RAA荧光法检测油菜茎基溃疡病菌的探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种RAA荧光法检测油菜茎基溃疡病菌的探针、试剂盒及方法。

背景技术

油菜茎基溃疡病(phoma stem canker)是油菜上最严重的真菌病害之一,主要包括2个种：油菜黑胫病菌Leptosphaeria biglobosa和油菜茎基溃疡病菌L.maculans，这2种病原菌的形态特征相近，但引起油菜茎部感染和基部溃疡的能力不同。前者致病力较弱，一般引起茎中上部为害，造成的损失小，包括中国在内的一些油菜生产国均有分布。后者致病力强，引起茎基部发病，是导致油菜黑胫病严重流行和油菜产量损失的主要因素，在澳大利亚、加拿大、美国、欧洲等油菜主产国有分布，而在我国未见报道。

油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)是世界范围内广泛分布的一种严重危害油菜产业的病原菌。由于油菜茎基溃疡病菌具有极强的致病力该病原菌曾造成欧洲、美洲和澳洲油菜籽严重减产，一般年份，L.maculans造成的产量损失约10％～20％，发生严重时可达30％～50％甚至更高。据估计，全世界每年因L.maculans所造成油菜籽的经济损失超过3亿欧元。近年来我国食用油菜籽主要来源于从国外进口，而我国油菜产区气候与欧、美、澳三大洲相似，且中国目前的油菜主要栽培品种高度感病。因此加强检疫和监管是控制该病菌传入我国,是当前我国各口岸植物检疫部门的紧迫任务。由此亟需建立一种高效快速检测技术预防油菜茎基溃疡病传入我国。

油菜茎基溃疡病致病菌为小球腔菌属的油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeriamaculans属真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，格孢腔菌目(Pleosporales)，格孢腔菌科(Pleosporaceae)，小球腔菌属(Leptosphaeria)。它不仅侵染油菜，还危害白菜、甘蓝和芥菜等近30种十字花科植物，引起茎基溃疡、植株倒伏和死亡。我国十字花科作物种植面积巨大，其中油菜种植面积从2002年以来一直维持在667万hm

目前实验室检测油菜茎基溃疡病菌的技术主要包括分离培养法和分子生物学方法等。

1.分离培养法

方法如下：将疑似感病种子于无菌水中浸泡12h，-20℃冰箱过夜，用1％的次氯酸钠表面消毒5min，灭菌水洗3次，滤纸吸干后置于PDA培养基上，培养48h后开始观察，若菌落呈圆形，表面白色、平坦、边缘不规则且菌丝呈白色放射状，菌丝中可见结节状菌丝结，即可判断该菌为油菜茎基溃疡病菌。

2.分子生物学方法

2.1聚合酶链式反应法(PCR)

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)利用基因组DNA或者cDNA在95℃高温下发生变性由双链变成单链，60℃左右时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，72℃左右时DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。PCR检测方法以其快速、准确和灵敏的特点受到广泛应用。陈青等人利用该法检测到油菜茎基溃疡病菌。

2.2双启动寡核苷酸引物法(DPO法)

双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide，DPO)是一种新型PCR引物设计方法，其引物包含两个独立的区域，并利用寡聚次黄嘌呤进行连接，次黄嘌呤的氢键结合力弱，扩增过程中，若DPO引物的5′或3′端有3个以上碱基发生错配，引物就会与模板脱离，从而不能正常发生反应，这大大增强了引物的特异性，同时DPO引物自身及引物间难形成二级结构，并且对于退火温度不敏感，龙阳等人利用此技术建立一种快速检测油菜茎基溃疡病菌。

2.3实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，通过内参对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。SYBR Green实时荧光PCR技术已经用于油菜茎基溃疡病菌的定量检测。

2.4环介导等温扩增(LAMP)

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种快速核酸扩增方法是一种快速核酸扩增方法，该方法针对靶基因序列的6个不同区域设计4种特异性LAMP引物，利用一种链置换活性的Bst DNA聚合酶在等温条件(65℃左右)孵育30～60min，即可完成核酸扩增反应，周圆等人通过该技术检测油菜茎基溃疡病菌。

