一种用于检测人类伏立康唑敏感基因位点的试剂盒
文献发布时间：2023-06-19 09:40:06
技术领域
本发明涉及一种用于检测人类伏立康唑敏感基因位点的试剂盒，属于生物医药技术领域。
背景技术
药物基因组学研究表明，伏立康唑在人体内的代谢水平与细胞色素P450家族的CYP2C19等基因的多态性密切相关；相关基因的变异通常会造成该药物的代谢水平降低；比如，CYP2C19等位基因的变异中的慢代谢型(PM)类型人群中，伏立康唑用药时的血液浓度显著高于正常人群，更容易引发肝功能损伤，视觉异常等相关病变；因此，FDA呼吁药厂商在药物功效上澄清药物基因组学作用，并提示用药前检测CYP2C19等相关基因的重要性；因此，在使用该类药物之前，先检测相关基因的变异情况，对患者有重要的指导意义。
目前市场上伏立康唑代谢基因测定技术多采用荧光PCR等技术来进行的；检测通量较小，检测成本较高。
本发明旨在通过单碱基延伸的核酸质谱技术，对人类糖尿病用药敏感基因进行变异检查，从而为个体临床用药提供安全指导。
发明内容
针对上述存在的技术问题，本发明的目的是：提出了一种更加精确以及高效的用于人类伏立康唑用药敏感基因突变位点的核酸质谱检测试剂盒。
本发明的技术解决方案是这样实现的：一种用于检测人类伏立康唑敏感基因位点的试剂盒，包含CYP2C19-1引物组，CYP2C19-2引物组，CYP2C19-3引物组；其中，
CYP2C19-1引物组由正向引物CYP2C19F1，反向引物CYP2C19R1，以及单碱基延伸引物CYP2C19SP1组成；
CYP2C19-2引物组由正向引物CYP2C19F2，反向引物CYP2C19R2，以及单碱基延伸引物CYP2C19SP2组成；
CYP2C19-3引物组由正向引物CYP2C19F3，反向引物CYP2C19R3，以及单碱基延伸引物CYP2C19SP3组成；
该核酸质谱检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：
第一步，多重PCR反应：
引物组a，包括引物CYP2C19F1，CYP2C19R1，CYP2C19F2，CYP2C19R2，CYP2C19F3，CYP2C19R3；
PCR master Mix；
H20；
DNA模板；
第二步：单碱基延伸反应：
上述PCR反应液；
iPLEX延伸混液；
引物组b，包括引物CYP2C19SP1，CYP2C19SP2，CYP2C19SP3；
H2O。
优选的，所述正向引物CYP2C19F1、反向引物CYP2C19R1、单碱基延伸引物CYP2C19SP1，依次包括如：SEQ ID Nos：7，SEQ ID Nos：8，SEQ ID Nos：77所示的序列。
优选的，所述正向引物CYP2C19F2、反向引物CYP2C19R2、单碱基延伸引物CYP2C19SP2，依次包括如：SEQ ID Nos：9，SEQ ID Nos：70，SEQ ID Nos：79所示的序列。
优选的，所述正向引物CYP2C19F3、反向引物CYP2C19R3、单碱基延伸引物CYP2C19SP3，依次包括如：SEQ ID Nos：71，SEQ ID Nos：72，SEQ ID Nos：81所示的序列。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明以人类伏立康唑用药敏感基因突变位点为检测对象，通过特异性引物的组合以及核酸质谱检测技术，能实现准确，简单，快速的检测人类伏立康唑用药敏感基因突变位点，而且通量更高，成本更低。
附图说明
下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明：
附图1为本发明所述的单碱基延伸反应程序图；
附图2为第一个基因位点的核酸检测结果图谱；
附图3为第二个基因位点的核酸检测结果图谱；
附图4为第三个基因位点的核酸检测结果图谱。
具体实施方式
下面结合附图来说明本发明。
如附图1-4所示，本发明所述的一种用于检测人类伏立康唑敏感基因位点的试剂盒，包含CYP2C19-1引物组，CYP2C19-2引物组，CYP2C19-3引物组；其中，
