荧光原位杂交探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种荧光原位杂交探针及其制备方法与应用。

背景技术

原位杂交是通过特定标记的已知核酸序列为探针与细胞或组织切片核酸序列进行精确定位的过程。因此可以借助于原位杂交得到细胞中特定RNA或DNA的位置信息，对分子水平的机制做出判断。

目前荧光原位杂交的探针中的寡链核苷酸的制备和标记较为复杂，合成寡链核苷酸引物需要通过化学修饰将荧光基团或生物素等连接到引物上，制备成本较高。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种荧光原位杂交探针及其制备方法与应用，以解决原位杂交探针中寡链核苷酸制备操作复杂、化学修饰成本较高不适合大量制备等问题。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种荧光原位杂交探针的制备方法，包括步骤：设计多条与目标核酸序列结合的杂交序列；通过质粒构建得到串联重复的标记序列；将杂交序列和标记序列的重复片段串联，之后将得到的产物回收并利用外切酶消化，得到单链DNA探针；将单链DNA探针进行标记，得到荧光原位杂交探针。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，多条为3-20条；杂交序列的长度为30-40bp。长度30-40bp可以适当增加杂交的特异性，多条探针组成的探针组可以增加信号强度。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，标记序列为能与序列特异性核酸结合蛋白如LacI结合的DNA序列如乳糖操纵子LacO。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，通过质粒构建得到串联重复的标记序列具体包括：在质粒上构建得到串联重复的标记序列，如如乳糖操纵子LacO的变体Osys，两个相邻的标记序列间隔为10-20bp，优选为15bp；串联重复序列以2段序列(2X序列)为基础，以一对同尾酶分别位于2段序列(2X序列)两端，另一限制性内切酶位于外围，通过同尾酶粘性末端连接，以此重复酶切连接，得到8-32段重复(8-32X)的标记序列。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，将杂交序列和标记序列的重复片段串联具体包括：通过修饰引物PCR用5’端携带杂交序列的修饰引物和另一反向引物以标记序列的突变体为模板，将杂交序列和标记序列的重复片段串联，所得片段在标记序列两端延长20bp以上。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，将得到的产物回收并利用外切酶消化具体为将得到的PCR产物回收并利用T5外切酶有限消化；单链DNA探针为末端具有30-40nt单链DNA片段。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，将单链DNA探针进行荧光标记具体包括：将单链DNA探针与样品杂交后洗涤，洗涤是依次采用wash buffer1和wash buffer2进行洗涤，再加入融合蛋白于37℃孵育30min，之后加入DAPI染色孵育5min即可；其中，融合蛋白是将结合蛋白与第一蛋白融合表达并纯化制备而得，如LacI-eGFP；第一蛋白为荧光蛋白和/或报告酶。

第二方面，本发明还保护根据上述方法制备得到的荧光原位杂交探针。

第三方面，本发明还保护上述得到的荧光原位杂交探针在制备用于荧光原位杂交检测产品中的应用。

第四方面，本发明还保护一种荧光原位杂交检测试剂盒，该试剂盒包括上述得到的荧光原位杂交探针。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：本发明通过修饰引物PCR将杂交序列与标记序列如Osys(乳糖操纵子LacO的变体)串联，利用相应的序列特异性核酸结合蛋白如LacI(LacI的C端5个氨基酸缺失)融合荧光蛋白或其他信号将信号引导并结合到标记序列，降低了传统寡链引物化学修饰较高的费用，串联重复的LacO序列和多探针的探针组设置大大提高了信号强度；通过T5 DNA外切酶或DNA外切酶III将所得的双链PCR产物进行有限消化获得单链末端，比双链探针达到更好的杂交效果；HRP或荧光蛋白可以直接与结合蛋白lacI等融合表达，而不需要体外耦联；整个过程，除引物合成外均可在常规分子生物学实验室完成，操作简单，成本低。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的整体机制示意图；

图2为本发明实施例中的PCR串联杂交序列和标记序列的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明提供一种荧光原位杂交探针的制备和标记方法，包括步骤：

S1：设计或搜索3-20条与目标核酸序列结合的杂交序列(即为核心探针序列)，长度30-40bp可以适当增加杂交的特异性，多条探针组成的探针组可以增加信号强度；

S2：标记序列为能够与序列特异性核酸结合蛋白(如LacI)结合的DNA序列(乳糖操纵子LacO)；

S3：在质粒上构建得到串联重复的标记序列(如乳糖操纵子LacO的变体Osys：AATTGTGAGCGCTCACAATT，SEQ ID NO.1)，两个相邻的标记序列之间间隔约15bp，串联重复序列以2X序列为基础，以一对同尾酶分别位于2X序列两端，另一限制性内切酶位于外围，通过同尾酶粘性末端连接，以此重复酶切连接，得到约8-32X重复；

S4：并通过修饰引物PCR用5’端携带1中序列的修饰引物和另一反向引物以S3中所得的含有串联重复标记序列的突变体为模板，将S1中的杂交序列与S3中标记序列重复片段串联，所得片段在标记序列两端延长20bp以上，使得下步消化时适当保护标记序列；