综上所述，传统方法如分离培养法周期较长，操作繁琐，较难满足当前快速通关的要求；采用PCR技术，具有快速、特异性强、灵敏度高的优点，是目前我国口岸筛检油菜茎基溃疡病菌的重要手段之一，但需昂贵仪器，装备精良的实验室和专业的操作人员。LAMP法不需要昂贵的PCR仪，等温灵敏、特异性强、操作简单且易于观察结果，但是LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，较难在基层实验室推广应用。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种油菜茎基溃疡病菌的RAA荧光检测方法、引物探针及试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

RAA荧光法检测油菜茎基溃疡病菌的探针，

所述探针为5’端序列/荧光报告基团//A THF//淬灭基团/3’端序列；其中：

所述5’端的核苷酸序列为：CTTAGAGGAGCTAGAGTCCTTATCTTCT；

所述3’端的核苷酸序列为：TAAGGAGCTCTAGGC；

所述THF为1个碱基位置；

所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种；

所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。

作为本发明的RAA荧光法检测油菜茎基溃疡病菌的探针的改进，所述探针的核苷酸序列为：CTTAGAGGAGCTAGAGTCCTTATCTTCTAATAAGGAGCTCTAGGC。

本发明还同时提供了一种油菜茎基溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒，该试剂盒包括如上所述的探针以及上游引物和下游引物；

上游引物为：

5’-CGCCTAGGTTGCCCTAACCTAGAATCTATAAG-3’；

下游引物为：

5’-CTRCTACTGCTGCTAAGCTTACGCGCAAGGC-3’。

作为本发明的油菜茎基溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒的改进，本发明对探针和引物在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述的探针使用时在反应体系中的终浓度为0.02～0.05mM，所述上游引物及下游引物使用时在反应体系中的终浓度为0.05～0.1mM。

作为本发明的油菜茎基溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒的进一步改进：所述试剂盒还包括试剂RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。

其中：所述的RAA基础荧光通用反应试剂是经过低温冷冻干燥的冻干粉，由江苏奇天基因生物科技有限公司提供；是商品货号为F08017的基础反应单元。本领域技术人员，也可以根据RAA荧光法检测方法的原理，选择其他能够作为RAA基础荧光通用反应试剂的产品作为替换。

作为本发明的油菜茎基溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒的进一步改进，反应缓冲液由以下试剂组成：在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述反应缓冲液中各组分的使用浓度为450mM的Tris-HCl Buffer(PH7.6)、260mM的MgAc和10％W/V(即，10g/100ml)的PEG 10000；余量为作为溶剂的水。

作为本发明的油菜茎基溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒的进一步改进，所述试剂盒还包括如下试剂：阴性质控品、阳性质控品和/或临界阳性质控品；

进一步，所述阳性质控品为含油菜茎基溃疡病菌的基因组DNA片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，阳性质控品的使用浓度为1.0×10

所述临界阳性质控品为含油菜茎基溃疡病菌的基因组DNA片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，临界阳性质控品的使用浓度为1.0×10

所述阴性质控品为不含有油菜茎基溃疡病菌的基因组片段的试剂(即，不含有油菜茎基溃疡病菌的基因组片段的DNA质粒)。

具体而言，本发明公开一种RAA荧光法检测油菜茎基溃疡病菌的探针，探针核苷酸序列为：CTTAGAGGAGCTAGAGTCCTTATCTTCTAATAAGGAGCTCTAGGC，所述探针按以下方式进行修饰：

5’端序列/荧光报告基团//A THF//淬灭基团/3’端序列。

本发明中具体使用的探针修饰后按如下方式合成：

5’-CTTAGAGGAGCTAGAGTCCTTATCTTC/i6FAMdT//A THF//iBHQdT/AAGGAGCTCTAGGC-3’。

其设计要点在于：所述荧光探针修饰在探针中间，荧光报告基团修饰在离5'端碱基数28bp的位置上、淬灭基团修饰在离3'端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间隔2个碱基位置，其中1个碱基用于修饰四氢呋喃残基。

