一种用于扩增B淋巴细胞免疫组库的引物组及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种用于扩增B淋巴细胞免疫组库的引物组及其应用。

背景技术

B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)是B细胞识别抗原的一种膜表面免疫球蛋白(SmIg)，具有抗原结合特异性。BCR由两条重链和两条轻链连接而成，其中重链分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区及胞质区；轻链则只有V区和C区。V区由VH和VL两个结构域组成，它们各由三个互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)组成，CDR的氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性，在同一个体内可高达10～10

肾脏是重要的排泄水分和身体代谢产物的器官。IgA肾病(IgAnephropathy，IgAN)是以IgA为主的免疫球蛋白弥漫沉积在肾小球系膜区以及毛细血管袢，临床表现和病理改变各异的临床病理综合征，是最常见的导致慢性肾脏疾病和进行性症状的肾小球肾炎。IgAN的特征是肾小球中存在IgA显性或共显性免疫复合物沉积。虽然IgA是IgAN患者中Ig的主要成分，但在80％以上的病例中，IgG、IgM等其他抗体亚型或两者同时存在于lgA的同一区域。高达40％的成人IgAN患者将发展为进行性肾功能衰竭，并最终需要透析或肾移植后20年内诊断活检。研究表明，引起IgA蛋白结构改变的基因突变、抗多糖IgG和IgAs等自身抗体的改变以及病毒感染等可能会影响IgAN的发展。

然而，上述遗传因素、异常的IgA免疫复合物或病毒感染等本身并不足以引起IgAN，IgAN发病机制尚不清楚。IgAN是一种自身免疫性疾病，因此，了解IgAN中免疫系统的变化有助于研究IgAN的发生原因，能够帮助人们更好地预防、诊断和治疗IgAN。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于扩增B淋巴细胞免疫组库的引物组及其应用，利用所述引物组对IgAN患者和正常对照组的B淋巴细胞进行扩增，收集文库信息。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于扩增B淋巴细胞免疫组库的引物组，所述引物组包括一组正向引物和一组反向引物；

所述正向引物从5′端到3′端包括依次相连的接头序列1、条码序列1和针对免疫球蛋白可变区互补决定区3(CDR3)的特异性序列；其中，所述针对免疫球蛋白可变区互补决定区3的特异性序列如SEQ ID NO.1～12中的任意一项所示；所述反向引物从5′端到3′端依次为接头序列2、条码序列2和针对免疫球蛋白基因恒定区的特异性序列。

优选地，所述针对免疫球蛋白基因恒定区的特异性序列如SEQ ID NO.13～17所示。

利用所述引物组对IgAN患者的B淋巴细胞免疫组库信息进行扩增，该引物组的扩增片段覆盖率较高，降低了PCR扩增偏好性，特异性和灵敏度较好，可获得更丰富的微生物组信息，增加了文库序列的复杂度，减少扩增过程中二级结构的产生；

优选地，所述接头序列1的核苷酸序列为SEQ ID NO.18：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAG。

优选地，所述接头序列2的核苷酸序列为SEQ ID NO.19：CTACACGACGCTCTTCCGATCT。

优选地，所述条码序列1由6～8个核苷酸组成。

优选地，所述条码序列2由6～8个核苷酸组成。

从IMGT下载人免疫球蛋白重链基因序列(http://www.imgt.org/)。选择IGHVCDR3上游3框区相对保守的区域作为推测的前引物区，设计了12个与大多数V基因序列家族相对应的正向引物。

同样的，本发明中还设计了5个与抗体恒定区的同型(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)相对应的5个反向引物。同时，用Oligo 7.0和MFEprimer-2.0软件对正、反向引物进行二聚体和环结构分析。