CYP2C19-1引物组由正向引物CYP2C19F1，反向引物CYP2C19R1，以及单碱基延伸引物CYP2C19SP1组成；依次包括如：SEQ ID Nos：7，SEQ ID Nos：8，SEQ ID Nos：77所示的序列；
CYP2C19-2引物组由正向引物CYP2C19F2，反向引物CYP2C19R2，以及单碱基延伸引物CYP2C19SP2组成；依次包括如：SEQ ID Nos：9，SEQ ID Nos：10，SEQ ID Nos：79所示的序列；
CYP2C19-3引物组由正向引物CYP2C19F3，反向引物CYP2C19R3，以及单碱基延伸引物CYP2C19SP3组成；依次包括如：SEQ ID Nos：11，SEQ ID Nos：12，SEQ ID Nos：81所示的序列；
该核酸质谱检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：
第一步，多重PCR反应：
引物组a，包括引物CYP2C19F1，CYP2C19R1，CYP2C19F2，CYP2C19R2，CYP2C19F3，CYP2C19R3；
PCR master Mix；
H20；
DNA模板；
该多重PCR反应的反应条件为：95℃ 2分钟，95℃ 30秒，56℃20秒，72℃ 60秒，45循环，72℃ 5分钟，4℃保存。
第二步：单碱基延伸反应：
上述PCR反应液；
iPLEX延伸混液；
引物组b，包括引物CYP2C19SP1，CYP2C19SP2，CYP2C19SP3；
H2O；
该延伸反应的反应条件为：
94℃ 30秒，94℃ 5秒，52℃ 5秒，80℃ 5秒，（第三和四步）5循环，（第2，3，4步）40循环，72℃ 3分钟，4℃保存。
上述各引物具体序列如下表所示：
实施例1
本实施例以人类伏立康唑用药敏感基因突变基因位点CYP2C19-1，CYP2C19-2，CYP2C19-3为检测对象，通过特异性引物组合，以及核酸质谱技术，从而实现准确，简单，快速的同时检测CYP2C19-1，CYP2C19-2，CYP2C19-3三个基因位点。
实验的基因模板为：30野生型血液样本和5变异型血液样本，同时检测，最终以阴性和阳性的正确率为标准。
第一步，多重PCR反应：
引物组a mix （包括引物CYP2C19F1，CYP2C19R1，CYP2C19F2，CYP2C19R2，CYP2C19F3，CYP2C19R3） 1ul
PCR master Mix 1.2ul
H2O 0.8ul
DNA模板 2ul
该多重PCR反应的反应条件为：95℃ 2分钟，95℃ 30秒，56℃20秒，72℃ 60秒，45循环，72℃ 5分钟，4℃保存。
第二步：单碱基延伸反应：
上述PCR反应液 5ul
iPLEX延伸混液 2ul
引物组b（包括引物CYP2C19SP1，CYP2C19SP2，CYP2C19SP3） 1ul
H2O 1ul
该延伸反应的反应条件为：
94℃ 30秒，94℃ 5秒，52℃ 5秒，，80℃ 5秒，（第三和四步）5循环，（第2，3，4步）40循环，72℃ 3分钟，4℃保存。
实施例2
本实施例以人类伏立康唑用药敏感基因突变基因位点CYP2C19-1，CYP2C19-2，CYP2C19-3为检测对象，通过特异性引物组合，以及核酸质谱技术，从而实现准确，简单，快速的同时检测CYP2C19-1，CYP2C19-2，CYP2C19-3三个基因位点。
实验的基因模板为：1野生型血液样本和1变异型血液样本，另外同时检测20个血液样本以及10唾液样本。
利用上述多重PCR检测人类伏立康唑用药敏感基因突变基因位点的方法包括一下步骤：
（1）样本处理和模板提取质控：
样本适用范围包括全血，唾液，口腔试纸等标本；提取过程请参照相关成品商业试剂盒说明书，本实验以磁珠提取为例：
将离心管中的样品10000 rpm 离心 2 min，去除上清液，留沉淀备用。
向上述离心管中加入350 μl Buffer MCL和20 μl Proteinase K，震荡混匀，65℃水浴20 min，间或混匀。
