一种用于检测人乳头瘤病毒HPV45的探针及其试剂盒

本发明涉及一种探针及其试剂盒，具体涉及一种可用于人乳头瘤病毒HPV45基因捕获、测序的探针及试剂盒。

宫颈癌是指发生于子宫颈阴道和宫颈部的恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌。宫颈癌在中国15~44岁女性各癌症发病率中居第二位，死亡率居第三位。大量研究证实，宫颈癌发生主要是由高危型人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）持续感染所致，在99.7%的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA的存在。目前，HPV基因型已鉴定出200余种，约40种与生殖道感染相关。根据其导致宫颈癌风险的高低将HPV分为高危型和低危险、型，其中高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型，26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别。这18种型别的HPV主要与宫颈上皮内瘤变、CINⅡ、Ⅲ级和宫颈癌的发生相关。低危型一般与恶性病变无关，主要引起尖锐湿疣和低级别CIN（CINI）。因此，通过检测宫颈脱落细胞中是否有高危型HPV感染，并定期检测宫颈脱落细胞中HPV病毒是否持续性感染在宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和愈后评估等环节中显得尤为重要。

通常情况下，HPV感染寄主细胞之后以游离状态存在，其DNA仍自由存在寄主细胞的细胞质中，随寄主细胞的分裂复制，HPV DNA就会插入人体基因组，这个过程也称为HPV整合。一旦HPV DNA偶然整合至宿主细胞染色体中，病毒蛋白将无秩序复制，宿主细胞遗传物质结构及相关基因表达发生变化，导致主体细胞不可控制地分裂，从而诱发癌变。尽管99.7%以上的宫颈癌中均检测出HPV DNA，但却不是每一个感染高危型HPV的患者均发生了宫颈癌。随着分子生物学和细胞遗传学的进展，HPV与宿主染色体的整合才是宫颈细胞永生化过程中的重要步骤，是导致宫颈上皮内瘤变向宫颈癌恶性进展的一个重要标志。在90%以上的宫颈癌组织中均发现HPV与宿主细胞染色体的整合体，HPV与宿主细胞基因组的整合是宫颈癌发展的最重要的危险因素。低危型HPV很少导致宫颈癌，与在宿主体内的病毒载量无关，是因为其很少发生病毒整合。高危型HPV分别在HSIL和鳞状细胞癌中的整合率分别为76.2%和88.2%，在LSIL中仅37%。HPV以非游离状态存在于侵入性宫颈癌中（约60.9%），较原位癌高出20%。HPV16阳性宫颈癌病例中近90%整合，纯游离形式存在的病例仅16%。说明病毒整合发生率与宫颈癌发病率成正相关，病毒整合状态与宫颈癌病情程度成正相关。HPV DNA与人基因组整合将作为宫颈病变程度的标志物，对宫颈癌的早期诊断具有非常重要的意义。

宫颈癌早期症状不明显，只有尽早地对宫颈癌做出早期筛选预警，才能有效降低由宫颈癌引起的死亡率。传统的病理学检测手段，如宫颈涂片检测，易受取材、染色及细胞病理医生的主观判断等因素的影响，因此应用细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、假阴性率和假阳性率高、不能对HPV进行分型等弊端。目前临床上常用的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法，该方法检测通量低，对于不同型别的HPV要分别检测，很难满足临床上同时进行多个型别的检测的需求，对于宫颈癌的大规模筛查不太适合。更重要的是，目前所用的这些方法只能对有无HPV感染及HPV感染型别做出判断，对于HPV DNA是否与人基因组发生整合没法做出判断，而HPV整合事件是宫颈癌发生的重要因素。高通量测序技术（next-generation sequencing technology）具有准确、灵敏度高、快速和低成本的优点，可同时对多个基因进行测序，该方法不只可以实现HPV分型检测，同时可以实现HPV整合检测。液相杂交基因捕获技术可以将目标区域相关基因片段富集，结合新一代基因测序技术，能够极大地降低人类基因测序、基因学研究及基因诊断的成本，提高测序深度，更精确地发现特定区域变异信息。而捕获探针的设计是液相杂交捕获技术的核心。综上所述，本发明提供一种用于检测HPV分型及整合的探针组及试剂盒，可一次性对18种高危型HPV进行精确分型并确定其在人基因组中的整合情况，具有一次性处理多个样本、灵敏度高和特异性高的优点，临床意义重大。