作为本发明优选的技术方案，所述引物组的序列如下表1所示(且将表中序列标号为SEQ ID NO.20～36)：

表1

其中，M选自碱基A或C，S选自碱基C或G，R选自碱基A或G，K选自碱基T或G，W选自碱基A或T，Y选自碱基C或T；

B选自碱基T、C或G，V选自碱基A、C或G，D选自碱基A、T或G，H选自碱基A、T或C；N选自碱基A、G、C或T；

第二方面，本发明还提供一种用于分析B细胞受体互补决定区3序列的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的引物组。

第三方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的引物组扩增B淋巴细胞免疫组库的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取样本中的RNA；

(2)将步骤(1)中所得的RNA和所述引物组中的反向引物混合，进行逆转录合成得到cDNA；

(3)以步骤(2)所得的cDNA为模板，加入所述引物组中的正向引物，进行多重PCR扩增，纯化回收后得到PCR产物；

(4)对所述PCR产物添加测序索引和接头得到BCR文库，纯化；

(5)对所述BCR文库进行定量分析和测序，确定CDR3区域的起始和结束位置，分析CDR3区域的长度分布及氨基酸使用偏好。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述样本包括IgA肾病患者的血液样本。

优选地，步骤(2)所述逆转录的反应体系中还包含RNase抑制剂、逆转录酶和dNTPs。

优选地，步骤(2)所述逆转录的反应体系中，反向引物的总摩尔浓度为10～12mM。

优选地，步骤(2)所述逆转录的反应程序为：42℃孵育1h，然后在70℃加热失活5min，4℃下保存。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述多重PCR的反应程序为：95℃初始变性15min，然后在94℃变性15s，60℃退火3min，在72℃延伸5min，4℃下保存。

优选地，步骤(3)所述多重PCR的反应体系中，所述正向引物的总摩尔浓度为10～12mM。

作为本发明优选的技术方案，步骤(4)所述添加测序索引和接头的反应条件为：98℃预热1min，然后分别在98℃下20s、65℃下30s和72℃下30s进行25个循环，最终在72℃下延伸7min。

优选地，步骤(5)所述定量分析和测序方法为：用Agilent 2100生物分析仪和Qubit 2.0对所述BCR文库进行定量分析，然后用Illumina测序仪进行测序。

作为本发明优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：

(1)提取IgA肾病患者样本中的RNA；

(2)将步骤(1)中所得的RNA、所述引物组中的反向引物、RNase抑制剂、逆转录酶和dNTPs混合，其中，反向引物的总摩尔浓度为10～12mM，42℃孵育1h，然后在70℃加热失活5min进行逆转录，合成得到cDNA；

(3)以步骤(2)所得的cDNA为模板，加入所述引物组中的正向引物，所述正向引物的总摩尔浓度为10～12mM，按照95℃初始变性15min，然后在94℃变性15s，60℃退火3min，在72℃延伸5min的程序进行多重PCR扩增，纯化回收后得到PCR产物；

(4)将所述PCR产物、测序索引和接头混合，98℃预热1min，然后分别在98℃下20s、65℃下30s和72℃下30s进行25个循环，最终在72℃下延伸7min，得到BCR文库，纯化；

(5)用Agilent 2100生物分析仪和Qubit 2.0对所述BCR文库进行定量分析，然后用Illumina测序仪进行测序，确定CDR3区域的起始和结束位置，分析CDR3区域的长度分布及氨基酸使用偏好。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供一种用于扩增B淋巴细胞免疫组库的引物组，利用所述引物组对IgAN患者的B淋巴细胞免疫组库信息进行扩增，该引物组的扩增片段覆盖率较高，特异性和灵敏度较好，减少扩增过程中二级结构的产生；

(2)本发明应用免疫全谱测序技术系统分析了所有B细胞受体(BCR)的CDR3序列，有助于评估抗体CDR3的长度分布、多样性、各亚型的百分率以及不同类型之间CDR3序列的重叠，特别是在IgA、IgG和IgM在IgAN患者和正常对照组中的表达，所得结果为临床IgAN患者的治疗提供更多理论依据。

