一种联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒
文献发布时间：2023-06-19 09:41:38
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒。
背景技术
急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种起源于淋巴细胞的B系或T系原始细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤。异常增生的原始细胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同时也可侵犯骨髓外的其他组织，如脑膜、淋巴结、性腺、肝、骨骼等。临床上常有头晕、乏力、心慌、气短、发热、盗汗、皮肤黏膜瘀点/瘀斑及骨痛、肌痛等症状。40%～60% 的ALL患者因白血病浸润引起肝脾肿大，导致腹部不适或饱胀感，淋巴结肿大较常见。
ALL的诊断治疗及预后需要从形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学进行MICM综合分析。随着分子生物学测序技术的不断发展，大量与急性淋巴细胞白血病密切相关的分子生物学标记被报道出来。白血病细胞DNA分析已经发现了新的亚微观结构遗传变化和序列变异，微观结构遗传变化主要包括：染色体数目和结构的易位、倒味、缺失和重复等；基因序列变异包括：点突变、基因片段插入或缺失等变异。《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识》中指出基因突变的检测在血液肿瘤诊疗中的应用价值，建议检测与ALL相关的基因，为临床诊断分型、预后判断、治疗指导、微小残留病灶（MRD）监测以及克隆演变提供参考。
目前，对于基因融合及基因突变的检测，主要的检测技术有细胞遗传学技术及分子生物学技术。细胞遗传学技术主要运用染色体核型分析、荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）检测等。经典的细胞遗传学方法染色体核型分析和FISH有许多限制：次优染色体形态、低分辨率（300-500bp）和复杂的重排造成了染色体核型分析技术在识别基因特定区域的改变上比较困难；FISH采用探针杂交原理对已知的基因融合进行检测，一般一次仅检测一种类型的基因融合，操作流程复杂，成本较高。分子生物学技术主要运用高通量测序技术（NGS）全基因组分析、一代测序（Sanger）及实时荧光定量PCR（Real Time PCR，RT-PCR）技术。运用高通量测序技术（NGS）全基因组分析高额的费用让普通患者望而却步，况且全基因组分析依赖于成熟的生物信息技术以及遗传解读经验。一代测序（Sanger）由于扩增局限于1kb左右的片段长度，无法对基因组大片段拷贝数变异进行检测，因此会产生假阳性。RT-PCR具有相对较高的检测通量，但需要的样品量较多，实验操作步骤多，检测费用较高。对于标志性突变位点通常采用特异性引物进行PCR检测。但没有发现对于急性淋巴细胞白血病能够实现一个试剂盒的一管反应同时检出多种基因重排和突变类型。
如中国专利CN111534588A，公开了一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，包括PCR引物对和探针，2x PCR Nucleotide Mix反应液和RNase-Free ddH
又如中国专利CN111575373A，公开了一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒用于检测急性淋巴细胞白血病相关的19种基因的多个外显子区域。该试剂盒包括检测相关基因突变的引物工作液，PCR混合液、PCR反应液、消化液、接头P5及接头P7。该试剂盒是基于多重PCR的靶向高通量测序技术进行的检测，具有高准确性、高灵敏度及高通量的优势，能快速高效对19种急性淋巴细胞白血病相关基因进行标准化的定量检测。但是对于其他基因重排现象，无法进行检测。
综上，上述方法均只能对已知的基因突变进行检测，并且受限于检测通量的限制，无法对急性淋巴细胞白血病的基因重排和点突变类型实现一次性的全检测。而据众多研究报道，急性淋巴细胞白血病的致病性基因突变已有多种，并且有大量的新的基因突变被陆续报道。因此，开发一种能联合检测多种基因突变的试剂盒，对于急性淋巴细胞白血病的临床研究和诊断具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是为了能同时检测急性淋巴细胞白血病相关多基因的、已知及未知基因的突变情况，提供了一种联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒，通过对送检样品的DNA和RNA共同提取，对RNA进行逆转录成cDNA后，与DNA一起进行高通量测序文库构建，并进行高通量测序，能一次性检测包括ABL 重排、ABL激酶区突变、CRLF2 重排、ETV6 重排、IGH 重排、KMT2A 重排、MYC 重排、PDGFRB重排及TCF3重排等多种基因重排和点突变类型，可以为急性淋巴细胞白血病患病个体提供精准诊断和治疗，并可为急性淋巴细胞白血病患者进行癌症风险评估。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案。
