多重基因荧光原位杂交的方法及其应用

技术领域

本发明涉及荧光原位杂交领域，具体而言，涉及一种多重基因荧光原位杂交的方法及其应用。

背景技术

染色体易位导致的基因融合，通常采用荧光原位杂交(FISH)的方法进行检测。荧光原位杂交(FISH)是20世纪80年代发展起来的一种分子生物学与细胞遗传学相结合的新技术，其原理是利用荧光标记的核酸探针与样本中核酸的互补区域进行杂交，通过荧光信号判读目标核酸区域是否存在以及定位。

基因易位突变的FISH检测，通常采用分离探针法。对于一个基因来说，需设计5’探针及3’探针。在正常染色体上，两个探针位置相邻；当发生基因易位时，5’探针及3’探针分离。这一检测方法，不需要事先知道基因易位的伙伴基因，因此具有较高的检出率。但面临需要对多个基因进行检测的情况时，往往需要做多个FISH，探针成本高，实验过程也费工费时。

为了能够同时检测多个基因，现有文献也有采用多种不同颜色荧光标记的探针。但由于滤光片的限制，常规实验室里的荧光显微镜FISH通常只能同时检测2种颜色的探针。无法满足需求。即使采用不同的滤光片，最多也只能在可见光范围内容纳4种颜色的探针，如果一个基因的5’及3’标记为不同颜色的荧光素，则只能同时检测两个基因。如果采用更多不同颜色的荧光素，则需要特殊的显微镜和算法，一般的实验条件难以实现。

综上所述，多个基因易位的检测面临特殊的挑战。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种多重基因荧光原位杂交的方法及其应用，以解决现有技术中的染色体易位的荧光原位杂交多重检测步骤复杂、成本高的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种多重基因荧光原位杂交的方法，该荧光原位杂交的方法包括：将针对多个待测基因的多个荧光探针混合，得到混合探针；将混合探针与待测样本进行荧光原位杂交，得到杂交后的样本；其中，多个待测基因的5’端的荧光探针的荧光标记相同，多个待测基因的3’端的荧光探针的荧光标记相同，且多个待测基因的5’端的荧光探针的荧光标记与多个待测基因的3’端的荧光探针的荧光标记不同。

进一步地，在将针对多个待测基因的多个荧光探针与待测样本进行荧光原位杂交之前，方法还包括：针对多个待测基因设计多个荧光探针的步骤。

进一步地，多个待测基因的5’端的荧光探针的荧光标和多个待测基因的3’端的荧光探针的荧光标记，两种荧光标记的发射光谱峰值的波长差大于二者发射光谱峰值半峰宽之和的80％；更优选地两种荧光标记选自如下任一组：a)罗丹明与FITC；b)FITC与Cy5；c)德克萨斯红(Texas Red)。

进一步地，在将多个待测基因的多个荧光探针进行混合时，混合的步骤包括：对每个待测基因的荧光探针的信号强度进行测试，并根据各待测基因的荧光探针的信号强度调整各荧光探针的混合浓度后再混合；优选地，混合探针中各荧光探针的信号强度一致。

进一步地，在得到混合探针后，以及在将混合探针与待测样本进行荧光原位杂交之前，荧光原位杂交方法进一步包括采用阴性样本和阳性样本，分别对混合探针的荧光原位杂交结果进行阴性荧光信号和阳性荧光信号的测试和验证；其中，阴性荧光信号的测试和验证包括：所有待测基因的5’端和3’端的荧光探针的荧光标记的信号都能检测到，和/或，每个待测基因的5’端的荧光探针的荧光标记的信号与每个待测基因的3’端的荧光探针的荧光标记的信号的位置至少部分重叠，或者距离小于等于一个信号点宽度；阳性荧光信号的测试和验证包括：检测至少有一个荧光探针的荧光标记的信号为单独的5’端或3’端的荧光探针的荧光标记的信号，和/或至少有一个荧光探针的荧光标记的5’端的信号与3’端的荧光探针的荧光标记的信号之间的距离大于1个信号点的宽度。