附图说明

图1为IgA在IgAN和对照组中的平均氨基酸使用偏好示意图，其中A图为IgAN，B图为对照组。

图2为All、IgA、IgG和IgM的d50指数、标准化Shanon熵、Simpson和Gini在IgAN和对照组中的盒形图。

图3为IgAN和对照组的中每种抗体同型的百分比方框图。

图4为13例患者和7例正常对照者不同抗体类型的组成盒形图，其中A图表示IgA的含量、B图表示IgG的含量、C图表示IgM的含量。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

本实施例中提供一种扩增IgAN患者B淋巴细胞免疫组库信息的方法。

1、患者招募和筛选

本实施例收集了13例IgAN患者的全血样本和肾活检样本，年龄在22至62岁之间(中位数为26)，同时招募了7名正常人。根据WHO推荐的方法，对主要成分进行血、尿分析和肾活检。本研究依据深圳市南山医院内分泌科的指导方针，并经当地医学伦理委员会批准。所有患者均出具书面知情同意书。

2、PBMC分离

用等量的PBS稀释10mL血液，小心地装载到5mL淋巴准备液样本体积与淋巴准备培养基的比例为2:1，所用试剂均购自Axis shield，Dundee，Scotland，UK；600g离心20min；

将样品中PBMC层小心地抽吸并转移到新的试管中，用PBS在300g下洗涤两次，持续10min，得到纯化后的PBMC细胞，备用。

3、RNA提取

使用Qiagen RNeasy微型试剂盒(德国希尔登市恰根)提取总RNA，具体操作步骤根据该试剂盒的说明书进行；

具体操作步骤如下：

将约5×10

4、引物设计

从IMGT下载人免疫球蛋白重链基因序列(http://www.imgt.org/)。选择IGHVCDR3上游3框区相对保守的区域作为推测的前引物区，设计了12个与大多数V基因序列家族相对应的正向引物；

同样的，本发明中还设计了5个与抗体恒定区的同型(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)相对应的5个反向引物。同时，用Oligo 7.0和MFEprimer-2.0软件对正、反向引物进行二聚体和环结构分析。

5、引物和PCR扩增验证

为了制备BCR文库，首先将12个正向引物和5个反向引物分别等体积混合，制备BCR正向引物库和BCR反向引物库；正向引物池和反向引物池的最终浓度设置为10mM。

(1)使用第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher)合成的互补DNA(cDNA)，具体过程如下：

混合10mL提取得到的RNA和2mL的10mM反向引物，并在65℃下变性5分钟，立即在冰上冷冻；再将4mL 5×反应缓冲液、2mL 10mM dNTP、1mL RNase抑制剂和1mL逆转录酶添加到混合物中，使最终反应体系的体积为20mL；反应在42℃孵育1h，然后在70℃失活5min，在4℃下保持得到逆转录(RT)产物；

(2)RT产物随后用于多重PCR(多重PCR反应试剂盒购自德国Hilden Qiagen)，具体过程如下：

在PCR管中加入25mL 2×Qiagen多重PCR母液、5mL 5×Q-溶液、2mL BCR正向引物池和18mL RT产物，得到50mL反应体系中；95℃初始变性15min，然后在94℃变性15s，60℃退火3min，在72℃延伸5min，4℃下保存。

(3)PCR产物用磁珠进行纯化，纯化操作参考磁珠的使用说明书所记载的步骤进行：

磁珠预先在室温下平衡30分钟，在每个PCR管中加入PCR产物，并在室温下孵育5min，而后分离，再用80％的乙醇清洗珠子以去除污染物，最后用蒸馏水洗脱DNA片段并转移到新的试管中；