一方面，本发明提供了一种DNA文库构建的专用接头，所述的专用接头为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体。
所述的接头引物1和8条不同的i5端引物的序列如下表1所示。
表1 专用接头序列
所述的专用接头具有附图1所示的结构。其中，所述的5_index的序列为：CTCTCTAT、TATCCTCT、GTAAGGAG、ACTGCATA、AAGGAGTA、CTAAGCCT、CGTCTAAT或TCTCTCCG。
所述的专用接头包括附图2所示的8个接头结构。
再一方面，本发明提供了一组用于检测基因重排和点突变的特异性复合引物，所述的特异性复合引物的序列如下表2。
表2 特异性复合引物序列
表2（续）特异性复合引物序列
表2（续）特异性复合引物序列
又一个方面，本发明提供了一组文库扩增复合引物，所述的文库扩增复合引物的序列如下表3。
表3 文库扩增复合引物序列
基于上述引物序列，本发明的第一目的在于：提供一种联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒。
所述的试剂盒包括本发明上述的：（1）DNA文库构建的专用接头；（2）检测基因重排和点突变的特异性复合引物；（3）文库扩增复合引物。
本发明提供的试剂盒中，上述（1）-（3）项试剂独立包装。
作为优选的实施方案，本发明的第一个目的提供的试剂盒还包括以下任意一个或多个试剂组：反转录反应试剂组；DNA片段化、末端修复及加碱基A试剂组；DNA连接试剂组；PCR扩增试剂组；高保真热启动PCR扩增试剂组。
需要特别说明的是，本发明提供的检测基因重排和点突变的特异性复合引物是本发明的第二个目的。所述的检测基因重排和点突变的特异性复合引物被用于与非本发明提供的其他接头配合来进行ABL 重排、ABL激酶区突变、CRLF2 重排、ETV6 重排、IGH 重排、KMT2A 重排、MYC 重排、PDGFRB重排及TCF3 重排检测的产品或相关方法也应当属于本发明这一目的所包含的范围。
具体地，所述的反转录反应试剂组包括随机引物、第一链合成缓冲液、第一链合成酶混合液、第二链合成缓冲液、第二链合成酶混合液和超纯水。
具体地，所述的DNA片段化、末端修复及加碱基A试剂组包括10×DNA片段化缓冲液、5×片段化酶混合液和超纯水。
具体地，所述的DNA连接试剂组包括5×连接酶缓冲液、TIANSeq DNA连接酶、专用接头和超纯水。
具体地，所述的PCR扩增试剂组包括5×多重PCR反应酶混合液、PCR引物和超纯水。
具体地，所述的高保真热启动PCR扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液和超纯水。
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，也就是非疾病检测性的急性淋巴细胞白血病多基因联合检测方法。
所述的试剂盒使用方法包括以下步骤：
S1.使用DNA文库构建的专用接头连接检测样本DNA；
S2.使用检测基因重排和点突变的特异性复合引物对步骤S1的连接产物进行复合PCR扩增；
S3.使用文库扩增复合引物对步骤S2获得的扩增产物进行PCR扩增，获得测序文库；
S4.对步骤S3获得的测序文库进行测序。
作为一些优选的实施方案，所述的使用方法包括以下步骤：
（1）提取样本中的DNA和RNA；
（2）将步骤（1）所得的RNA进行逆转录制备cDNA；
（3）将步骤（2）所得的cDNA与步骤（1）所得的DNA混合后，进行核酸片段化、末端修复及加A，得cDNA与DNA混合液；
（4）将步骤（3）所得的cDNA与DNA混合液进行接头连接并纯化，得纯化后的接头连接产物；
（5）将步骤（4）所得的纯化后的接头连接产物进行第一步特异性PCR并纯化，得第一步PCR纯化产物；
（6）将步骤（5）所得的第一步PCR纯化产物进行第二步通用PCR并纯化，得测序文库；
（7）上机测序；
（8）生物信息学分析软件对进行数据结果分析。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果。
1、就本发明的整体构思而言，本发明实现了基因重排和点突变的同时检测。
2、就本发明针对文库构建的设计构思而言
传统扩增子文库构建检测基因位点突变时，使用双引物扩增（参见附图3的示意图），生成的文库双端位置固定，导致某个位置的测序序列无法有效去除扩增导致的序列重复，从而无法识别降低扩增过程中引入的随机突变，导致灵敏度降低。
而本发明对cDNA和DNA进行随机打断后，在DNA两端连接通用引物，一端采用特异性引物扩增，一端采用通用引物，保留其中一段的随机性，从而可以有效识别重复测序序列。参见附图4的示意图。
3、就本发明检测基因重排和点突变的特异性复合引物的设计而言
融合基因是基因重排的一种现象，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连．置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因。例如RUNX1/ETO 融合，其中RUNX1为核心基因，ETO为伴侣基因，融合基因通常有多个伴侣基因，并且融合断点往往不一样。
因此传统扩增子文库构建需要同时知晓伴侣基因和核心基因两个基因，并且断点位置也已知的情况下，进行引物设计检测。容易遗漏断点未知，或者伴侣基因未知的融合类型。
本发明通过将单引物设置在核心基因上，不必事先知道断点或伴侣基因，在引物扩增过程中，都能够将序列包含在文库中，通过测序识别伴侣基因及断点位置。二者对比参见附图5的示意图。
4、就整个检测流程而言