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种用于检测HPV的捕获探针组及其试剂盒；本发明根据上述18种HPV全基因组序列设计合成探针序列，对目的片段进行特异性捕获、扩增和测序，以达到检测样本的目的。所述探针组包含能特异性捕获全部18种HPV基因组的探针。可以全面、快速、准确的检测18种HPV分型及5种HPV整合情况，所述18种HPV分型分别为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82；5种HPV整合分别为HPV16、18、33、52、58。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种用于检测人乳头瘤病毒HPV45分型和整合的探针，探针信息见表1

本发明还提供了一种用于检测人乳头瘤病毒HPV45分型和整合的试剂盒。所述试剂盒包括本发明所述的用于检测人乳头瘤病毒HPV45分型和整合的探针；较佳的，所述试剂盒还包括建库缓冲液1、建库缓冲液2、酶1、酶2、接头、PCR扩增引物1、PCR扩增引物2、PCR反应混合液、封闭序列1、封闭序列2、封闭试剂、杂交缓冲液、PCR扩增缓冲液、PCR扩增引物3、PCR扩增反应液、阳性对照、阴性对照、捕获缓冲液、清洗缓冲液1、清洗缓冲液2和捕获磁珠；优选所述封闭序列1为Cot-1 DNA，封闭序列2为双链寡核苷酸。

进一步的，所述试剂盒各组成成分如表2所示。

本发明还公开了一种使用所述用于检测人乳头瘤病毒HPV45分型和整合的探针及其试剂盒的方法，主要包括以下几个步骤：

(1)设计HPV45的捕获探针

(2)样本DNA提取、片段化及构建DNA文库

(3)文库目标区域靶向捕获及定量

(4)高通量测序

(5)基因序列的生物信息分析

本发明提供一种对HPV基因进行捕获的方法，具体捕获过程包括：提取宫颈脱落细胞全基因组DNA，将其随机打断成200-300bp大小的片段后，部分片段含有HPV基因的序列，构建DNA文库；用本发明涉及的HPV探针（携带生物素标记，能特异性和HPVDNA序列杂交结合）与构建的预文库杂交，含有HPV基因的序列通过探针上生物素与磁珠结合，可以被特异性杂交；将不含HPV的序列洗涤除去，从而富集HPV基因片段，这样该试剂盒就将HPV序列捕获了出来；通过测序仪Nextseq CN500高通量测序并分析测序结果中的HPV信息，可获得待测样本的HPV基因型别及是否与人基因组发生整合情况。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明设计了可进行快速准确地捕获HPV45基因组全序列的探针，可以有效的提高检测特异性。以往的荧光定量PCR等方法都是只针对HPV序列的某一段区域，我们的探针检测范围可以覆盖HPV基因组全长。

（2）本发明利用HPV探针对捕获出目标区域的文库标本利用高通量测序技术测序。由于先使用HPV探针对HPV序列进行了靶向富集捕获，然后再进行高通量测序，使得其检测灵敏度高。

（3）本发明可以一次处理多个样本，通过对多个不同的样本加入不同Barcode进行区分，然后混合上机测序，可以有效的提高检测通量。

图1为末端修复、3’端加“A”反应PCR 仪参数；

图2为Pre-PCR 程序参数。

以下通过实施例对本发明作进一步阐述。如无特殊说明，本发明所使用的本领域常用试剂均可通过商购途径获得。

实施例1：本发明探针组的设计和制备

根据碱基互补配对原则，针对HPV45的DNA序列设计与之互补配对的寡核苷酸探针。由于基因组序列结构复杂，存在不规则区域，例如高GC、高AT区域等，同时由于二代测序读长的限制，从而使得探针设计变得尤为关键，需要综合权衡覆盖率、均一性、捕获效率等多种因素。探针设计的具体原则如下：

（1）长度：可选区间80-150bp，一般选100bp。

（2）探针层数：即目标区域上平均被多少条探针所覆盖，一般建议3层，且需叠瓦式设计。

（3）特异性：即探针在基因组范围的唯一性，特异性越高，探针的捕获效率越高。应避免在低复杂度区域设计探针；但在特殊情况下，比如，某些热点恰好位于低复杂度区域，那么需要综合评估该区域以及相邻区域的序列情况，谨慎放置探针。