水浴完成之后向离心管中加入350 μl Buffer MA和25 μl SanMag Beads，振荡或者颠倒混匀，室温静置3 min，间或混匀。
将离心管置于磁力架上30 s，待SanMag Beads完全吸至管壁之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
向离心管中加入700 μl 70%乙醇，吸打或者点振混匀，将离心管置于磁力架上30s ，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
重复上一步一次，室温开盖干燥10 min至管内无液体残留。
向离心管中加入50 μl TE Buffer (pH8.0)，间或混匀。
取出离心管并置于磁力架上30 s，待SanMag Beads完全吸至管壁上之后，小心吸取上清至新的离心管，即获得基因组 DNA。
用qubit 3.0 测量样本浓度。
以浓度>3ng/ul为合格。
（2）用本发明的多重PCR检测试剂盒对步骤（1）所得的模板进行扩增，反应体系为：
第一步，多重PCR反应：
引物组a mix（包括引物CYP2C19F1，CYP2C19R1，CYP2C19F2，CYP2C19R2，CYP2C19F3，CYP2C19R3） 1ul
PCR master Mix 1.2ul
H2O 0.8ul
DNA模板 2ul
该多重PCR反应的反应条件为：95℃ 2分钟，95℃ 30秒，56℃20秒，72℃ 60秒，45循环，72℃ 5分钟，4℃保存。
第二步：单碱基延伸反应：
上述PCR反应液 5ul
iPLEX延伸混液 2ul
引物组b（包括引物CYP2C19SP1，CYP2C19SP2，CYP2C19SP3） 1ul
H2O 1ul
该延伸反应的反应条件为：
94℃ 30秒，94℃ 5秒，52℃ 5秒，，80℃ 5秒，（第三和四步）5循环，（第2，3，4步）40循环，72℃ 3分钟，4℃保存。
（3）检测：采用MASSARRAY IV 核酸质谱仪器对反应完毕的样本进行检测；质谱检测过程为：在样本板的每一个有样本的孔里加入41ul水然后离心；将96孔板放入质谱仪，打开点样程序，进行自动点样操作；打开飞行质谱软件，设置好参数，进行检测；检测介绍后，在软件中自动生成结果，导出即可。
准确性分析：30例子野生型样本和5变异型样本均成功检出，阳性检出率和阴性检出率均为100%；标明本发明的试剂盒检测方法准确性高。
重复性实验：每次实验，野生型样本和变异型样本均作为对照，重复20次，每次都能成功检出，说明重复性很好。
本发明可以同时检测人类伏立康唑用药敏感基因突变基因位点，可以在6个小时内检测96个样本，并且成本很低；具有快速，准确，成本低的优点。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
为康（苏州）基因科技有限公司
一种用于检测人类伏立康唑敏感基因位点的试剂盒
9
1
30
DNA
人工序列
1
ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTATC 30
2
30
DNA
人工序列
2
ACGTTGGATGTCCATCGATTCTTGGTGTTC 30
3
24
DNA
人工序列
3
GTCCACTATCATTGATTATTTCCC 24
4
30
DNA
人工序列
4
ACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCAG 30
5
30
DNA
人工序列
5
ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGCAC 30
6
16
DNA
人工序列
6
TTGGCCTTACCTGGAT 16
7
30
DNA
人工序列
7
ACGTTGGATGCAAATTTGTGTCTTCTGTTC 30
8
30
DNA
人工序列
8
ACGTTGGATGGGATTTGAGCTGAGGTCTTC 30
9
20
DNA
人工序列
9
TGTGTCTTCTGTTCTCAAAG 20。