进一步地，在对阴性荧光信号和阳性荧光信号进行测试和验证的过程中，对于难以判定每个待测基因的5’端的荧光标记的信号与3’端的荧光探针的荧光标记的信号之间的距离是否大于一个信号点的宽度或是否小于等于一个信号点的宽度时，荧光原位杂交方法还包括：对混合探针所对应的多个待测基因进行逐一验证。

进一步地，在测试和验证阴性荧光信号和阳性荧光信号之后，荧光原位杂交方法进一步包括确定阳性判读阈值的步骤：优选地，利用混合探针对阴性样本中100个细胞中出现阳性荧光信号的细胞的个数进行统计，并计算出平均值和方差，并根据平均值和方差确定阳性判读阈值。

进一步地，阳性判读阈值为平均值+n倍方差，当待测样本的测定值大于平均值+n倍方差时，将待测样本判读为阳性样本，当待测样本的测定值小于平均值+nSD时，将待测样本判读为阴性样本，其中，2≤n≤4，更优选2≤n≤3。

进一步地，待测样本及待测样本对应的阴性样本和阳性样本为细胞学滴片样本或石蜡切片样本。

根据本申请的第二个方面，还提供了上述荧光原位杂交的方法在检测染色体易位突变中的应用，该应用包括检测植物或微生物中的染色体易位突变。

应用本发明的技术方案，本申请的荧光原位杂交方法，通过将多个待测基因均采用相同的荧光标记组合进行合并检测，仅涉及2种荧光素，不仅无需使用4-6种荧光素制备不同基因的探针，因此大大降低探针的成本；而且一次检测多个基因，大大简化了检测步骤。此外，该方法因仅采用两种荧光素，医学实验室常用的荧光显微镜均可进行观察，而无需特殊的滤光片或特种图像处理方法。进一步地，判读方法也简单，实验人员无需特殊的培训。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1A示出了本申请优选实施例中的待测样本的多个待测基因进行荧光原位杂交多重检测的探针设计示意图；其中，5’FISH探针均设计为一种荧光标记，在此采用FITC标记的荧光探针(显示绿色荧光，下同)，3’FISH探针均设计为另一种荧光标记，在此显示为罗丹明(Rhodamine)标记的荧光探针(显示红色荧光，下同)。

图1B示出了本申请优选实施例中探针信号的判断规则的示意图；Rhodamine标记的荧光探针(红色荧光)与FITC标记的荧光探针(绿色荧光)的相对位置分为相邻、可疑、分离三种模式。当红绿探针信号点相距超过一个信号点的直径，则判读为探针分离信号。

图1C示出了本申请优选实施例中阴性细胞和阳性细胞的示意图；当信号点均为“相邻”模式时，则判读为阴性细胞。当至少有一个信号为“分离”模式时，则判读为阳性细胞。如有可疑信号，需进行单基因逐一验证。

图2A和图2B示出了正常人白细胞滴片样本NTRK1,NTRK2，NTRK3三基因多重FISH检测结果，图2A显示的是阴性细胞学滴片样本的FISH整体结果；图2B是图2A的局部放大图，可见所有的绿色信号点与红色信号点重合或邻近，无探针分离的现象。

图3A至图3B示出了阴性甲状腺癌石蜡切片样本NTRK1,NTRK2，NTRK3三基因多重FISH检测结果图，其中，图3A是整体图，3B是图3A的局部放大。通过局部放大图(图3B)可见所有的绿色信号点与红色信号点重合或邻近，无探针分离的现象。

