一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法及分离仪
文献发布时间：2023-06-19 09:41:38
技术领域
本发明涉及细胞生物学检测技术领域，尤其涉及一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法及分离仪。
背景技术
出生缺陷是指婴儿出生前发生的身体结构、功能或代谢等方面异常的一种统称,通常包括先天结构畸形、染色体异常、遗传代谢性疾病以及功能异常如盲、聋和智力障碍等。出生缺陷是导致早期流产、早产、死胎、围产儿死亡、婴幼儿死亡的主要原因，可导致儿童长期患病、寿命缩短、甚至终身残疾。因此产前筛查、产前诊断对预防出生缺陷至关重要。
胎儿有核红细胞拥有完整的遗传信息，在孕早期，胎儿有核红细胞在孕妇外周血液中含量丰富，且细胞生存周期短，在婴儿分娩几天后基本消失；且其有明显的形态学特征，具有一些细胞表面标记（如CD71、GPA、CD147）和一些胞内标记如胚胎或胎儿（γ-）血红蛋白，可以通过一些阳性抗体如CD71、GPA、胎儿血红蛋白等进行富集和识别。因此相对于其他循环于母血中的胎儿细胞，有核红细胞一直以来被认为是产前诊断的首选靶细胞，但其在母血循环中数量极少，影响其应用于产前诊断。
因此我们提出了一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法及分离仪。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化的分离仪，所述分离仪为离心式血细胞分离机。
一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、采集孕11-28周孕妇的外周血，用10ml 1640培养基稀释，摇匀备用；
S2、取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中，离心后静置；
S3、取离心管并在其中预置细胞分离液，加入稀释的细胞悬液于分层液面上，离心后吸取白膜层，并加入PBS离心清洗；
其中，制备细胞悬液的步骤如下：
取S1中采集的外周血，离心后取细胞沉淀物，并向细胞沉淀物中加入等体积的36℃～38℃的RPMI1640细胞培养液，RPMI1640细胞培养液中含有质量分数为10%的胎牛血清，充分混匀制得稀释的细胞悬液；
S4、弃上清液，再次加入20mL的PBS，离心吹散，收集剩下的细胞，并分选出胎儿有核红细胞；
S5、对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定，收集并确定符合标准的胎儿有核红细胞。
优选的，所述S2中离心速率为1200rpm/min～1600rpm/min，离心时间为30min。
优选的，所述细胞分离液的组成为：质量分数为9%的聚蔗糖20～30份、质量分数为33.9%的泛影葡胺5～15份。
优选的，所述S3中吸取白膜层时的离心速率为1800rpm/min～2100rpm/min，离心时间为10min。
优选的，所述S3中在加入了PBS后的离心速率为1300rpm/min～1600rpm/min，离心时间为10min。
优选的，所述S3中白膜层与PBS的混比为2:1。
优选的，所述S4中离心速率为1700rpm/min～2200rpm/min，离心时间为10min。
优选的，所述离心过程均于分离仪中进行。
本发明的有益效果是：
本发明从孕妇外周血中分离纯化获得胎儿有核红细胞，在此获取过程中采用细胞分离液，可有效清除红细胞、血小板和单核巨核细胞，更好地富集白细胞和有核红细胞，有效地提高了分离有核红细胞的效率。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显 然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施 例。
一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化的分离仪，分离仪为离心式血细胞分离机。
一种孕妇外周血胎儿有核红细胞分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、采集孕11-28周孕妇的外周血，用10ml 1640培养基稀释，摇匀备用；
S2、取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中，以1500rpm/min的速率将其置于分离仪内离心30min后静置；
S3、取离心管并在其中预置细胞分离液（细胞分离液的组成为：质量分数为9%的聚蔗糖25份、质量分数为33.9%的泛影葡胺12份），加入稀释的细胞悬液于分层液面上，并将其置于分离仪内以2000rpm/min的速率离心10min后吸取白膜层，并按2:1的混比加入PBS，再以1500rpm/min的速率离心10min进行清洗；
其中，制备细胞悬液的步骤如下：
取S1中采集的外周血，离心后取细胞沉淀物，并向细胞沉淀物中加入等体积的37℃的RPMI1640细胞培养液，RPMI1640细胞培养液中含有质量分数为10%的胎牛血清，充分混匀制得稀释的细胞悬液；
S4、弃上清液，再次加入20mL的PBS，并将该混合液置于分离仪内以2000rpm/min的速率离心10min，将细胞吹散，收集剩下的细胞，并分选出胎儿有核红细胞；
S5、对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定，收集并确定符合标准的胎儿有核红细胞。
实施例一：
S1、采集孕11-28周孕妇的外周血，用10ml 1640培养基稀释，摇匀备用；
S2、取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中，以1200rpm/min的速率将其置于分离仪内离心30min后静置；
S3、取离心管并在其中预置细胞分离液，加入稀释的细胞悬液于分层液面上，并将其置于分离仪内以1800rpm/min的速率离心10min后吸取白膜层，并按2:1的混比加入PBS，再以1300rpm/min的速率离心10min进行清洗；
S4、弃上清液，再次加入20mL的PBS，并将该混合液置于分离仪内以1700rpm/min的速率离心10min，将细胞吹散，收集剩下的细胞，并分选出胎儿有核红细胞；
S5、对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定，收集并确定符合标准的胎儿有核红细胞。
实施例二：
S1、采集孕11-28周孕妇的外周血，用10ml 1640培养基稀释，摇匀备用；
S2、取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中，以1500rpm/min的速率将其置于分离仪内离心30min后静置；
S3、取离心管并在其中预置细胞分离液，加入稀释的细胞悬液于分层液面上，并将其置于分离仪内以2000rpm/min的速率离心10min后吸取白膜层，并按2:1的混比加入PBS，再以1500rpm/min的速率离心10min进行清洗；
S4、弃上清液，再次加入20mL的PBS，并将该混合液置于分离仪内以2000rpm/min的速率离心10min，将细胞吹散，收集剩下的细胞，并分选出胎儿有核红细胞；
S5、对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定，收集并确定符合标准的胎儿有核红细胞。
实施例三：
S1、采集孕11-28周孕妇的外周血，用10ml 1640培养基稀释，摇匀备用；
S2、取稀释后的血液20mL并加入到20mL的细胞分离液中，以1600rpm/min的速率将其置于分离仪内离心30min后静置；
S3、取离心管并在其中预置细胞分离液，加入稀释的细胞悬液于分层液面上，并将其置于分离仪内以2100rpm/min的速率离心10min后吸取白膜层，并按2:1的混比加入PBS，再以1600rpm/min的速率离心10min进行清洗；
S4、弃上清液，再次加入20mL的PBS，并将该混合液置于分离仪内以2200rpm/min的速率离心10min，将细胞吹散，收集剩下的细胞，并分选出胎儿有核红细胞；
S5、对胎儿有核红细胞的图片进行四重形态学标准鉴定，收集并确定符合标准的胎儿有核红细胞。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。