（4）结合能力：GC含量在50%左右的区域，其探针捕获能力最强。高GC区域探针结合能力强，但DNA片段自身结合能力更强（长度更长），探针竞争阻力较大；高AT区域的DNA片段自身结合能力弱，但同样探针与之结合的能力也弱，因此，在高GC和高AT区域需要适当增加探针数量来弥补竞争阻力和结合能力方面的劣势。

探针制备：先用光化学合成法，在芯片上大量合成设计的探针，再通过PCR或转录反应得到被生物素标记的探针。

实施例2：本发明试剂盒组成、制备及使用

本实施例所述的用于HPV检测的试剂盒试剂。

所述试剂盒组成成分包括：本发明所述的用于检测HPV的捕获探针、建库缓冲液1、建库缓冲液2、酶1、酶2、接头、PCR扩增引物1、PCR扩增引物2、PCR反应混合液、封闭序列1、封闭序列2、封闭试剂、杂交缓冲液、PCR扩增缓冲液、PCR扩增引物3、PCR扩增反应液、阳性对照、阴性对照、捕获缓冲液、清洗缓冲液1、清洗缓冲液2和捕获磁珠。具体组成成分信息如表2，

所述试剂盒的使用方法为：

1、样本文库制备

（1）片段化：将1000 ng DNA取出解冻后震荡混匀，加水补齐至100μL，利用BioruptorPico超声打断仪打断。具体参数设置如下：待冷循环仪温度降至4°C后，设置参数ON 30秒，OFF 30秒为1个循环，每10 个循环为一轮，共进行3 轮；取1 μL样品使用Qsep1进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150 bp-200 bp。

（2）末端修复加A：将上一步获得的样品进行末端修复、3’端加“A”。具体反应体系如下：35 μL DNA片段，5 μL ERA缓冲液，10 μL末端修复酶。混好后，运行 PCR 程序，设置PCR 仪参数如图1（50 μL体系，热盖85°C）；

（3）加接头：将上一步获得的样本进行接头连接。具体反应体系如下：50 μL上一步反应结束的样品，5 μL接头，15 μL无酶水，20 μL链接缓冲液，10 μL连接酶；混好后，运行PCR仪程序（要求无热盖），设置PCR仪参数：热盖关，20°C 30 分钟，降至4℃结束

（4）磁珠纯化：程序结束后，立即用纯化磁珠纯化上一步反应产物。纯化体系如下：100μL上一步反应产物，100 μL纯化磁珠。

（5）Pre-PCR扩增反应：以上一步的纯化产物为模板，进行Pre-PCR反应。具体反应体系如下：20 μL上一步的纯化产物，25 μL PCR反应混合液，2.5 μL PCR扩增反应引物1(20 μM)，2.5 μL PCR扩增反应引物2(20 μM)。混好后，将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如图2所示（50 μL体系，热盖温度105°C）；

注：PCR扩增反应引物1中TPE1.0index号为1#~8#（表3）；PCR扩增反应引物2中TPE2.0index号为1#~12#；记录好所使用的index号（表4）。

（6）磁珠纯化：程序结束后，立即用50 μL纯化磁珠纯化上一步反应产物。

2、样本液相杂交

（1）静置解冻封闭序列1和封闭序列2，配制混合液1，具体为：750ng文库，5 μL封闭序列1，2 μL封闭序列2。

（2）取出试剂盒中的封闭试剂和探针，静置解冻后振荡混匀，按照5 μL封闭试剂与2 μL探针配制混合液2（冰上操作）。

（3）取出试剂盒中的杂交缓冲液置于室温化冻，化冻后取出20μL置于65°C恒温混匀仪孵育待用。

（4）将13μL杂交缓冲液添加到混合液2中，吹打混匀后短暂离心收集液体，室温放置待用。

（5）使用可控温真空干燥仪，设置干燥温度45-50℃，打开管盖，直至混合液1浓缩至体积小于10 μL，用无酶水补齐至10μL，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用。浓缩时间不宜过长，防止蒸干。

（6）将浓缩后的混合液2置于PCR仪中95°C孵育5min，65°C孵育2min（热盖温度为105°C），孵育完成后不需要取出。

（7）将添加了杂交缓冲液的混合液1置于PCR仪中65°C孵育2min（热盖温度为105°C）。

（8）吸取20μL的混合液1添加到混合液2中，充分混匀，65°C杂交16~24 h，保持杂交产物在PCR仪中，进入捕获步骤。

3、捕获

（1）提前取出试剂盒中的磁珠室温平衡30min，振荡混匀。

（2）取出50μL磁珠置于新的反应管中，离心管置于磁力架上静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（3）在磁珠中添加200µL捕获缓冲液，吹打混匀后，将离心管置于磁力架上静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（4）重复步骤（3）三次。

