC公司的mParaflo

具体的，miRNA芯片处理的步骤包括：

步骤301：以辐照条件为50mGy-20Gy、200mGy-20Gy的目标肺癌细胞为实验组，以辐照条件20Gy的目标肺癌细胞为对照组，分别取10μg的总RNA，采用微流体芯片进行芯片杂交，杂交后的芯片用微阵列基因芯片扫描仪(Genepix 4000B)进行图像扫描，采用生物芯片扫描分析软件(Genepix Pro6.0)进行数据分析，计算两种荧光信号的比值，用t-test进行差异显著性分析，P<0.05为有显著性差异；

其中，采用聚类分析方法分析不同剂量辐照后肺癌细胞MicroRNA表达谱的差异(参照图1)；

步骤302：筛选出50mGy-20Gy和200mGy-20Gy的实验组与20Gy照射剂量的对照组相比较，存在有16个表达有共同显著差异趋势的microRNA，得出表达有共同显著差异趋势的microRNA的差异数据。

表一：50mGy-20Gy辐照实验组与20Gy辐照对照组表达差异miRNA。

其中，上述表一中；LDR1_H及HDR分别为50mGy-20Gy及20Gy照射剂量组。

表二：200mGy-20Gy辐照组与20Gy辐照组表达差异miRNA。

其中，上述表二中；LDR2_H及HDR分别为200mGy-20Gy及20Gy照射剂量组。

步骤400.针对实验组和对照组，采用qRT-PCR实验方法对表达有共同显著差异趋势的microRNA进行验证。

具体的，qRT-PCR实验方法进行验证的步骤包括：

步骤401：逆转录合成cDNA

采用上海生工miRNA第一链cDNA合成(茎环法)进行cDNA合成；

取5ug无DNA的总RNA(步骤220中验证合格的RNA样本)。在冰浴的离心管中加入如下反应混合物：

轻轻混匀后并离心3-5s；

反应混合物16℃温浴30min；

37℃温浴30min；

85℃加热5min使逆转录酶失活；

4℃或-20℃保存。

步骤402：Real-time PCR反应

用上海生工miRNA荧光定量PCR试剂法(SYBR Green I染料法)，详细步骤如下：

配置反应体系：

PCR反应程序，用ABI Prism7500 fast扩增仪进行扩增，采用两步法扩增，反应程序如下：

预变性：95℃，30s，1cycle；

扩增(退火/延伸)：95℃，5s，60℃，30s，40cycles；

溶解曲线分析(PCR反应特异性质控)：95℃，15s，60℃，25s，95℃，15s。

步骤403.结果分析

使用SDS1.2软件计算Ct值，每个样本重复3次。

分析方法：实验组△Ct＝Ct(target)-Ct(U6),对照组△Ct＝Ct(target)-Ct(U6)，△△Ct＝实验组△Ct-对照组△Ct；相对表达量＝2

其中，实验组为50mGy-20Gy及200mGy-20Gy试验样品，对照组为20Gy对照组；U6为内参基因；

Real-time PCR结果显示，有10种miRNA在50mGy及200mGy两个低剂量辐射后表达趋势一致，与对照组相比，均表达上调。如下表三及图2所示。

表三:50mGy及200mGy两个低剂量辐射后表达趋势一致的miRNA

本申请实施例中，所述步骤400还包括：

1.用低剂量(50mGy和200mGy)的X射线照射两个实验组的目标肺癌细胞后，再用20Gy剂量进行照射；对照组的目标肺癌细胞采用20Gy的X射线照射后，检测不同剂量照射后细胞DNA损伤情况。参照图3，结果发现低剂量辐射增加了目标肺癌细胞对20Gy辐射剂量的适应性能力。

2.用低剂量(50mGy和200mGy)的X射线照射两个实验组的目标肺癌细胞后，再用20Gy剂量进行照射；对照组的目标肺癌细胞采用20Gy的X射线照射后，检测不同剂量照射后细胞凋亡情况。参照图4，结果发现低剂量辐射增加了目标肺癌细胞对20Gy辐射剂量的适应性能力。

以上实验表明，上述10种miRNA的表达量的变化可以检测目标肺癌细胞对x射线放射适应性。

本申请实施例中目标肺癌细胞分别用50mGy、200mGy初始剂量进行照射，间隔4小时再进行20Gy的效应剂量进行照射，培养24小时后基因芯片检测不同辐照组miRNA表达水平，芯片结果显示，与20Gy照射组相比，50mGy-20Gy及200mGy-20Gy组共同差异表达趋势miRNA有1个(miR-3662)上调，15个(hsa-miR-185-3p，miR-1908-5p，miR-1307-5p，miR-182-3p，miR-92a-3p，miR-582-5p，miR-501-3p，miR-138-5P，miR-1260b，miR484，miR378d，miR193b，miR-127-3p，miR-1303及miR-654-5p)下调。并用qRT-PCR实验方法对部分差异表达miRNA进行验证，发现miRNA表达变化趋势与芯片测序结果一致。并分别检测细胞DNA损伤情况及细胞凋亡，结果表明A549细胞分别用50mGy、200mGy初始剂量后，再接受大剂量照射，细胞DNA损伤较少且细胞凋亡比例减少，说明经低剂量辐射能诱导A549细胞适应性反应。

本申请实施例提供的肺癌细胞辐射适应性MicroRNA表达谱检测方法，可用于治疗前预判对细胞进行x射线放射治疗的有效性，同时用于判断在治疗过程中个体对x射线放射适应性变化，从而能够及时调整治疗方案，增强个体辐射的适应性能力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。