(4)在第二轮PCR中，测序索引(index)和接头(Adaptor)被添加到BCR文库中：

在50mL体系中添加25mL2×phusion混合物、1mL P1 Adaptor、1mL index和23mL来自上一步的纯化DNA。

PCR条件为98℃1min，然后分别在98℃下20s、65℃30s和72℃30s25个循环，最终在72℃下延伸7min。

(5)所得BCR文库用QIAquick凝胶提取试剂盒(德国希尔登，Qiagen)分离并清洗；用Agilent 2100生物分析仪和Qubit 2.0(Thermo Fisher)对文库进行定量分析，然后用Illumina测序仪进行测序。

实施例2

本实施例对实施例1中制备得到的BCR文库进行数据分析。

Illumina序列器共生成18,976,912对end reads，使用FLASH软件合并重叠的成对末端读取，得到16,376,727个原始reads；

使用IgBLAST将合并的序列读数与V、D和J基因种系参考进行比对，并将恒定区域分别映射到IgA、IgD、IgE、IgG和IgM上；

从IMGT中获得V、D和J基因种系的参考序列，排除与生殖系参考系同源性低(<70％)的reads，经过过滤后，获得11,114,426个reads，以供进一步分析；

根据IMGT的定义，确定了CDR3区域的起始和结束位置、阅读框架和生产力。通过软件MixCR，分析IgAN样本的过度表达水平。用归一化Gini、Shannon熵、Simpson和G50指数评价抗体库的多样性，采用非配对双尾t检验计算IgAN与NC控制之间的p值。

实施例3

本实施例中分析了IgAN和正常候选(NC)群中CDR3的长度分布。IgAN和NC文库按照实施例1中记载的方法进行构建，其数据分析方法按照实施例2中记载的方法进行分析。

(1)分析IgAN和NC群中CDR3的长度分布

结果表明，IgAN组CDR3氨基酸长度明显短于NC组。其中，此外，IgAN CDR3中富含的氨基酸序列前10位(SEQ ID NO.37～46)与NC组的前10位(SEQ ID NO.47～56)的具体序列如下表2所示：

表2

其中，IgAN中氨基酸长度在5～9aa左右，NC组的长度在11～15左右，IgAN组的前10个氨基酸序列的CDR3长度明显短于对照组。

此外，图1显示了IgAN(A图)与对照组(B图)中氨基酸使用偏好的差异；同时，IgAN中CDR3序列平均长度的缩短也影响了IgAN中CDR3序列的多样性，从而降低了IgAN的免疫应答能力。

(2)IgAN的克隆多样性分析

为了验证CDR3长度的减少是否影响IgAN的多样性，本实施例中利用D50指数、Shannon熵、Simpson T和Gini检验等一系列统计模型，系统地评价了IgAN和NC中CDR3序列的多样性。

免疫反应谱的多样性通常可以部分地反映出适应性免疫反应的效率。本实施例中计算了所有亚型(样本ID“all”)和三种主要的同种类型(包括IgM、IgG和IgA)的指数。

D50指数是计算出的优势唯一克隆的百分比，其累计读取量占CDR3序列总数的50％。它与多样性有着直接而积极的关系。数据表明IgAN的多样性显著降低。通过标准化、Shannon熵和Gini检验也得到了类似的结果。但Simpson T检验结果显示，两组间差异不显著。与Shannon熵关注单个序列在一个样本中的一致性相比，Simpson T检验通常由显性克隆决定。

(3)为了阐明不同亚型抗体的多样性是如何受到影响的，本实施例中对三种最丰富的抗体进行了统计分析，包括IgA、IgG和IgM(IgE和IgD在PBMC中非常罕见)。

所得结果如图2所示，IgAN患者的多样性显著低于NC组，尤其是IgA和IgG。由于原发性B细胞只表达IgM，lgM多样性的降低反映了lgAN患者原发性B细胞多样性的降低，提示lgAN患者免疫应答能力降低。

