一种应用溶菌酶制备发酵型罗汉果酒的方法
文献发布时间：2023-06-19 09:30:39
技术领域
本发明涉及一种应用溶菌酶制备发酵型罗汉果酒的方法，属于食品工程领域。
背景技术
罗汉果是葫芦科罗汉果属多年生藤本植物的果实，别名光果木鳖、拉汗果、假苦瓜、裸龟巴等。罗汉果有祛痰镇咳、抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂、保肝、抗癌、增强免疫力、润肠通便的功效，被人们誉为“神仙果”。其主要有效成分为罗汉果甜苷，较蔗糖甜300倍，而热量与相同甜度的蔗糖相比，仅为蔗糖的1/50。此外罗汉果中还富含果糖、葡萄糖、黄酮苷、甘露醇、V
在果酒发酵的过程中，杀菌剂被广泛使用，因为在果实榨汁时经常会不可避免地感染一些对发酵有害的醋酸菌、乳酸杆菌等杂菌，这些杂菌会导致果酒发酵不能正常进行。传统果酒酿造中通常采用二氧化硫对果浆进行杀菌，例如专利CN109181989A公开了一种脐橙果酒的制备方法，发酵时果汁中加入的二氧化硫的量为180～220mg/kg。专利CN106701417A公开了一种猕猴桃酒的制备方法，发酵液初始二氧化硫浓度为30mg/kg。二氧化硫作为杀菌剂能够抑制杂菌的生长、繁殖与代谢，促进果酒的顺利发酵，但其具有刺激性的“硫味”和“灼烧”感并且具有一定的毒性，近年来研究表明，二氧化硫使用过量不仅影响果酒的品质而且会刺激人体消化道黏膜，长期摄入还会对肝脏和肾脏造成损害。国家对果酒中亚硫酸盐的含量有明确的规定，因此找到一种可以应用于果酒酿造过程的无毒杀菌剂迫在眉睫。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种专一作用于微生物细胞壁的碱性酶，可分解革兰阳性菌、溶壁微球菌、黄色八叠球菌、巨大芽孢杆菌等。溶菌酶作为防腐、杀菌剂应用于食品和医药品的制备中早有先例，例如CN105231408A公开了一种溶菌酶酱油的制备方法，将溶菌酶应用于酱油的防腐保鲜，延长了酱油的货架期。CN106577989A公开了一种用于肉制品的复配天然防腐剂的制备方法。CN1338214A描述了溶菌酶在奶制品中的应用，含有溶菌酶的奶制品具有很好的免疫功能，可以增强婴幼儿的免疫，抗病能力。溶菌酶是人体中一种重要的免疫因子，是一种天然无毒、绿色、安全的防腐杀菌剂。但温度、pH值、化学性质，以及络合作用都会对溶菌酶的酶活有所影响，而且还存在成本较高的问题。
发明内容
[技术问题]
现有的罗汉果酒制备工艺是采用酒精浸泡罗汉果而后调配，缺少发酵型罗汉果酒。且现有的其他果酒发酵工艺中，采用二氧化硫作为杀菌剂，二氧化硫的过量应用导致了果酒口感不佳及健康问题。
[技术方案]
本发明提供了一种制备发酵型罗汉果酒的方法，是以罗汉果浆为原料，用葡萄酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵酿制而成，发酵过程添加溶菌酶作为杀菌剂，所得饮品中酒精含量为3.8％-7.6％(20℃)，残糖含量为4-7g/L(以还原糖计)，总酸含量为3.0-5.5g/L(以酒石酸计)，pH值为5.0-5.5。
所述制备发酵型罗汉果酒的方法，包括以下步骤：
1)获得浓缩果浆
将罗汉果肉渣打浆制得果浆原料，过滤，控制滤液的固含量控制为20％-25％，得到罗汉果浓缩果浆；
2)预处理发酵原料
用水调整步骤(1)所得的罗汉果浓缩果浆，使得糖度75-140g/L、pH 5.0-6.0、固含量10-15％，然后进行灭菌处理；依据想要制备的果酒的酒精度数，来选择糖度、pH、固含量；