图4A和图4B显示的是阳性甲状腺癌石蜡切片样本NTRK1,NTRK2，NTRK3三基因多重FISH检测结果，其中图4A是整体图，图4B是图4A的局部放大；图4B标注了探针分离的信号点，其中实线椭圆标注的是Rhodamine标记的探针信号点的位置，虚线椭圆标注的是FITC标记的探针信号点的位置。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，现有技术中荧光原位杂交方法在进行多重检测时，存在步骤繁琐、时间长、成本高等问题，为改善这一现状，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种多重基因荧光原位杂交的方法，该荧光原位杂交的方法包括：将针对多个待测基因的多个荧光探针混合，得到混合探针；将混合探针与待测样本进行荧光原位杂交，得到杂交后切片；其中，多个待测基因的5’端的荧光探针的荧光标记相同，多个待测基因的3’端的荧光探针的荧光标记相同，且多个待测基因的5’端的荧光探针的荧光标记与多个待测基因的3’端的荧光探针的荧光标记不同。

本申请的荧光原位杂交方法，通过将多个待测基因均采用相同的荧光标记组合进行合并检测，仅涉及2种荧光素，不仅无需使用4-6种荧光素制备不同基因的探针，因此大大降低探针的成本；而且一次检测多个基因，大大简化了检测步骤。此外，该方法因仅采用两种荧光素，医学实验室常用的荧光显微镜均可进行观察，而无需特殊的滤光片或特种图像处理方法。进一步地，判读方法也简单，实验人员无需特殊的培训，只要观察到了两种颜色的信号点相邻，则判为阴性信号点；如果观察到了两种颜色的信号点分离，或仅有3’探针的信号点，则为阳性信号点。

需要说明的是，在将针对多个待测基因的多个荧光探针与待测样本进行荧光原位杂交之前，上述方法还包括：针对多个待测基因设计多个荧光探针的步骤。该步骤与现有技术所不同的是，现有技术中是对每个基因分别设计不同的颜色的荧光探针，或者采用特殊的滤光片进行检测，而本申请中仅是根据5’端和3’端荧光标记不同的需求，设计两种不同颜色的荧光标记即可。且多个基因的5’端和3’端探针都分别相同(比如，5’端都带绿色荧光标记，3’端都带红色荧光标记)。

至于5’端和3’端分别设置不同的荧光标记，可以根据不同的需求进行合理选择，只要确保两种荧光标记的波长可以区分即可。在一些实施例中，一个用FITC，另一个用Rhodamine。或者一个用FITC，另一个用Cy5。还可以是其他的荧光素组合，比如：FITC与德克萨斯红(Texas Red)等。

上述在将多个待测基因的多个荧光探针进行混合时，可以按照现有多重检测时的探针混合方式进行混合，也可以根据各探针的性能进行调整后再混合。在本申请一种优选的实施例中，该混合的步骤包括：对每个待测基因的荧光探针的信号强度进行测试，并根据各待测基因的荧光探针的信号强度调整各荧光探针的混合浓度后再混合；优选地，混合探针中各荧光探针的信号强度一致。

上述“信号强度一致”中的“一致”的涵义是指：其中一个探针单独进行检测时达到的信号强度(以X计))与剩余探针中的任一探针单独极检测时达到的信号强度(以Y计)相比，前者是后者的0.8～1.2倍(即X/Y为0.8～1.2)。

按照各基因探针的荧光信号一致时所需的浓度进行混合，使得对每个基因的每一端的检出几率相当，从而避免某个单一信号过强而容易被检出，另一个信号弱而难以被检出而导致检测结果出现偏差，即有助于提高各基因的检测出率和检测准确性。

在得到混合探针后，以及在将混合探针与待测样本进行荧光原位杂交之前，为了进一步确定探针的准确性，通常需要对混合后的探针的效果进行检测和确认，以避免混合后探针之间存在干扰而导致检测结果与预期存在偏差。