传统液相杂交捕获文库流程偏长，涉及约24个步骤，耗时20-24h，操作过程复杂，本试剂盒发明精简操作流程至11个步骤和耗时缩短至6-8h，参见附图6的示意图。
5、与其他检测技术的比较
（1）与利用arms_PCR法检测上述突变比较
利用arms_PCR法突变操作复杂，每管反应只能检测一个至三个位点；而本发明试剂盒通过加入多个位点的检测引物，并进行高通量测序可同时检测上述所有位点。另外，arms_PCR法无法利用mRNA检测融合基因，本发明试剂盒可以检测。
（3）与利用RT-PCR法检测融合基因比较
RT-PCR的检测方法检测效率较低，一次只能检测一种类型融合，本发明试剂盒通过同时加入多组引物，可实现多种融合同时检测。RT-PCR只能检测已知种类，限定特定断点的融合基因类型，本发明则克服了这一缺陷。
6、本发明整体技术方案利用高通量测序法，每次测序每个突变并行测序10000次以上，结合整体构思、文库构建的设计构思，以及“（1）DNA文库构建的专用接头；（2）检测基因重排和点突变的特异性复合引物；（3）文库扩增复合引物”的设计构思，一方面实现了同时检测上述所有位点（多个基因重排和突变位点）；另一方面从多方面多角度提升检测灵敏度，灵敏度可达到0.1%。而常规检测方法敏感性较低，灵敏度较低，只能达到10%。
综上，相对于现有技术，本发明提供了一种灵敏度更高的，能够实现基因重排和突变位点同时检测的联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒。
附图说明
图1为专用接头结构。
图2为专用接头的8个接头结构。
图3为构建传统扩增子文库检测基因位点突变。
图4为构建本发明单引物文库检测基因位点突变。
图5为构建传统扩增子文库与本发明单引物文库检测融合基因的比较。
图6为构建液相杂交捕获文库与本发明单引物文库的比较。
图7为本发明试剂盒使用方法的实验流程图。
图8为本发明单引物扩增文库构建流程图。
图9为本发明试剂盒对ABL 重排 BCR-ABL1 融合阳性样品的检测结果。
图10为本发明试剂盒对ABL 重排 BCR-ABL1 融合阴性样品的检测结果。
图11为本发明试剂盒对ABL激酶区突变阳性样品的检测结果。
图12为本发明试剂盒对ABL激酶区突变阴性样品的检测结果。
图13为本发明试剂盒对IGH-CRLF2 重排阳性样品的检测结果。
图14为本发明试剂盒对IGH-CRLF2 重排阴性样品的检测结果。
图15为本发明试剂盒对ETV6-RUNX1重排阳性样品的检测结果。
图16为本发明试剂盒对ETV6-RUNX1重排阴性样品的检测结果。
图17为本发明试剂盒对KMT2A-AFF1重排阳性样品的检测结果。
图18为本发明试剂盒对KMT2A-AFF1 重排阴性样品的检测结果。
图19为本发明试剂盒对MYC 重排IGH/MYC阳性样品的检测结果。
图20为本发明试剂盒对MYC 重排IGH/MYC阴性样品的检测结果。
图21为本发明试剂盒对PDGFRB重排ETV6/PDGFRB 阳性样品的检测结果。
图22为本发明试剂盒对PDGFRB重排ETV6/PDGFRB 阴性样品的检测结果。
图23为本发明试剂盒对TCF3 重排TCF3/PBX1 阳性样品的检测结果。
图24为本发明试剂盒对TCF3 重排TCF3/PBX1 阴性样品的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试剂：
随机引物、第一链合成酶混合液、第一链合成缓冲液、第二链合成缓冲液、第二链合成酶混合液，均购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：TIANSeq RNA片段化及cDNA合成模块（NG308）。
10×DNA片段化缓冲液、5×片段化酶混合液购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：TIANSeq快速DNA片段化/末端修复/dA添加模块（NG301）。
5×连接酶缓冲液、TIANSeq DNA连接酶购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：TIANSeq快速连接模块（NG303）。
1.6X磁珠购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：TIANSeq DNA片段分选磁珠（NG306）。
5×多重PCR反应酶混合液购自Takara，货号：Multiplex PCR Assay Kit Ver.2，RR062A。
高保真热启动酶反应液购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：TIANSeq高保真PCR反应预混液（NG219）。
实施例1 DNA文库构建的专用接头、检测基因重排和点突变的特异性复合引物、文库扩增复合引物的设计
（1）DNA文库构建的专用接头
一种DNA文库构建的专用接头，为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体。
接头引物1和8条不同的i5端引物的序列如表1所示，其中i5端引物序列的黑体加粗部分为5_index序列。
专用接头具有如图1所示的结构。其中，所述的5_index的序列为：CTCTCTAT、TATCCTCT、GTAAGGAG、ACTGCATA、AAGGAGTA、CTAAGCCT、CGTCTAAT或TCTCTCCG。
因此，专用接头包括如图2所示的8个接头结构。