3)发酵：先向步骤(2)灭菌后的罗汉果果浆中加入溶菌酶对罗汉果果浆进行酶解处理，得到果汁，然后加入葡萄酒酵母，于20-26℃发酵至残糖(以还原糖计)低于7g/L；
4)将步骤(3)所得的酒液冷藏，然后过滤除菌。
可选的，步骤1)的罗汉果肉渣是罗汉果被提取罗汉果甜苷后的萃余物。
可选的，步骤2)的灭菌采用高温瞬时灭菌。
可选的，步骤3)所述溶菌酶加入量为705U/g。
可选的，步骤3)加入溶菌酶后，是于25℃保温72h以便进行酶解反应。
可选的，步骤3)所述葡萄酒酵母是红葡萄酒酵母或者白葡萄酒酵母。
可选的，步骤3)所述葡萄酒酵母加入量为溶菌酶酶解得到的果汁质量的0.3％-1％。
可选的，步骤3)所述葡萄酒酵母在加入到果汁中之前，进行了活化。可选的，在35℃水中活化25-35分钟。
可选的，步骤4)冷藏温度为4-10℃，冷藏时间为3-5天。
[有益效果]
本发明的生产工艺简单，将罗汉果肉渣打浆、过滤、加酶、加菌进行发酵即可，发酵周期短，发酵2-5天、酵后冷藏3-5天即可。
本发明的发酵过程使用了溶菌酶，避免了发酵过程其他杂菌对发酵果酒的影响，保证了发酵过程顺利进行，提高了罗汉果酒的口感。使用溶菌酶，可以避免添加二氧化硫，既保留了罗汉果风味，又保证了罗汉果酒安全健康的优点。同时，溶菌酶还可以代替纤维素酶将果浆中的纤维素分解为可发酵使用的葡萄糖，可以更好地利用原料中的纤维素，降低了成本的同时提高了发酵的效率。
本发明所酿造的果酒酒体呈茶红色，口感柔和，酸甜适中，无苦涩味，有后甜味，具有典型的罗汉果风味和香味。
附图说明
图1含溶菌酶的发酵型罗汉果酒感官评价雷达图
具体实施方式
分析方法：
酒精度：高效液相色谱法。分析条件：Sugar-Par-1钙型阳离子柱色谱柱(6.5mm×300mm)；流动相为超纯水，流速0.5mL/min；RID检测器；进样量10μL。
还原糖含量：3，5-二硝基水杨酸法。
固含量：恒重法。
总酸度：酸碱滴定法。
pH值：采用pH计测定。
菌落总数：参考GB 4789.2中菌落总数的测定方法。
溶菌酶的酶活定义及酶活测定方法：定义在规定条件下(25℃，pH 6.2)于450nm处每分钟使吸光度值降低0.001为1个酶活力单位(1U)。酶的比活力单位为U/g。
溶菌酶酶活的测定方法为：分光光度计测定法，在450nm处，把一定量溶壁微球菌粉(自上海源叶生物科技有限公司)溶解于一定量的磷酸盐缓冲液(pH 6.2)中，使吸光度值在1.3左右得到底物溶液，用1cm比色皿装2.5mL底物溶液并于25℃水浴中保温，加入0.5mL酶液(称取5mg溶菌酶溶于1mL浓度为0.1mol/L的、pH＝6.23的磷酸盐缓冲液中，定容至10mL，然后，稀释150倍备用)开始计时，记下反应lmin时的读数Al以及反应2min时的读数A2，用公式计算出酶活力。
发酵型罗汉果酒的感官评定：用GB/T15038-2006中3.2部分的感官检验方法准备样品和评测。评测方法和分值安排见表1，总分50。男女各6人，分别对样品进行打分。每个样品评定3次并打分，每项取其3次分值的算术平均值。各项指标的分值取所有人对相应指标所打分值的算术平均值。
表1感官评定表
实施例1：利用红葡萄酒酵母最佳发酵制备果香型果酒
(1)浓缩果浆的获得
室温下，添加2.5倍于罗汉果肉渣(提取罗汉果甜苷后的萃余物)重量的水，打浆获得罗汉果果浆原料，经过20目筛过滤，得到罗汉果浓缩果浆(含果肉，固含量20％)。
(2)发酵的原料预处理
将步骤(1)所得的罗汉果浓缩果浆采用饮用水调整糖度指标调为85-95g/L(不同批次果实有差别，调整的糖度也有差别)、pH5.65、固含量11％，采用110℃、15s瞬时高温进行灭菌，冷却至室温备用。
