银杏叶提取物在制备抗顺铂诱导肾间质纤维化的药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及银杏叶提取物在制备抗顺铂诱导肾间质纤维化的药物中的应用。

背景技术

流行病学研究发现，全球终末期肾病发病率不断升高。肾间质纤维化是各种慢性肾病的共同阶段，最终可发展为终末期肾病；目前缺乏疗效确切的防治措施，只能通过透析等来维持。顺铂作为临床最常用化疗药物之一，也是肾损伤的主要药物之一；对于顺铂急性肾损害的防治，临床上多采用的水化疗法辅以利尿药和脱水剂，但轻度的顺铂肾损害病例仍常见，严重的病例也时有发生；顺铂急性肾损伤可发展为不同程度的肾间质纤维化。不少研究发现中医药在防治顺铂肾损害方面凸显其优势。

低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1,HIF-1α)是细胞应对缺氧等的关键转录调节因子，与顺铂肾毒性及慢性化的主要机制如缺血缺氧、炎症和氧化损伤密切相关。顺铂降低肾血流量，导致肾脏缺血缺氧和氧化损伤，而缺氧和氧化应激均可通过调节肾脏HIF-1α，影响肾损伤和间质纤维化的发生发展。另外，顺铂诱导肾小管上皮细胞转分化是肾间质纤维化的重要环节之一，在顺铂肾间质纤维化的发生发展中起重要作用。

银杏叶资源丰富，其提取物(EGB)所含黄酮类含量高、种类多，是很好的天然抗氧化剂。EGB具有多种药理作用，包括改善血液循环、抗缺氧、抗炎和抗氧化损伤等作用，与顺铂致肾缺血缺氧、炎症及氧化损伤等相对应，且具有抗肿瘤作用。多年来EGB在临床上用于防治中枢神经系统、心血管系统的疾病及糖尿病并发症等，效果显著。近年来报道EGB可减轻大鼠的缺氧肾损伤和降低其血清HIF-1α，以及可保护急性顺铂肾损伤，但EGB对顺铂肾间质纤维化的作用和机制未见研究。

发明内容

本发明的主要目的在于提供银杏叶提取物在制备抗顺铂诱导肾间质纤维化的药物中的应用，为银杏叶提取物提供了一种新的医药用途，为解决目前使用顺铂过程中引发肾间质纤维化的弊端带来了新的用药途径。

发明人通过研究银杏叶提取物(EGB)对顺铂肾间质纤维化的作用和机制发现，所述药物为抑制肾组织中HIF-1α表达水平的药物，能够降低肾组织HIF-1α的表达，保护顺铂诱导的肾功能和肾组织的损伤，抑制顺铂诱导的肾间质纤维化，降低肾组织纤维化相关蛋白α-SMA的表达水平。

发明人还发现，所述药物为抑制顺铂诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的药物，体现为可抑制人肾小管上皮细胞的波形蛋白的表达水平，促进该细胞的上皮型钙黏蛋白的表达水平；而且还能够用于提高人肾小管上皮细胞的活性，提高该细胞中的超氧化物歧化酶的活性，降低该细胞中的丙二醛和活性氧含量，与EGB的抗氧化作用有密切关系。

银杏叶提取物(EGB)及其制剂在国内外应用广泛，各国药典中多有EGB的质量标准，本申请所述的银杏叶提取物的规格优选为EGB761，尤其是其注射液(商品名为金纳多注射液)。本发明的银杏叶提取物用于抑制顺铂肾间质纤维化时，其注射剂药物可以采用静脉注射、腹腔注射等常用给药方式。

附图说明

图1为动物实验中各组大鼠的血清BUN、血清Scr和尿液NAG的比较。图中，Control为正常对照组，Cisplatin为顺铂模型组，Cisplatin+L-EGB、Cisplatin+M-EGB、Cisplatin+H-EGB分别为EGB低、中、高剂量组，以下图示相同。