（2）检测基因重排和点突变的特异性复合引物
一组用于检测基因重排和点突变的特异性复合引物，特异性复合引物的序列如表2所示。
（3）一组文库扩增复合引物，文库扩增复合引物的序列如表3所示，其中i7端引物序列的黑色粗体部分为index序列。
实施例2 联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒及其使用方法
一种联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒，包括实施例1中的：（1）DNA文库构建的专用接头；（2）检测基因重排和点突变的特异性复合引物；（3）文库扩增复合引物。
上述试剂盒还包括：反转录反应试剂组；DNA片段化、末端修复及加碱基A试剂组；DNA连接试剂组；PCR扩增试剂组；高保真热启动PCR扩增试剂组。
其中，反转录反应试剂组包括随机引物、第一链合成缓冲液、第一链合成酶混合液、第二链合成缓冲液、第二链合成酶混合液和超纯水；DNA片段化、末端修复及加碱基A试剂组包括10×DNA片段化缓冲液、5×片段化酶混合液和超纯水；DNA连接试剂组包括5×连接酶缓冲液、TIANSeq DNA连接酶、专用接头和超纯水；PCR扩增试剂组包括5×多重PCR反应酶混合液、PCR引物和超纯水；高保真热启动PCR扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液和超纯水。
本发明提供的试剂盒中，上述（1）-（3）项试剂独立包装。
上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1.使用DNA文库构建的专用接头连接检测样本DNA；
S2.使用检测基因重排和点突变的特异性复合引物对步骤S1的连接产物进行复合PCR扩增；
S3.使用文库扩增复合引物对步骤S2获得的扩增产物进行PCR扩增，获得测序文库；
S4.对步骤S3获得的测序文库进行测序。
具体步骤如下（如图7、图8所示）。
一、cDNA逆转录
1、第一链cDNA合成
（1）试剂准备：将样本中提取的RNA置于冰上缓慢解冻后移液器混匀，随机引物从-20℃取出，解冻后轻弹混匀，将第一链合成酶混合液从-20℃取出，轻弹混匀。
（2）在PCR管中建立如下表4反应体系，并用移液器轻轻吹打充分混匀。
表4 反应体系
（3）将上述反应体系于65℃孵育5分钟，然后置于冰上2分钟。
（4）步骤（3）结束后，在原管中继续加入下表5所列的逆转录组分。
表5 逆转录组分
（5）用移液器轻轻吹打充分混匀，进行第一链cDNA合成反应，热盖温度105℃。
反应程序：25℃保持10分钟；42℃保持15分钟；70℃保持15分钟；4℃保温。
注意：反应结束后立即进行cDNA第二链的合成反应。
2、第二链cDNA合成
（1）将第二链合成缓冲液和第二链合成酶混合液从-20℃取出，轻弹混匀，在PCR管中建立如下表6反应体系，并用移液器轻轻吹打充分混匀。
表6 反应体系
（2）在PCR仪中进行第二链cDNA合成反应，PCR热盖温度设定为≤40℃。
反应步骤：16℃保持60分钟；4℃保温。
注意：反应结束后，cDNA第二链的合成产物可在4℃暂存1小时，但是建议反应结束后立即进行下步纯化步骤。
（3）纯化
1.8X纯化磁珠纯化cDNA第二链的合成产物，37μL洗脱，进行cDNA定量，得到cDNA样品。
二、cDNA与样品提取的DNA混合
取50ngcDNA样品和同一份样本中提取的50ngDNA样品等量混合，得到cDNA和DNA混合液100ng。
三、文库构建：核酸片段化、末端修复及加A
1、配制如下表7反应体系，冰上操作，各组分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。
表7 反应体系（当DNA上样量>10ng）
2、设置PCR仪反应程序。开启热盖，热盖温度设置为70℃。
反应程序：4℃保持1分钟；32℃保持7分钟；65℃保持30分钟；4℃保温。
片段化时间选择参考下表8。
表8 片段化时间的选择-32℃片段化时间（分钟）
3、反应结束后，立即进入接头连接步骤。
四、文库构建：接头连接
1、在上一步骤反应结束管中直接加入下表9组分。
表9 接头连接组分
其中，专用接头包括如图2所示的8个接头结构
注：一个样品一次只用以上8种中任选的一种接头结构。设置8种接头结构的原因是为区分不同的样品，保证能够同时测序多个样品。
2、将上一步骤的反应液用移液器吸打混匀，放入PCR仪，进行如下反应（无热盖）。
反应程序：20℃保持15分钟；4℃保温。
3、1.6X磁珠纯化接头连接产物，16μL超纯水洗脱，取15μL上清液到新的PCR管中，进行第一步PCR扩增反应。
五、第一步多重PCR扩增
1、使用多重PCR反应体系，进行PCR，反应体系如下表10。
表10 PCR反应体系
其中，特异性引物（34条）混合物包括特异性引物1-34（SEQ ID NO:11-44）。
特异性引物（34条）混合物的混合方案如下表11所示。
表11 特异性引物（34条）混合物的混合方案
表11（续）特异性引物（34条）混合物的混合方案
2、反应混合液配好后，移液器吹打10次混匀，放入PCR仪，运行下面的反应程序（热盖105℃）。
反应程序：99℃保持2分钟，1个循环；99℃保持15s，69℃保持4分钟，18个循环；72℃保持10分钟，1个循环；4℃保温。
3、PCR结束后，电泳。1.6X磁珠纯化，得到第一步PCR扩增产物，Qubit定量。
六、第二步PCR扩增
1、取第一步PCR扩增产物进行第二步PCR扩增，扩增体系如下表12。