此外，在IgA和IgG亚型中，D50指数甚至下降到0.1左右，这表明在lgAN中主要表达的克隆更少。IgM、IgG和IgA在IgAN中的表达模式均发生了畸变，所有亚型的多样性降低可能是由于IgG和IgA的克隆扩展受到限制，而IgA和IgA的克隆扩展可以特别针对IgAN中的改变结构，如糖基化IgA1。由于IgM也受到影响，提示lgAN中克隆多样性的改变可能在抗体遇到抗原之前就开始了，之后会进一步扩大。

(3)IgA和IgG亚型在IgAN中的百分比升高

通过以上多样性分析，发现IgA、IgG和IgM的总体多样性在IgAN中显著降低，这可能是由于白细胞总数的减少造成的。

为了揭示lgAN的详细机制，本实施例中检查了IgAN和NC样本中每个抗体亚型的百分比。

如图3所示，与对照组NC相比，IgAN中IgA和IgG基因的相对表达显著：

IgAN：IgA中值：0.45(0.24-0.69)，IgG中值：0.36(0.16-0.55)；

对照：IgA中值：0.23(0.05-0.42)，IgG中值：0.14(0.06-0.220)。

而IgM在患者中的表达水平降低：

IgAN：IgM中位数：0.17(0.06-0.33)；

对照：IgM中位数：0.80(0.40-0.80)。

由此推测，更多的IgM可能是由于lgAN中某些关键因素的功能障碍而转为IgA或IgG。

如图4图所示，其中A图表示IgA的含量(p值为0.026)，B图表示IgG的含量(p值为0.007)，C图表示IgM的含量(p值为0.003)，由图可知，IgA和IgG增加近2.5倍，IgM减少3倍。

由于各亚型在维持原发性免疫状态和免疫应答中的重要作用，因此以上数据表明，lgAN患者的免疫状态和免疫应答可能发生很大变化。

(4)不同抗体亚型间存在重叠CDR3序列

由于IgA和IgG在遇到抗原后从IgM中转换，本实施例中进一步通过IgA和IgM、IgA和IgG以及IgA和IgG和IgM三种亚型之间的组合，比较了IgAN组和NC组不同抗体亚型共有的CDR3基因序列。

所有的原始B细胞只表达IgM，当B细胞遇到抗原时，一些IgM可以转化为IgA和IgG。

本实施例中，观察到IgAN中IgM和IgA共享CDR3序列的百分率显著高于对照组(IgAN为6.8％，对照为1.5％)。IgAN中的共享序列增加了4倍以上。IgM/IgG/IgA中常见的CDR3也增加了7倍以上(IgAN为3.6％，对照为0.5％)。

这些结果表明，B细胞可能在IgAN中被过度激活，这可能是由IgAN中的抗原诱导的。这些共享的CDR3序列只在IgAN中表达，可以使特异性靶向IgAN的抗体池最小化。

本发明中，应用免疫排序技术对13例IgAN患者和7例正常人B细胞受体CDR3区进行了平行分析，包括IgA、IgG、IgM、IgE和IgD五种抗体亚型。与对照组相比，IgAN组CDR3长度明显减少。然而，在IgAN中有更多的高度扩增的克隆，几乎是对照的两倍，在IgAN中氨基酸的使用也表现出不同的规律。同时，Shannon熵、d50和Gini试验等多项统计指标均显示IgG、IgM和IgA抗体的多样性与对照组相比存在显著差异。IgA和IgG百分率升高，IgAN中IgM下降。

综上所述，本发明提供了一种用于扩增B淋巴细胞免疫组库的引物组，利用其扩增IgAN患者的B淋巴细胞，能够研究IgAN中BCR免疫系统的显著变化，通过对所得文库的分析，本发明中发现，IgAN中BCR免疫系统发生了显著的改变，其特征是CDR3长度缩短，CDR3的总体多样性降低。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方科技大学