图2为动物实验中各组大鼠肾组织的HE染色图。

图3为动物实验中各组大鼠肾组织的肾小管间质损伤指数比较。

图4为动物实验中各组大鼠肾组织的Masson染色图。

图5为动物实验中各组大鼠肾组织的肾小管间质相对面积比较。

图6为动物实验中各组大鼠肾组织的α-SMA免疫组化染色图。

图7为动物实验中各组大鼠肾组织的α-SMA表达水平比较。

图8为动物实验中各组大鼠肾组织的HIF-1α免疫组化染色图。

图9为动物实验中各组大鼠肾组织的HIF-1α表达水平比较。图1、3、5、7和9中，与顺铂模型组比较，

图10为体外实验中不同浓度EGB对HK-2细胞活性的影响；图中，与EGB的0浓度组比较，

图11为体外实验中各组HK-2细胞活性的比较。

图12为体外实验中各组HK-2细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性的比较。

图13为体外实验中各组HK-2细胞的丙二醛(MDA)含量的比较。

图14为体外实验中各组HK-2细胞的活性氧(ROS)荧光强度的比较。图11-14中，与顺铂组比较，

图15为体外实验中用蛋白免疫印迹法观察和比较各组HK-2细胞的上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)的表达水平。

图16为体外实验中用蛋白免疫印迹法观察和比较各组HK-2细胞的波形蛋白(Vimentin)的表达水平。图15、16中，与正常组比较，

图17为体外实验中HK-2细胞在顺铂作用前后的HIF-1α表达水平的比较；图中，与顺铂损伤HK-2组比较，

具体实施方式

本发明的实验例中，使用如下原料：

健康雄性SD大鼠，购自广西医科大学实验动物中心；

人肾小管上皮细胞株HK-2，购自武汉普诺赛生命科技有限公司；

银杏叶提取物注射液，购自德国威玛舒培博士药厂，批号IB122；

注射用顺铂(冻干型)，购自齐鲁制药有限公司，批号5040201DB。

实验例1：动物实验。

1)实验方法

1.1)实验造模

健康雄性SD大鼠分为正常对照组、顺铂模型组，以及EGB高、中、低剂量组，每组9只。精密称取计算量的注射用顺铂冻干粉末，加入相应体积的注射用生理盐水充分溶解，配制成0.5mg/mL顺铂溶液，现配现用。另外，精确量取银杏叶提取物注射液，加入注射用生理盐水进行稀释，配制成0.4375mg/mL、0.875mg/mL、1.75mg/mL浓度的EGB，现配现用。

正常对照组于实验第1d和第22至40d，每天1次腹腔注射等体积生理盐水。顺铂模型组于实验第1d单次腹腔注射顺铂5.0mg/kg，第22至40d每天1次腹腔注射等体积生理盐水。EGB低剂量组于实验第1d单次腹腔注射顺铂5.0mg/kg；第22至40d，每天1次腹腔注射EGB1.58mg/kg。EGB中剂量组于实验第1d单次腹腔注射顺铂5.0mg/kg，第22至40d，每天1次腹腔注射EGB 3.17mg/kg。EGB高剂量组于实验第1d单次腹腔注射顺铂5.0mg/kg；第22至40d，每天1次腹腔注射EGB 6.34mg/kg。

于实验第40d最后一次给药后12小时收集尿液、血液和肾组织标本，比较肾功能(血清BUN、Scr和尿液NAG)、肾组织损伤和纤维化情况、纤维化相关指标α-SMA，以及HIF-1α的表达。

1.2)检测指标与方法

①试剂盒法检测血清BUN(尿素氮)、Scr(血清肌酐)和尿液NAG(N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶)水平。结果如图1。

②肾组织HE染色，并进行肾小管间质损伤指数评分。结果如图2和图3。

③肾组织Masson染色，并分析染色照片获取肾小管间质相对面积。结果如图4和图5。

④免疫组化染色检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。结果如图6和图7。

⑤免疫组化染色检测肾组织低氧诱导因子1α(HIF-1α)。结果如图8和图9。

2)实验结果

用单剂量的顺铂诱导大鼠急性肾损伤，在急性肾损伤慢性化即出现肾间质纤维化后，用EGB干预，可改善顺铂肾间质纤维化。说明了EGB通过抑制HIF-1α而抑制急性顺铂肾损伤慢性化。具体分析为：