表12 扩增体系
其中，i7端引物为i7端1号引物-i7端8号引物（SEQ ID NO:46-53）中任选一种。一个样品的检测只用一种i7端引物，设置八种i7端引物的原因是为区分不同的样品，保证能够同时测序多个样品。
2、第二步PCR扩增反应混合液配好后，移液器吹打10次混匀，放入PCR仪，运行下面的反应程序（热盖105℃）。
反应程序：
初始变性95℃保持3分钟，1个循环；变性98℃保持20sec，退火58℃保持15sec，延伸72℃保持15sec，8个循环；终延伸72℃保持1分钟，1个循环；4℃保温。
3、PCR反应结束后，Qubit定量，电泳。
4、1.3X磁珠纯化，10μL超纯水洗脱。Qubit定量。
5、文库稀释到2-3ng/μL，进行Agilent 4150 TapeStation 系统检测。
6、测序上机。
7、生物信息学分析软件对进行数据结果分析。
试验例1
采用本发明实施例2记载的方法针对不同位点捕获效果进行检测。突变类型、样本编号及来源如表13所示。检测结果如图9-24所示，均能检测到。
表13 不同位点捕获效果测试
表13（续）不同位点捕获效果测试
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 苏州科贝生物技术有限公司
<120> 一种联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒
<160> 53
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccttct tggatttgca gcccaccagc 60
t 61
<210> 16
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtttt ccttggagtt ccaacgagcg 60
gc 62
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcaaag tcagatgcta ctggccgctg 60
<210> 18
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctttc tctgtgccag tagtgggcat 60
gtag 64
<210> 19
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtgtt gtcgtcgttg caaattctgt 60
cacg 64
<210> 20
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccacc cccaggcata gaagacaata 60
gacag 65
<210> 21
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccaac gacatcggga tttgatcaaa 60
ggcg 64
<210> 22
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcttag ataagcccaa gtttggtggt 60
cgca 64
<210> 23
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctacaa tggatgcctt ccaaagccta 60
cctgc 65
<210> 24
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagttc ccaaaaccac tcctagtgag 60
ccca 64
<210> 25
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctcc ccgcccaagt atccctgtaa 60
aac 63
<210> 26
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcaga tggagtccac aggatcagag 60
tgga 64
<210> 27
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgaaga gacggtgacc attgtccc 58
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagcct ctgagaagcc ctgcccttct 60
<210> 29
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaggct gctggttttc cactacccg 59
<210> 30
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctcgg cctcccgact cctacagt 58
<210> 31
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagaaca cgtcagcggc tgaccact 58
<210> 32
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgaaag acggcagctc cccacagcag 60
aac 63
<210> 33