（5）在磁珠中重新添加200µL捕获缓冲液重悬磁珠，将重悬后的磁珠加入到杂交产物中，并将PCR管置于旋转混旋仪上室温结合30min。

（6）取出试剂盒中的清洗缓冲液1和清洗缓冲液2，清洗缓冲液1室温静置待用，清洗缓冲液2置65℃预热5min以上待用。

（7）将捕获产物置于磁力架上静置1分钟静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（8）从磁力架上取下离心管，加入200 μL的清洗缓冲液1，吹打混匀后，旋转混匀仪上15min，放在磁力架上静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（9）从磁力架上取下离心管，加入200 μL 65℃预热的清洗缓冲液2，吹打混匀后，置于恒温震荡仪（65℃，800rpm）上10分钟，置于磁力架上静置1min至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）。

（10）重复步骤（9）三次。

（11）从磁力架上取下离心管，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇，置于磁力架上静置30sec至液体澄清，小心吸弃液体（注意不要吸到磁珠）

（12）反应管留于上磁力架室温晾干3~5min使残留乙醇挥发，以磁珠表面无光泽为准（过分晾干将导致DNA得率下降）。

（13）从磁力架上取下离心管，加入30μL无酶水，重悬磁珠待用。

（14）配制混合液3，用0.2mL PCR管，具体反应体系如下：18μLPCR扩增缓冲液，1μLPCR扩增引物，1μLPCR扩增反应液。

（15）将20μL上述反应体系加入到洗涤产物中，充分混匀。

（16）置于PCR仪中按表5反应程序进行PCR扩增。

（17）扩增后纯化，使用商品化的核酸纯化磁珠进行扩增产物纯化，具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。吸取全部纯化产物置于冰上，重复2-3步骤，进入测序阶段或于-20±5℃保存。

4、捕获文库质控

（1）使用核酸定量试剂盒QubitdsDNA HS Assay Kit 及配套仪器测定文库的浓度，文库浓度应大于1ng/μL。否则文捕获文库不符合要求，应重新进行杂交捕获。

（2）取样本文库或对照品文库，使用Standard Cartridge Kit(S2)及配套仪器测定文库片段大小，文库片段大小应集中在250bp～500bp之间，无明显小片段和大片段杂峰。否则建库样品不符合要求，应重新进行杂交捕获。

5、文库qPCR定量

使用KAPA Library Quantification Kit试剂盒对待上机富集文库进行定量，以调整至合适上机浓度。

（1）试剂准备：1）准备适量的DNA稀释缓冲液：使用无酶水将1XIDTE缓冲液稀释至0.1X，每个文库约需1.2mL稀释缓冲液。使用前将缓冲液放至室温。2）冰上解冻试剂盒中各组分，使用前充分混匀，短暂离心，置于冰上备用。

（2）样本准备：1）准备适当的文库稀释液（使用无酶水）。取1μL富集文库进行1：100、1：10000、1：20000稀释。

（3）向PCR反应板需要进行反应的孔中各加入混有引物的8μL混合液，混合液具体组成为：5μLMaster Mix，1μL引物，1.8μL水，0.2μLLow Rox。

（4）向每个样本孔中加入对应的2μL已稀释的DNA文库（体积比为1:1000和1:20000）。

（5）向标准品孔中各加入2μL DNA标准品，按照从低浓度到高浓度顺序加入。

（6）向阴性对照孔中加入2μL稀释缓冲液。

（7）密封PCR 反应板，放入微孔板离心机中离心1min。

（8）将反应板装载到qPCR仪上并按照下表6参数运行qPCR仪。

（9）按照KAPA Library Quantification Kit试剂盒说明书进行待检文库的浓度计算。若最终文库总摩尔质量<0.02p 摩尔，需要重新进行文库杂交富集或重新进行建库，若再次不合格，终止检测。