使用上述试剂盒检测油菜茎基溃疡病菌的方法，包括如下步骤：

S1、提取待测样品的DNA；用CTAB法进行油菜茎基溃疡病菌DNA的提取，也可以采用商业化的DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA；

S2、反应Buffer配制：取47μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将配制好的49μL试剂加入到已分装冻干的RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉中，使其充分溶解并混均；再加入已提取的1μL待测样品DNA为模板，总体积为50μL，充分混均；

S3、放入检测FAM荧光检测仪器中进行实时RAA荧光法反应；实时RAA荧光法反应条件设定为：反应温度39℃，反应时间5～20min；

S4、结果分析：

在反应时间(例如20min)之内FAM荧光检测仪器检测到信号明显增加，增加量为荧光起始量的30％，显示有扩增判定为阳性；在反应时间(例如20min)FAM荧光仪器信号无增加，判定为阴性。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明解决了现有技术检测方法在检测油菜茎基溃疡病菌中所存在的费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高等问题。本发明采用RAA技术，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点。只需在39℃下反应5～20分钟便可分析结果。具有快速、灵敏、操作简便等特点，对未来检测油菜茎基溃疡病菌传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。

综上所述，本发明的利用RAA技术能够快速检测油菜茎基溃疡病菌，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选。本发明所提供的检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明实施例1的灵敏度检测扩增图；

图2为本发明油菜茎基溃疡病菌实际样本检测扩增图；

图3为本发明油菜茎基溃疡病菌样本特异性实施例检测扩增图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。但本发明的内容并不局限于此。

以下实施例中引物探针及DNA质粒均可由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成；

实施例1、油菜茎基溃疡病菌的RAA荧光检测法灵敏度：

选择油菜茎基溃疡病菌的特异性保守基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得油菜茎基溃疡病菌基因序列，并进行多序列比对，并从中选出一段保守序列，该序列如下：TACGCGTAAGAAGCGTGCCTTAGAGTCTATAGGGAGCCGCCTAGGTTGCCCTAACCTAGAATCTATAAGGGGAACCTTAGAGGAGCTAGAGTCCTTATCTTCTAATAAGGAGCTCTAGGCGCCCTTAGCTATAGTATTAGCCTTGCGCGTAAGCTTAGCAGCAGTAGTAGTACCTTTTACTAGCTCCTACTATTTAGCCTTGCTCTCCTTAAGGAGCACTAAGACCCTCTGCTTCTTATCCTTAAGAAGGTCTTAGCTCTTACCTGCCTACTTCCTTGCTAGGAAGGATAGCGTAGAATATTAGGCAAGCTTAGGGCTATTAGTTTGTTAGTATAGATCTTACTAAGCGTTA；根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成DNA质粒，质粒大小352bp。

根据RAA技术引物及探针设计原则进行设计，通过筛选和评价，最终确定的：

上游引物序列5’-CGCCTAGGTTGCCCTAACCTAGAATCTATAAG-3’；

下游引物序列5’-CTRCTACTGCTGCTAAGCTTACGCGCAAGGC-3’；

探针序列及修饰方法为：

5’-CTTAGAGGAGCTAGAGTCCTTATCTTC/i6FAMdT//A THF//iBHQdT/AAGGAGCTCTAGGC-3’。

其中，FAM为荧光报告基团，BHQ为荧光淬灭基团，THF为四氢呋喃残基，修饰方法为FAM：6-Carboxyfluorescein；THF:tetrahydrofuran；BHQ:black hole quencher；phosphate:3’phosphate to block elongation。

表1、为引物和探针的相关信息表

表2、本发明试剂盒组成

为了方便进行试剂盒的灵敏度测定，将由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的油菜茎基溃疡病菌DNA质粒转化至大肠杆菌中，37℃扩培8小时，采用商品化的质粒提取试剂盒进行油菜茎基溃疡病菌DNA质粒，经浓度测定后将其浓度稀释至10

将5μl 10

工作标准品1，含有1.0×10

工作标准品2，含有1.0×10

工作标准品3，含有1.0×10

工作标准品4，含有1.0×10

反应Buffer配制：按吸取376μL反应缓冲液，加入16μL探针与引物的混合物，充分混均；吸取混均后49μL试剂分别加入到7个RAA基础荧光通用反应试剂管(50μL体系冻干粉)中，使冻干粉充分溶解并混均；