S5：将S4中所得的PCR产物回收并利用T5外切酶有限消化，得到末端具有30-40nt单链的DNA片段；

S6：将结合蛋白与荧光蛋白或报告酶融合表达并纯化(如LacI-eGFP)；

S7：将S5中所得的探针与样品杂交；

S8：杂交完成后，依次用wash buffer1和wash buffer2洗涤后，加入S6中获得的融合蛋白于37℃孵育30min后，加入DAPI孵育5min。

下面结合具体实施例对本发明提供的荧光原位杂交探针的制备和标记方法作进一步说明。

实施例

本实施例提供一种荧光原位杂交探针的制备和标记方法，包括如下步骤。

步骤一：构建LacO对称性突变序列Osys：AATTGTGAGCGCTCACAATT(SEQ ID NO.1)的2X重复序列(SEQ ID NO.2：CTCGAGCACATGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTGCATCACATGCACGTAGAATTGTGAGCGCTCACAATTGTCGAC)，并将两侧分别加上酶切位点CTCGAG(XhoI)(SEQ ID NO.3)和GTCGAC(SalI)(SEQ ID NO.4)，具体做法为合成两条引物5’-CTCGAGCACATGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTGCATCACATGCACGTAG-3’(SEQ ID NO.5)和5’-GTCGACAATTGTGAGCGCTCACAATTCTACGTGCATGTGATGCAATTG-3’(SEQ ID NO.6)相互退火延伸，并利用TA克隆连接到pSG-TS19载体上。

步骤二：利用NdeI和SalI双酶切上述构建的质粒，同时利用NdeI和Xho I酶切上述构建的质粒，两种酶切方式中得到的更长的片段和更长的载体骨架相连接得到4X重复串联的Osys，重复该步骤得到更高倍的重复序列(这里为8X重复的Osys)。

步骤三：设计重复序列外围的引物序列primer1：5’-TGCTTCCGGCTCGTATGT-3’(SEQID NO.7)，primer2：5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO.8)，并合成primer2。

步骤四：设计探针杂交序列，如c-myc的探针选择正义链同方向(用T5外切酶有限消化则选择正义链方向，用外切酶III处理需要选择反义链方向)。

P1：GAACTATGACCTCGACTACGACTCGGTGCAGCCGTATT(SEQ ID NO.9)。

P2：CCACAGCGTCTGCTCCACCTCCAGCTTGTACCTGCA(SEQ ID NO.10)。

P3：GCAAACCTCCTCACAGCCCACTGGTCCTCAAGAG(SEQ ID NO.11)。

P4：CACATCAGCACAACTACGCAGCGCCTCCCTCCACT(SEQ ID NO.12)。

P5：GCTCATTTCTGAAGAGGACTTGTTGCGGAAACGACGAG(SEQ ID NO.13)。

步骤五：将步骤四中得到的杂交序列分别添加到primer1的5’端作为修饰序列，得到引物序列(划线部分为杂交序列)。

P1：5’-

P2：5’-

P3：5’-

P4：5’-

P5：5’-

步骤六：将primer2分别与P1-P5配对，以pSG-TS19-Osys*8质粒为模板进行PCR扩增，扩增完成后得到约600bp条带，将所有目的条带回收后混合，测定总DNA浓度。

步骤七：将上述回收产物利用T5 exonuclease(T5核酸外切酶)以0.5U T5exonuclease/μg DNA于37℃孵育10min，反应结束后加入终浓度11mM的EDTA终止反应，-20℃保存备用。

步骤八：按照RNA FISH的步骤处理细胞样品到预杂交步骤结束，在杂交液中添加终浓度1ng/μL上述探针，用100μL含有探针的杂交液在孵育样品，37℃孵育18h。

步骤九：杂交结束后使用37℃预热的wash buffer1洗涤样品3次，每次在37℃孵育5min。

步骤十：使用37℃预热的wash buffer2洗涤样品3次，每次在37℃孵育5min。

步骤十一：使用1×PBS洗涤样品1次。

步骤十二：加入100μL含有0.1μg/ml LacI-eGFP(LacI的C端5个氨基酸缺失)的蛋白的1×PBS，37℃孵育30min后，以1:5000比例加入DAPI染色孵育5min，镜下观察。

本发明通过修饰引物PCR将杂交序列与标记序列如Osys(乳糖操纵子LacO的变体)串联，利用相应的序列特异性核酸结合蛋白如LacI(LacI的C端5个氨基酸缺失)融合荧光蛋白或其他信号将信号引导并结合到标记序列，降低了传统寡链引物化学修饰较高的费用，串联重复的LacO序列和多探针的探针组设置大大提高了信号强度；通过T5 DNA外切酶或DNA外切酶III将所得的双链PCR产物进行有限消化获得单链末端，比双链探针达到更好的杂交效果；HRP或荧光蛋白可以直接与结合蛋白lacI等融合表达，而不需要体外耦联；整个过程，除引物合成外均可在常规分子生物学实验室完成，操作简单，成本低。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。