6、上机测序

在基因测序仪Nextseq CN500上选用测序读长为300循环（Paired-End Reads，2×150cycles）的测序试剂进行测序，建议每个样品文库测序数据量800M。待测序样本文库数量不高于48个，推荐使用NextSeq 500 Mid Output v2 Reagent kit (300 cycles) 试剂检测；待测序样本文库数量高于48个且不高于96个，推荐使NextSeq 500 High Output v2Reagent kit (300 cycles) 试剂检测。

（1）提前取出Reagent Cartridge、HT1和Flow Cell，Flow Cell置于室温平衡30min，Reagent Cartridge置于室温水浴1h，HT1室温静置解冻后振荡混匀。

（2）将所有待测序样本文库按测序数据量需求进行混合，使用核酸定量试剂盒QubitdsDNA HS Assay Kit及配套仪器稀释各文库浓度至4 nM，取一个新的离心管等体积取各文库混合，混合后的总体积不低于5μL。

（3）配制新鲜的0.2N NaOH，由1μL 1N NaOH加入到4μL纯化水中混匀得到。

（4）取5μL 4 nM混合文库至新的1.5 mL离心管中，加入5μL新鲜配制的0.2N NaOH，吹打混匀室温静置5min进行4 nM混合文库变性，变性后加入混匀后的990μLHT1将混合文库稀释至20 pM。

（5）取一个新的1.5 mL离心管加入混匀后的1365μL HT1。

（6）取135μL稀释至20 pM的混合文库加入至1365μL HT1中，使最终上机混合文库总体积为1500μL。

（7）取出室温水浴解冻的Reagent Cartridge，用无尘纸檫干，翻转5次混匀其中试剂。

（8）使用干净的1 mL移液器吸头戳破Reagent Cartridge上带有Load Samples标签的10号孔封箔口，将1300μL混合有PhiX对照品的最终上机混合文库注入10号孔。

（9）根据测序仪运行设置提示进行试剂加载操作，测序仪自检完成后，点击“开始”按钮进行测序，测序时长26-29h。

7、HPV核酸分型与整合生物信息分析流程

（1）测序完成后，使用illumina公司的bcl2fastq v2.20.0.422软件将测序生成的BCL文件转化成样本对应的fastq文件。

（2）使用illuminate v0.6软件读取测序文件中InterOp目录的记录信息，对本次测序进行质量分析与评估。Fastp v0.20.0进行质控，要求Q30质量值大于80%。

（3）质量评估完成后，预处理数据，根据fastq文件碱基及质量，对原始数据进行质量控制（基于fastp v0.20.0软件）。

（4）序列比对：将fastq文件中的碱基序列比对至人类参考基因组hg38（GRCh38）和HPV基因组上生成bam文件（基于BWA v0.7.17、samtoolsv1.9和picard v2.20.6软件：比对）。

（5）HPV型別分析：使用分型检测模块（基于hpvHPVkitTyper v1.0软件），通过序列比对文件分析样本中各种HPV的reads数和比例。

（6）HPV整合分析：使用整合检测模块（基于hpvkitHPVFusionCallerv1软件），通过序列比对文件中比对上HPV和人基因组的序列进行位点比较，分析样本中HPV整合位点，并结合数据库进行注释。

（7）结果判定：分型分析，单个HPV型別Mean depth≥10则判定为该型别分型阳性；整合分析，单位数据量中HPV整合read数≥3则判定为该型别整合阳性。

实施例3：本发明试剂盒的使用效果验证

下面通过具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

1、20例参考品样本和16例临床样本HPV分型整合的高通量测序检测

样本编号为S1~S36,其中S1~S18为10^4拷贝 /mL的分型质粒参考品，分别为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82，S19和S20分别是浓度为0.25ng/μL的SiHa细胞（已知的HPV16整合样本）和HeLa细胞DNA（已知的HPV18整合样本），S21~S36为临床样本。检测结果：我们利用本发明的方法及试剂盒检测到了参考品样本对应的HPV型别及整合状态，说明本发明可对实际样本进行准确快速的检测，有实际可使用价值。本发明提供的用于HPV分型及整合检测的探针组及试剂盒具有操作简便、高通量、特异性好、灵敏度高等特点。结果如下：表7为36例样本高通量测序质控结果，表8为36例样本高通量测序分型结果，表9为18例样本高通量测序整合结果。

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<110> 武汉凯德维斯生物技术有限公司

<120> 一种用于检测人乳头瘤病毒HPV45的探针及其试剂盒

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