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgttag tctccagctg gctctcctct 60
t 61
<210> 34
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaggat ggctgagatc accaccacct 60
t 61
<210> 35
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacctt ccatcggatc tcgtaacgtg 60
g 61
<210> 36
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacacac catagacagt gggcttgttg 60
c 61
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttcaag gtcttcacgg ccaccgtca 59
<210> 38
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaagga gctgcaccag gttagggtgt 60
ttg 63
<210> 39
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcaggt agtccaggag gttcccgtag 60
gt 62
<210> 40
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttctc caggtactcc atggctgacg 60
ag 62
<210> 41
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgctca ggccaaaatc agctaccttc 60
ac 62
<210> 42
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccaga cgtcggactt gatggagaac 60
t 61
<210> 43
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgctc gcatgagttc atagaccttc 60
tctg 64
<210> 44
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaggct tggtggattt cagcaaagga 60
gg 62
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aatgatacgg cgaccaccg 19
<210> 46
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
caagcagaag acggcatacg agattcacaa gcgtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 47
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
caagcagaag acggcatacg agatactaca cggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 48
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
caagcagaag acggcatacg agatatcgta cggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 49
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
caagcagaag acggcatacg agatagacac aggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 50
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
caagcagaag acggcatacg agatttgtcc tggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 51
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
caagcagaag acggcatacg agattgtgag aggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 52
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
caagcagaag acggcatacg agataaggtt gggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 53
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
caagcagaag acggcatacg agatattagc cagtgactgg agttcagacg tgt 53