因而，在本申请一种优选的实施例中，在得到混合探针后，以及在将混合探针与待测样本进行荧光原位杂交之前，荧光原位杂交方法进一步包括：采用阴性样本和阳性样本分别对混合探针的荧光原位杂交结果进行阴性荧光信号和阳性荧光信号的测试和验证；其中，阴性荧光信号的测试和验证包括：所有待测基因的5’端和3’端的所述荧光探针的荧光标记的信号都能检测到(即不存在任意一个待测基因的单独的5’端或单独的3’端的荧光探针的荧光标记的信号的情况)，和/或，多个待测基因的5’端的荧光探针的荧光标记的信号与多个待测基因的3’端的荧光探针的荧光标记的信号的位置至少部分重叠，或者距离小于等于一个信号点的宽度；阳性荧光信号的测试和验证包括：检测至少有一个荧光探针的荧光标记的信号为单独的5’端或3’端的荧光探针的荧光标记的信号，和/或至少有一个荧光探针的荧光标记的5’端的荧光标记的信号与3’端的荧光探针的荧光标记的信号之间的距离大于一个信号点的宽度。

需要说明的是，上述优选实施例确定了阴性荧光信号和阳性荧光信号的明确的判定方式，但不排除仍存在介于两者之间的可疑情况(通常操作者通过肉眼观察，难以确定两种信号之间的距离是大于一个信号点宽度，还是小于等于一个信号点宽度)。若存在可疑情况，也可进行拍照，并对图像进行更为精确的测量。

在采用混合荧光探针确定阴性荧光信号和阳性荧光信号之后，为进一步提高检测判断的准确性，最好在进行检测之前，先通过检测阴性样本以确定判断的基准。因而，在一种优选的实施例中，在测试和验证阴性荧光信号和阳性荧光信号之后，该荧光原位杂交方法进一步包括确定阳性判读阈值的步骤。确定阳性判断阈值的具体操作可以根据需要合理设定。在本申请一种优选的实施例中，确定阳性判读阈值的步骤包括：利用混合探针对阴性样本中每100个细胞中出现阳性荧光信号的细胞的个数进行统计，并计算出平均值和方差，并根据平均值和方差确定阳性判读阈值。

需要说明的是，上述阳性判断阈值的确定方式并非唯一的，也可以采用统计学中判定异常值的方法。

在本申请一些优选的实施例中，以平均值+n倍方差的方式来确定阴性和阳性样本的判读，其中，上述阳性判读阈值为平均值+n倍方差，当待测样本的测定值大于平均值+n倍方差时，将待测样本判读为阳性样本，当待测样本的测定值小于平均值+nSD时，将待测样本判读为阴性样本，其中，2≤n≤4，可以是2.8、2.9、3.0、3.1、3.2或3.3中任意一个数值，更优选为2≤n≤3，进一步优选n为3。

本申请的荧光原位杂交方法，根据研究目的和方向的不同，可以选择不同的多个待测基因。比如，待测基因可以选自如下任意一组或多组：a.NTRK1、NTRK2及NTRK3；b.ALK和ROS1。需要说明的是，此处所列出的待测基因的组合，并非出于疾病诊断的目的，也并不针对某一类特定的基因或特定的疾病，而是基于方法学应用的实际场景和科研目的而进行的选择。

上述荧光原位杂交方法中，根据实际研究中，待测样本的种类的不同，对应的阴性样本和阳性样本的种类也相应不同。在本申请中，待测样本的种类可以是细胞学滴片样本，也可以是石蜡切片样本，基于两种类型的样本在制片过程中的不同，两种样本最好严格选择与各自类型相同的阴性样本和阳性样本，进行阳性阈值的判读。

在本申请第二种典型的实施例方式中，还提供了上述荧光原位杂交方法在检测染色体易位突变中的应用，该应用包括检测植物或微生物中的染色体易位突变，此外，也可用于检测可能与动物产量、营养、品质、口感等性状相关的基因的易位突变。

下面将结合具体的实施例进一步说明本申请的有益效果。需要说明的是，以下实施例仅是示例性说明，不应理解为是对本申请保护范围的限定。

图1A示出了以下实施例中的待测样本的多个待测基因进行荧光原位杂交多重检测的探针设计示意图。其中，5’FISH探针均设计为一种荧光标记，以下实施例中为FITC标记的荧光探针(显示绿色荧光)，3’FISH探针均设计为另一种荧光标记，以下实施例中为Rhodamine标记的荧光探针(显示红色荧光)。