(3)发酵
①发酵原料及溶菌酶接罐
等步骤(2)灭菌后的发酵原料的温度降至25℃时，加入705U/g溶菌酶(购自上海远慕生物科技有限公司)，搅拌，接入发酵罐，在发酵罐中酶解处理72h，得到果汁。
②酵母活化
将红葡萄酒酵母(葡萄酒·果酒专用酵母，RW型，购自安琪酵母股份有限公司，中国湖北)分散于35℃温水中(5g酵母粉，分散于95g无菌温水中)，得到5％的酵母，活化30分钟。
③接入酵母、发酵
以终浓度0.7％比例(0.7g酵母粉/99.3g果汁)将步骤②活化后的红葡萄酒酵母接入步骤①酶解处理得到的含溶菌酶的果汁(含果肉)中，通过外循环水浴控制发酵温度25℃，发酵到酒精度不再升高、残糖量(以还原糖计)接近于5.0g/L，发酵结束。发酵时间共计4天。
(4)冷藏、过滤除菌
将步骤(3)发酵所得的酒液，于4℃冷藏7天，趁冷过滤，所得酒体澄清透明。初过滤后的酒体采用硅藻土以及0.20μm生物膜过滤处理后灌装，得到发酵型果酒产品。
所得发酵型果酒产品的酒精含量为4.71％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为4.85g/L，酸度为4.3g/L，pH值：5.15；固含量：4.40％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，酒体协调柔和，酸甜适中，无苦涩味，有后甜味，具有典型浓郁的罗汉果风味和香味。饮品风味的感官评定结果见表4。
实施例2：通过红葡萄酒酵母制备浓郁型罗汉果酒
(1)浓缩果浆的获得
同实施例1步骤(1)
(2)发酵原料预处理
将步骤(1)所得的罗汉果浓缩果浆采用饮用水调整糖度指标调为95-105g/L(因不同批次果实有差别)、pH5.50、固含量12％，采用110℃、15s瞬时高温进行灭菌，冷却至室温备用。
(3)发酵
①发酵原料及溶菌酶接罐
等步骤(2)灭菌后的发酵原料的温度降至25℃时，加入705U/g溶菌酶(购自上海远慕生物科技有限公司)，搅拌，接入发酵罐，在发酵罐中酶解处理72h，得到果汁。
②酵母活化
将红葡萄酒酵母(葡萄酒·果酒专用酵母，RW型，购自安琪酵母股份有限公司，中国湖北)分散于35℃温水中(取5g酵母粉，分散于95g无菌温水中)，活化30分钟。
③接入酵母、发酵
以终浓度0.5％比例(0.5g酵母粉/99.5g果汁)将步骤②活化后的红葡萄酒酵母接入步骤①酶解处理得到的含溶菌酶的果汁(含果肉)中，通过外循环水浴控制发酵温度25℃，发酵到酒精度不再升高、残糖量(以还原糖计)接近于5.0g/L，发酵结束。发酵时间共计5天。
(4)冷藏、过滤除菌
将步骤(3)发酵所得的酒液，于4℃冷藏5天，趁冷过滤(离心或者板框过滤，得到澄清透明的果酒即可)，所得酒体澄清透明。初过滤后的酒体采用硅藻土以及0.20μm生物膜过滤处理后灌装，得到发酵型果酒产品。
所得发酵型果酒产品的酒精含量为5.01％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为4.68g/L，酸度为4.2g/L，pH值：5.26；固含量：4.36％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，酒体协调柔和，酸甜适中，无苦涩味，有后甜味，具有典型浓郁的罗汉果风味和香味。饮品风味的感官评定结果见表4。
对比例1发酵过程不杀菌
本对比例与实施例2的区别在于：步骤(3)①中发酵原料的温度降至25℃后不加入杀菌物质溶菌酶，接入活化的红葡萄酒酵母进行发酵。其它工艺参数与实施例2保持一致。
