同时检测辣椒四种病毒的多重RT-PCR引物组及其方法

技术领域

本发明属于作物病毒检测技术领域，特别涉及一种同时检测辣椒四种病毒的多重RT-PCR引物组及其方法。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L.)是世界第三大蔬菜作物，也是我国种植面积和产值第一大蔬菜作物(郑井元等，2018)。在辣椒生产中，病害普遍成为阻碍椒农增收的主要障碍，病毒病是危害较大的病害之一(张竹青，2009)。病毒病常可导致辣椒减产30％～70％，且使其品质变劣，失去商品价值，成为影响辣椒产量和质量的主要因素之一。目前已知侵染辣椒的病毒不少于60种(Kenyon et al.，2014)，其中黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)等3大RNA病毒属中的病毒是中国辣椒生产中为害的主要病毒。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是Cucumovirus中的为害辣椒的主要病毒类型之一；辣椒脉斑驳病毒(Chilliveinal mottle virus，CHiVMV)和甜椒叶脉斑驳病毒(Pepper vein mottle virus，PVMV)是Potyvirus中为害辣椒的主要病毒类型；辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)是Tobamovirus中为害辣椒的主要病毒类型。随着全球气候环境变暖，全国各地辣椒病毒病有逐年加重的趋势，生产和育种中迫切需要准确、高效地鉴定病毒病的种类，以便为针对性地开展当地主要为害病毒的防治技术、抗病育种等工作提供指导。

传统的病毒检测和鉴定方法有生物学方法、电镜法、血清学法、反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-PCR，即RT-PCR)法等，生物学方法、电镜法、血清学法等检测方法均存在不足。首先，生物学方法耗时耗力、灵敏度差，不同病毒侵染后也常常表现出相似症状而影响鉴定的准确性。其次，电镜法需要昂贵的仪器，操作方法不易掌握，且对病毒属以下的分类不能判定。此外，血清学法容易出现假阴性或假阳性，且试剂盒的成本高。RT-PCR法具有灵敏度高、快速、特异性较强等其它检测方法所不能比拟的优点，已成为当前植物病毒病检测的首选方法。生产实际中往往是多种病毒复合侵染植株，可以通过多重RT-PCR法同时检测多种病毒，可在短时间内检测大量样本，大大提高了检测效率，也大幅降低了检测成本。目前，辣椒病毒单重RT-PCR检测研究较多，而多重RT-PCR研究仍然较少。虽然国内外对辣椒上的常见病毒开发出了一些多重检测方法，然而针对CMV，ChiVMV，PVMV，PMMoV四种病毒的多重RT-PCR检测技术没有报道过。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供一种高效的、同时检测辣椒中四种RNA病毒的四重RT-PCR检测引物及方法。针对国内发现的辣椒4种病毒，即黄瓜花叶病毒(CMV)、辣椒脉斑驳病毒(CHiVMV)、甜椒叶脉斑驳病毒(PVMV)和辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)，根据Genebank发布的这四种病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计引物，建立一个简单、高效、灵敏的四重RT-PCR检测技术体系以同时检测这四种病毒。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种同时检测辣椒四种病毒的多重RT-PCR引物组，引物对CMV-F和CMV-R为检测黄瓜花叶病毒(CMV)的引物，产物片段大小为682bp；引物对CHiVMV-F和CHiVMV-R为检测辣椒脉斑驳病毒(CHiVMV)的引物，片段大小为923bp；引物对PVMV-F和PVMV-R为检测甜椒叶脉斑驳病毒(PVMV)的引物，片段大小为823bp；引物对PMMoV-F和PMMoV-R为辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的引物，片段大小为990bp，具体如下：

CMV-F：GGTTCTGGAAAACACAGGTTCA，如SEQ ID NO.1所示；

CMV-R：GAGTCATGGACAAATCTGAATCAAC，如SEQ ID NO.2所示；

CHiVMV-F：ATAATTTGTCCCAACCACCTGA，如SEQ ID NO.3所示；

CHiVMV-R：CTCACAAGCATTAACACAGAGC，如SEQ ID NO.4所示；

PVMV-F：GGTGTGTAAATGATTTCGGC，如SEQ ID NO.5所示；

PVMV-R：GAAAAAGTGAGAGCCAGTTAG，如SEQ ID NO.6所示；

PMMoV-F：TCCGAGAAGTGCCGACAC，如SEQ ID NO.7所示；

PMMoV-R：TCAATTTGTCTGCCGCTGA，如SEQ ID NO.8所示。

包含上述引物组的试剂或试剂盒。

采用如上所述的引物组检测辣椒CMV、CHiVMV、PVMV及PMMoV四种病毒的多重RT-PCR检测方法，包括以下操作步骤：

(1)辣椒植株叶片RNA的提取：取田间带病毒症状的辣椒幼嫩叶片，液氮中保存，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA；