图1B示出了以下实施例中探针信号的判断规则的示意图；FITC标记的荧光探针与Rhodamine标记的荧光探针的相对位置分为相邻、可疑、分离三种模式。当两种探针信号点相距超过一个信号点的直径，则判读为探针分离信号。

图1C示出了阴性细胞和阳性细胞的示意图；当信号点均为“相邻”模式时，则判读为阴性细胞。当至少有一个信号为“分离”模式时，则判读为阳性细胞。如有可疑信号，需进行单基因逐一验证。

需要说明的是，以下实施例按照图1A至图1C所示的原理进行探针设计及阴性细胞和阳性细胞的判断。

实施例1

在本实施例中，分别设计了NTRK1,2,3的探针，进行多重FISH的合并检测。

1.探针设计：如图1A所示的探针设计示意图。其中，5’FISH探针均设计为一种荧光标记，在此实施例中采用显示为绿色荧光的FITC标记的探针。3’FISH探针均设计为另一种荧光标记，在此实施例中采用显示为红色荧光的Rhodamine标记的探针。一共设计了NTRK1的5’绿色探针、NTRK1的3’红色探针、NTRK2的5’绿色探针、NTRK2的3’红色探针、NTRK3的5’绿色探针、NTRK3的3’红色探针，合计6个探针。

2.探针的单基因测试：采用正常人血液，制备白细胞滴片样本，对每一个基因探针分别进行验证。NTRK1的5’绿色探针和NTRK1的3’红色探针，在正常细胞中，应显示2个绿色信号点与2个红色信号点，一个绿色信号点与一个红色信号点临近或重合。NTRK2、NTRK3的探针也类似地进行验证。并在相同的FISH实验条件、显微镜拍摄条件下，采集信号。根据信号强度，调整各基因探针的浓度，使6种探针的FISH信号强度基本一致。

验证实验需采用正常人的细胞学样本。细胞滴片上的细胞核是完整的，因此正常人血液中的白细胞，每个探针均应检测出2个等位基因。

3.多基因探针的合并测试：将六种探针混合后，进行FISH实验测试。在正常人血液白细胞的滴片样本中，可观察到6个红色信号点，6个绿色信号点，并且每个红色信号点均与绿色信号点重合或邻近，没有单独的红色信号点。

4.阴阳性细胞判读：如图1C所示，阴性及阳性细胞示意图。当信号点均为“相邻”时，则判读为阴性细胞。当至少有一个信号为“分离”模式时，说明与其他基因发生了融合，则判读为阳性细胞。

对NTRK基因家族的生物学功能而言，如果是考虑到何种变异有可能激活其酪氨酸激酶结构域，则判读标准按以下规则调整：如果仅有红色信号点而临近无绿色信号点，也判为阳性细胞。因为酪氨酸激酶结构域在NTRK基因的3’端；如果NTRK的5’端缺失，而3’段仍然存在，即荧光信号为单独红色，则酪氨酸激酶结构域与前端的抑制性调控结构域分离，会导致酪氨酸激酶结构域的激活。因此判读为阳性。但是，如果红色缺失而只有绿色，则酪氨酸激酶结构域缺失了，不会导致酪氨酸激酶结构域的活性及对细胞增殖的刺激作用，因此仍判为阴性。

5.阴阳性病例判读：细胞学滴片样本、石蜡切片样本，分别进行基线研究并确定阈值。

1)细胞学滴片样本：选取10例正常人血液样本，制备白细胞滴片，并用三重探针进行荧光原位杂交。如图2A所示，图2A示出了正常人白细胞滴片样本NTRK1,2，3多重FISH检测结果为阴性细胞学滴片样本的FISH结果。通过局部放大图(图2B)可见所有的绿色信号点与红色信号点重合或邻近，无红绿探针分离的现象。