所得产品的酒精含量为4.93％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为4.85g/L，酸度为6.1g/L，pH值：5.07；固含量：4.47％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，有罗汉果的滋味和香味，口感偏酸，无苦涩味，有后甜味，饮品风味的感官评定结果见表4。
对比例2发酵过程采用二氧化硫杀菌
本对比例与实施例2的区别在于：步骤(3)①中发酵原料的温度降至25℃后加入了100mg/L的二氧化硫替换溶菌酶，接入活化的红葡萄酒酵母进行发酵。其它工艺参数保持一致。
所得产品的酒精含量为5.02％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为4.80g/L，酸度为4.7g/L，pH值：5.18；固含量：4.46％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，有罗汉果的滋味和香味，酸甜适中，口感偏苦涩，有后甜味，饮品风味的感官评定结果见表4。
实施例3：利用白葡萄酒酵母发酵制备清香型罗汉果酒
(1)浓缩果浆获得
同实施例1步骤(1)。
(2)发酵原料预处理
同实施例2步骤(2)。
(3)发酵
①发酵原料及溶菌酶接罐
同实施例2步骤(3)①。
②酵母活化
按5％比例(取5g酵母粉，分散于95g无菌温水中)将白葡萄酒酵母(葡萄酒·果酒专用酵母，SY型，购自安琪酵母股份有限公司，中国湖北)分散于35℃温水中，活化30分钟。
③接入酵母、发酵
以终浓度0.5％比例(0.5g酵母粉/99.5g果汁)将步骤②白葡萄酒酵母(SY型)接入步骤①酶解处理得到的含溶菌酶的果汁(含果肉)中，通过外循环水浴控制发酵温度25℃，发酵到酒精度无明显升高，残糖量(以还原糖计)接近于5.0g/L，发酵结束。发酵时间共计5天。
(4)冷藏、过滤除菌
同实施例1步骤(4)。
所得产品的酒精含量为4.93％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为4.75g/L，酸度为4.6g/L，pH值：5.24；固含量：4.42％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，清香怡人，口感偏酸，无苦涩味，回甘好，有罗汉果的滋味和香味，饮品风味的感官评定结果见表4。
对比例3发酵过程不杀菌
本对比例与实施例3的区别在于步骤(3)①中发酵原料的温度降至25℃后不加入杀菌物质溶菌酶，接入活化的白葡萄酒酵母进行发酵。其它工艺参数与实施例3保持一致。
所得产品的酒精含量为4.79％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为4.45g/L，酸度为6.8g/L，pH值：5.03；固含量：4.56％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，有罗汉果的滋味和香味，口感较酸，无苦涩味，有后甜味，饮品风味的感官评定结果见表4。
对比例4发酵过程采用二氧化硫杀菌
本对比例与实施例3的区别在于步骤(3)①中发酵原料的温度降至25℃后加入了100mg/L的二氧化硫替换溶菌酶，接入活化的白葡萄酒酵母进行发酵。其它工艺参数与实施例3保持一致。