(1)EGB抑制顺铂肾间质纤维化，降低肾组织HIF-1α：图1-图7显示EGB能够保护顺铂诱导的肾功能和肾组织的损伤，抑制顺铂诱导的肾间质纤维化，降低肾组织纤维化相关蛋白α-SMA水平，说明EGB抑制顺铂肾间质纤维化。

(2)EGB降低HIF-1α：顺铂肾间质纤维化大鼠的肾组织HIF-1α表达显著升高(图8、9)；肾功能和肾组织损伤显著，Masson染色显示肾间质纤维化明显(图4、5)。EGB干预后，HIF-1α表达下降(图8、9)和改善肾功能和肾组织损伤(图2、3)，以及减轻肾间质纤维化(图4、5)等同时存在，说明EGB通过降低HIF-1α而抑制肾间质纤维化。

实验例2：体外实验，采用顺铂诱导HK-2转分化模型，给以EGB干预。

1)实验方法

精确称取含100μg顺铂的冻干粉，用完全培养基(含10％特级胎牛血清的MEM培养基)将其稀释为25μg/ml的顺铂母液，之后再用完全培养基稀释成所需要的浓度。精确量取银杏叶提取物注射液，用完全培养基稀释成浓度为3500μg/ml的原溶液，需要时再用完全培养基稀释成350μg/ml。

细胞培养和分组干预：取对数生长的HK-2细胞同步化培养24h后进行实验。细胞具体分组如下：

(A)正常组：细胞在不含药物的完全培养基中培养。

(B)顺铂组：细胞在含2μg/ml顺铂的完全培养基中培养。

(C)顺铂+EGB组：细胞在含2μg/ml顺铂、350μg/ml EGB的完全培养基中培养。

于药物干预培养48h后，分别收集各组细胞，比较细胞增殖活性、氧化应激指标、转分化指标等。具体为用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度EGB下的细胞活性(见图10)、不同细胞组的细胞活性(见图11)，用流式细胞术检测不同细胞组的ROS含量(见图14)，用ELISA检测不同细胞组的丙二醛(MDA)含量(见图13)和超氧化物歧化酶(SOD)活性(见图12)；以及用蛋白免疫印迹法观察和比较不同细胞组的上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)表达(见图15)、波形蛋白(Vimentin)表达(见图16)。

另外，采用siRNA技术沉默HIF-1α基因表达，并转染HK-2；细胞分为HK-2组(细胞在不含干预药物的完全培养基中培养)、空载体HK-2组(转染了空载体的HK-2在不含干预药物的完全培养基中培养)、顺铂损伤HK-2组(细胞在含顺铂的完全培养基中培养)、顺铂损伤siRNA-HIF-1α的HK-2组(转染siRNA-HIF-1α慢病毒的HK-2在含顺铂的完全培养基中培养)。用蛋白免疫印迹法比较HK-2在顺铂作用前后的HIF-1α产生情况(见图17)。

2)实验结果

(1)EGB对顺铂损伤HK-2的保护作用：我们研究EGB对HK-2的毒性作用，发现在700μg/ml及以下的浓度时EGB对HK-2活性无影响(图10)。另外，EGB对顺铂损伤HK-2具有保护作用，其中350μg/ml的浓度效果较好，可显著提高顺铂抑制的HK-2活性和HK-2的超氧化物歧化酶(SOD)，显著降低丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)(图11-图14)，说明EGB可降低顺铂对HK-2的损伤，可能与其抗氧化作用有关。

(2)EGB抑制顺铂诱导的HK-2转分化：EGB可降低顺铂诱导HK-2产生的波形蛋白(Vimentin)水平(图16)，升高顺铂抑制的上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)水平(图15)。

(3)顺铂诱导HK-2产生HIF-1α：从图17可见，顺铂使HK-2的HIF-1α显著升高，而siRNA-HIF-1α技术沉默HK-2的HIF-1α基因后，HK-2的HIF-1α表达下降。说明了EGB通过抑制HIF-1α能够减少顺铂对HK-2细胞影响，缓解顺铂诱导的肾间质纤维化。