(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用如上所述的4对引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

(3)PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。

优选地，所述PCR的反应体系25.0μL，包括2×Taq PCR Mix反应液12.5μL、cDNA模板3.0μL、黄瓜花叶病毒正向引物和反向引物各0.3μL、辣椒脉斑驳病毒正向引物和反向引物各0.3μL、甜椒叶脉斑驳病毒正向引物和反向引物各0.3μL、辣椒轻斑驳病毒正向引物和反向引物各1.0μL、超纯水补至所需体积。

优选地，所述PCR的反应程序：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃2min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明用四重RT-PCR检测常见的4种辣椒病毒即黄瓜花叶病毒(CMV)、辣椒脉斑驳病毒(CHiVMV)、甜椒叶脉斑驳病毒(PVMV)和辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)，与目前单重RT-PCR和双重RT-PCR检测方法相比，用一次RT-PCR反应可检测4种病毒，检测的病毒种类增多，检测效率进一步提高，检测的成本显著降低。

附图说明

图1是本发明引物组同时检测辣椒四种病毒的多重RT-PCR及各病毒单重PCR产物电泳图。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。

实施例1

引物设计

根据Genebank发布的上述4种辣椒病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计了4对引物(见表1)，其中引物对CMV-F和CMV-R为检测黄瓜花叶病毒(CMV)的引物，产物片段大小为682bp；引物对CHiVMV-F和CHiVMV-R为检测辣椒脉斑驳病毒(CHiVMV)的引物，片段大小为923bp；引物对PVMV-F和PVMV-R为检测甜椒叶脉斑驳病毒(PVMV)的引物，片段大小为823bp；引物对PMMoV-F和PMMoV-R为辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的引物，片段大小为990bp。各引物对扩增的目的片段大小分别为682、923、823和990bp，片段之间能很清晰地分开，不会出现重叠，设计引物时排除了各对引物和其它几种病毒之间的错配以及各引物之间的互补。目的片段经克隆测序，均为各病毒的特异片段。

表1四重RT-PCR检测辣椒病毒的引物及其检测的病毒

采用同时检测辣椒四种病毒的多重RT-PCR引物组检测辣椒中CMV、CHiVMV、PVMV和PMMoV四种病毒的多重RT-PCR检测方法，具体操作步骤如下：

(1)辣椒植株叶片RNA的提取：取田间带病毒症状的辣椒幼嫩叶片，液氮中保存，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量和浓度，反转录为cDNA，反转录过程如下：

①配制反转录变性反应混合液(10.0μL)：Oligo dT Primer(50μM)1.0μL、dNTPMixture(10mM each)1.0μL、模板总RNA 1.0μg，用去RNase超纯水补至10.0μL；

②变性：65℃保温5min后，冰上迅速冷却；

③配制反转录反应液：向上述变性后的混合液(10.0μL)中分别加入5×反应缓冲液4.0μL、RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL、反转录酶(200U/μL)1.0μL，用去RNase超纯水补至20.0μL，缓慢混匀，配制成反转录反应液；

④反转录反应。反应条件为：42℃温浴1h；95℃5min；冰上冷却；

(2)以步骤(1)反转录后得到的cDNA为模板，用如上所述的4对引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

PCR反应体系25.0μL，包括2×Taq PCR Mix反应液12.5μL、cDNA模板3.0μL、黄瓜花叶病毒正向引物和反向引物各0.3μL、辣椒脉斑驳病毒正向引物和反向引物各0.3μL、甜椒叶脉斑驳病毒正向引物和反向引物各0.3μL、辣椒轻斑驳病毒正向引物和反向引物各1.0μL、超纯水补至所需体积；

PCR反应程序：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃2min；

(3)PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照(图1)，判断病毒感染情况。

图中1、2、3、4、5和6泳道分别是DNA Marker2000、本发明所指四种病毒(CMV、CHiVMV、PVMV和PMMoV)多重RT-PCR产物、ChiVMV单重RT-PCR产物、PVMV单重RT-PCR产物以及CMV单重RT-PCR产物。

从图1中可以看出，在本次检测过程中，同时检测出辣椒具有CMV、CHiVMV、PVMV和PMMoV四种病毒。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 同时检测辣椒四种病毒的多重RT-PCR引物组及其方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列（Artificial sequence）

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ggtgtgtaaa tgatttcggc 20

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