所得产品的酒精含量为4.84％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为4.95g/L，酸度为4.1g/L，pH值：5.31；固含量：4.37％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，有罗汉果的滋味和香味，酸甜适中，口感偏苦涩，有后甜味，饮品风味的感官评定结果见表4。
实施例4：制备酒香浓郁型罗汉果酒
(1)浓缩果浆获得
室温下，添加2.2倍于罗汉果肉渣重量的水进行打浆处理获得罗汉果果浆原料，经过20目筛过滤，浓缩得到罗汉果浓缩果浆(固含量22％)。
(2)发酵原料预处理
将步骤(1)所得的罗汉果浓缩果浆采用饮用水调整发酵液糖度指标调为130-140g/L(因不同批次果实有差别)、pH5.48、固含量15％，采用110℃、15s瞬时高温进行灭菌，冷却至室温备用。
(3)发酵
④发酵原料及溶菌酶接罐
同实施例2步骤(3)①。
⑤酵母活化
按5％比例(5g酵母粉、95g无菌温水)将红葡萄酒酵母(葡萄酒·果酒专用酵母，RW型，购自安琪酵母股份有限公司，中国湖北)分散于35℃温水中，活化25分钟。
⑥接入酵母、发酵
以终浓度1％比例(1g酵母粉/99g果汁)将步骤②红葡萄酒酵母(RW型)接入步骤①酶解处理得到的含溶菌酶的果汁(含果肉)中，通过外循环水浴控制发酵温度25℃，到酒精度无明显升高，残糖量(以还原糖计)接近于7.0g/L，发酵结束。发酵时间共计5天。
(4)冷藏、过滤除菌
将步骤(3)所得的酒液，冷却至8℃，于8℃冷藏3天，趁冷过滤，酒体澄清透明。初过滤后的酒体采用硅藻土以及0.20μm生物膜过滤处理后灌装，得到发酵型果酒产品。
所得产品的酒精含量为6.54％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为6.84g/L，酸度为5.3g/L，pH值：5.16；固含量：5.69％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，酒味浓郁，口感偏甜，无苦涩味，回甘好，有罗汉果的滋味和香味，饮品风味的感官评定结果见表4。
实施例5：制备清香型罗汉果酒
(1)浓缩果浆获得
室温下，添加2.2倍重量水进行打浆处理获得罗汉果果浆原料，经过20目筛过滤，浓缩得到罗汉果浓缩果浆(固含量22％)。
(2)发酵原料预处理
将步骤(1)所得的罗汉果浓缩果浆采用饮用水调整发酵液糖度指标调为75-85g/L(因不同批次果实有差别)、pH5.57、固含量10％，采用110℃，15s瞬时高温进行灭菌，冷却至室温备用。
(3)发酵
①发酵原料及溶菌酶接罐
同实施例2步骤(3)①。
②酵母活化
按5％比例(5g酵母粉，95g无菌温水)将白葡萄酒酵母(葡萄酒·果酒专用酵母，SY型，购自安琪酵母股份有限公司，中国湖北)分散于35℃温水中，活化35分钟。
③接入酵母、发酵
以终浓度1％比例(1g酵母粉/99g果汁)将步骤②白葡萄酒酵母接入步骤①酶解处理得到的含溶菌酶的果汁(含果肉)中，通过外循环水浴控制发酵温度25℃，发酵到酒精度无明显升高，残糖量(以还原糖计)接近于5.0g/L，发酵结束。发酵时间共计3天。
(4)冷藏、过滤除菌
将步骤(3)所得的酒液，冷却至10℃，冷藏3天，趁冷过滤，酒体澄清透明。初过滤的酒体采用硅藻土以及0.2μm生物膜过滤处理后灌装。
所得产品的酒精含量为3.86％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为4.71g/L，酸度为3.2g/L，pH值：5.17；固含量：3.64％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，清香怡人，口感柔和，无苦涩味，淡淡的后甜味，有罗汉果的滋味和香味，饮品风味的感官评定结果见表4。