在5个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。

检测结果如图1所示。结果显示最快2分钟明显有扩增，10分钟内所有标准工作品均有扩增。

说明：当荧光增加量为荧光起始量的30％，判定为阳性。

实施例2

引物探针与实施例1相同。

试剂盒同实施例1的表2。

样本来源及DNA提取：

样本由浙江省检验检疫科学技术研究院提供，为加拿大油菜籽1、2、澳大利亚油菜籽1、2；本地青菜、青花菜种子的DNA，提取好的DNA在-80℃保存备用。

反应Buffer配制：取8个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的49μL试剂加入到RAA基础荧光通用反应试剂管(50μL体系冻干粉)中，使冻干粉充分溶解并混均；

在8个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取好的样品样本DNA(浓度为20ng/μL)，1μL阳性质控品为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。

检测结果如图2所示。结果显示3分钟明显有扩增。加拿大、澳大利亚油菜籽出现阳性信号，本地青菜、青花菜种子未出现阳性信号。

实施例3

引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。

试剂盒同实施例1的表2。

同表二

样本来源及DNA提取：

油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans、油菜黑胫病菌Leptosphaeriabiglobosa、芸苔链格孢Alternaria brassicae、链格孢Alternaria alternata、富氏葡萄孢盘菌Botryotinia fuckeliana、、芸苔生尾孢Cercospora brassicicola、葡萄茎枯病菌Phomαglomerata、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum的DNA由浙江省检科院提供，提取好DNA在-80℃保存备用。

提取待测样品的DNA；用CTAB法进行油菜茎基溃疡病菌DNA的提取，也可以采用商业化的DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA。

反应Buffer配制：取一个1.5ml的PE管，按如下操作，吸取423μL反应缓冲液加入PE管，再吸取18μL探针与引物的混合物加入423μL反应缓冲液中，充分混均；

取9个RAA基础荧光通用反应试剂管(50μL体系冻干粉)，分别加入混均后的配制反应液49μL，使冻干粉充分溶解并混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到RAA基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；

在8个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeriamaculans、油菜黑胫病菌Leptosphaeria biglobosa、芸苔链格孢Alternaria brassicae、链格孢Alternaria alternata、富氏葡萄孢盘菌Botryotinia fuckeliana、芸苔生尾孢Cercospora brassicicola、葡萄茎枯病菌Phomαglomerata、核盘菌Sclerotiniasclerotiorum的DNA各1μL为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。

检测结果如图3所示。结果显示只有油菜茎基溃疡病菌样本DNA明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。

实施例3显示本发明的试剂盒特异性好，可以区分油菜茎基溃疡病菌的近似种及油菜上常见的病害。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江省检验检疫科学技术研究院

江苏奇天基因生物科技有限公司

<120>RAA荧光法检测油菜茎基溃疡病菌的探针、试剂盒及方法

<160>4

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>gene

<223> 上游引物LM1

<400>1

cgcctaggtt gccctaacct agaatctata ag 32

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>gene

<223>下游引物LM2

<400>2

ctrctactgc tgctaagctt acgcgcaagg c 31

<210>3

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>gene

<223> 荧光探针Probe-LM

<400>3

cttagaggag ctagagtcct tatcttctaa taaggagctc taggc 45

<210>4

<211> 352

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>gene

<223> LM保守序列

<400>4

tacgcgtaag aagcgtgcct tagagtctat agggagccgc ctaggttgcc ctaacctaga 60

atctataagg ggaaccttag aggagctaga gtccttatct tctaataagg agctctaggc 120

gcccttagct atagtattag ccttgcgcgt aagcttagca gcagtagtag taccttttac 180

tagctcctac tatttagcct tgctctcctt aaggagcact aagaccctct gcttcttatc 240

cttaagaagg tcttagctct tacctgccta cttccttgct aggaaggata gcgtagaata 300

ttaggcaagc ttagggctat tagtttgtta gtatagatct tactaagcgt ta 352