细胞学滴片样本与6个探针杂交后，计数100个细胞，并记录阳性细胞个数。计算正常人的阳性细胞占比(平均值±SD)。将(平均值+3xSD)作为阳性判读阈值。测定值≥(平均值+3xSD)，则判读为阳性样本。测定值<(平均值+3xSD)，则为阴性样本。如下表所示，实验得出的阴性细胞滴片样本的阈值为5.82％。实验中取6％为阈值。

表1：

2)石蜡切片样本基线研究:因为石蜡切片样本在制备过程中，一部分细胞核会被切开，如果刚好切在两个探针直接，则会出现单独绿色或红色的信号点。而细胞学滴片样本中，细胞核是完整的，因此细胞学滴片样本与石蜡切片样本的阈值不同，需要分别进行测试。

图3A示出了阴性甲状腺癌石蜡切片样本NTRK1,2，3多重FISH检测结果图，3B是图3A的局部放大。通过局部放大图(图3B)可见所有的绿色信号点与红色信号点重合或邻近，无红绿分离的现象。

石蜡切片样本与6个探针杂交后，计数100个细胞，并记录阳性细胞个数。计算正常人的阳性细胞占比(平均值±SD)。将(平均值+3xSD)作为阳性判读阈值。测定值≥(平均值+3xSD)，则判读为阳性样本。测定值<(平均值+3xSD)，则为阴性样本。如下表所示，实验得出的石蜡切片样本的阈值为13.8％。实验中取14％为阈值。

表2：

3)阳性石蜡切片样本检测:选取了已知NTRK1 FISH阳性样本进行了多重FISH的测试，实验结果见图4A和图4B。

图4A和图4B显示的是阳性甲状腺癌石蜡切片样本NTRK1,2，3多重FISH检测结果，其中图4A是整体图，图4B是图4A的局部放大，其标注了红绿分离的信号点。其中实线椭圆标注的是Rhodamine标记的探针信号点的位置，虚线椭圆标注的是FITC标记的探针信号点的位置。计数100个细胞，具有红绿分离的细胞为16，具有单独红色的细胞为22个，总的阳性细胞占比为38％，故此细胞判读为阳性。

从以上的描述中，可以看出，本申请上述的实施例以NTRK1,2,3为范例，通过改进FISH技术路线，设计成本低、准确度高、操作简便的基因易位的检测方法，亦可适用于其他易位基因(比如ALK、ROS1)，或者其他物种，比如微生物、植物，或者动物中与动物营养、产量及品质等性状相关的易位基因的联检。需要注意的是，有时出于对基因功能的考虑，阴阳性的判读亦可根据基因易位对基因功能产生的影响而调整规则。

本申请的荧光原位杂交方法，采用多重FISH合并检测技术，仅使用一片切片，一次实验即可检测多个基因。与传统方法相比，有如下优点(以NTRK1,2,3检测为例)：

1)省样本：传统FISH检测三个基因的易位变异需要三张切片，本申请仅需一张切片。

2)省试剂：传统FISH需要使用三种探针，分开做三个FISH检测，成本高。本申请仅需要一次实验的探针用量，成本是传统方法的1/3。

3)省人工：传统FISH需要使分开做三个FISH检测。本申请仅一次实验，节省人工.

4)试剂成本低：本申请的多次FISH合并检测技术，仅涉及2种荧光素，无需使用4-6种荧光素制备不同基因的探针，因此探针的成本低。

5)使用常规的荧光显微镜：因采用两种荧光素，医学实验室常用的荧光显微镜均可进行观察。无需特殊的滤光片或特种图像处理方法。

6)判读简单：判读方法与常规的FISH分离探针的判读方法一致，实验人员无需特殊的培训。只要观察到了两种颜色的信号点相邻，则判为阴性信号点；如果观察到了两种颜色的信号点分离，或仅有3’探针的信号点，则为阳性信号点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。