实施例6：制备果香型罗汉果酒
(1)浓缩果浆获得
室温下，添加1.8倍重量水进行打浆处理获得原料，经过20目筛过滤，浓缩得到罗汉果浓缩果浆(固含量25％)。
(2)发酵原料预处理
同实施例2步骤(2)。
(3)发酵
①发酵原料及溶菌酶接罐
同实施例2步骤(3)①。
②酵母活化
按5％比例(5g酵母粉，分散于95g无菌温水中，酵母质量浓度为5％)将白葡萄酒酵母(SY型，购自安琪酵母股份有限公司，中国湖北)分散于35℃温水中，活化25分钟。
③接入酵母、发酵
以终浓度0.3％(0.3g酵母粉/99.7g果汁)比例将步骤②白葡萄酒酵母(SY型)接入步骤①酶解处理得到的含溶菌酶的果汁(含果肉)中，通过外循环水浴控制发酵温度25℃，到酒精度无明显升高，残糖量(以还原糖计)接近于5.0g/L，结束发酵。发酵时间共5天。
(4)冷藏、过滤除菌
将步骤(3)所得的酒液，冷却至4℃，于4℃冷藏4天，趁冷过滤，酒体澄清透明。初过滤的酒体采用硅藻土以及0.2μm生物膜过滤处理后灌装，得到发酵型果酒产品。
所得产品的酒精含量为5.09％(V/V)，残糖含量(以还原糖计)为4.43g/L，酸度为4.1g/L，pH值：5.34；固含量：4.27％。详细理化指标见表2。所酿造的果酒酒体呈茶红色，果香味浓郁，淡淡的酒香味，酸甜适当，无苦涩味，有后甜味。饮品风味的感官评定结果见表4。
表2实施例1-6和对照例1-4所得罗汉果酒理化指标
由上述理化指标可以知道本发明实施例中所得果酒的酒精度范围为3.8％-7.6％，酸度范围为3.0-5.5g/L，所酿造的果酒呈茶红色，具备罗汉果的风味和香味，酸甜适当，适合日常饮用。实施例4与各实施例差异最大，主要是发酵液初始固含量引起的，固含量不同，糖含量不同，对理化指标影响较大。其它实施例之间的差异则是由于酵母种类和添加量等不同。而对比例1和3发酵所得果酒，口感较为酸涩，酸度为6-7g/L，对比例2和4，理化指标虽在实施例所追求的合理范围内，但杀菌剂SO
表3实施例1-6和对照例1-4在发酵过程中菌落总数的测定结果
注:“/”表示未检测,因实施例1和5发酵结束时间均小于5dd。菌落检测方法参考GB4789.2-2016中菌落总数的测定方法。
通过对发酵过程中菌落总数的测定结果可知，在发酵过程中采用溶菌酶杀菌能够达到和SO
表4实施例1-6和对照例1-4所得罗汉果酒感官评定结果
由评价结果可以得到本发明所酿造的罗汉果酒颜色悦目协调，透明清亮，口感柔和，酸甜适当，无苦涩味与异味，具有典型独特的罗汉果风味和香味。对比例1和对比例3不添加任何杀菌剂的果酒理化指标大部分与相应的实施例接近，但其酸度偏高，pH值低，从感官评定指标来看其口感也差，酸味强，可能因为未添加杀菌剂，导致发酵过程染杂菌，影响酵母发酵。对比例2和对比例4是采用添加二氧化硫作为杀菌剂，从其理化指标(表2)和感官评定(表4)的数据得知，二氧化硫的添加虽然减少了染菌的可能，但是二氧化硫在一定程度上也影响了酵母活性，且罗汉果酒苦涩味增加。实施例中加入溶菌酶不仅可以作为杀菌剂还可分解纤维素，使其转化为发酵所需的葡萄糖，使得原料中还原糖含量有所提高(每毫升果汁还原糖含量增加8-10mg)，对于发酵结果表现为相对于对比例发酵果酒的酒精度相对来说有所提高。
总的来说，溶菌酶的加入给酵母提供了优良的生长环境和应用物质，因此该方法发酵所得的果酒清香怡人，口感适宜，无有害物质，无论从口感和心理角度，都增加了饮者对其的喜欢程度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。