<120> 一种用于扩增B淋巴细胞免疫组库的引物组及其应用

<130> 20200929

<160> 56

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtcacca tgaccacaga c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agagtcacca kkaccaggga c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agagtcacca tgaccgagga c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agagtcacca ttacyaggga c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

agagtcacga twaccrcgga c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

agagtcacca tgaccaggaa c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

accaggctca ccatywccaa gg 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ggccgattca ccatctcmag 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cgagtcacca trtcmgtaga c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cagccgacaa gtccatcagc 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

agtcgaataa ccatcaaccc ag 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gacggtttgt cttctccttg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gggaattctc acaggagacg 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gaagacggat gggctctgt 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

gggtgtctgc accctgata 19

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gctcagcggg aagacct 17

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

agggygccag ggggaag 17

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

cagacgtgtg ctcttccgat ctag 24

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ctacacgacg ctcttccgat ct 22

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 20

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnagagtcac catgaccaca gac 53

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 21

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnagagtcac cakkaccagg gac 53

<210> 22

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 22

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnagagtcac catgaccgag gac 53

<210> 23

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 23

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnagagtcac cattacyagg gac 53

<210> 24

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 24

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnagagtcac gatwaccrcg gac 53

<210> 25

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 25

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnagagtcac catgaccagg aac 53

<210> 26

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 26

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnaccaggct caccatywcc aagg 54

<210> 27

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 27

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnggccgatt caccatctcm ag 52

<210> 28

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 28

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nncgagtcac catrtcmgta gac 53

<210> 29

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 29

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nncagccgac aagtccatca gc 52

<210> 30

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 30

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnagtcgaat aaccatcaac ccag 54

<210> 31

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 31

cagacgtgtg ctcttccgat ctagnnnnnn nnagtcgaat aaccatcaac ccag 54

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(30)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 32

ctacacgacg ctcttccgat ctnnnnnnnn gggaattctc acaggagacg 50

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(30)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 33

ctacacgacg ctcttccgat ctnnnnnnnn gaagacggat gggctctgt 49

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(30)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 34

ctacacgacg ctcttccgat ctnnnnnnnn gggtgtctgc accctgata 49

<210> 35

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(30)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 35

ctacacgacg ctcttccgat ctnnnnnnnn gctcagcggg aagacct 47

<210> 36

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(30)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 36

ctacacgacg ctcttccgat ctnnnnnnnn agggygccag ggggaag 47

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 37

Thr Ile Met Glu Ser

1 5

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 38

Ala Arg Pro Ile Gly Gly Ser

1 5

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 39

Gly Gly Thr Ser Asn Gly Trp His Glu Ile Asp Ser

1 5 10

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 40

Ala Ser Gly Gln Gln Leu Gly His

1 5

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 41

Ala Thr Gly Gln Gln Leu Gly Tyr

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 42

Ala Pro Gly Arg Gln Leu Gly Asp Tyr

1 5

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 43

Ala Met Gly Met Asn Ser Gly Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 44

Gly Gly Thr Met Asn Gly Trp His Glu Ile Glu Ala

1 5 10

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 45

Ala Ile Gly Ser Gly His Phe Gln His

1 5

<210> 46

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 46

Val Arg Asp Asp Ser Trp Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 47

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 47

Ala Arg Trp Asp Cys Ser Arg Thr Ser Cys His Gln Phe Asp Gln

1 5 10 15

<210> 48

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 48

Ala Arg Asp Arg Gly Arg Trp Tyr Gln Leu Leu Tyr Asp Pro Leu Asp

1 5 10 15

Val

<210> 49

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 49

Ala Arg Tyr Val Val Leu Ser Pro Ala Leu Gly Gly Ser Arg Leu Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 50

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 50

Pro Lys Ile Gly Phe Gly Tyr Ser Tyr Gly Gly Gly Leu Asp Val

1 5 10 15

<210> 51

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 51

Ala Lys Asp Arg Ser Pro Arg Tyr Asp Val Met Thr Gly Gly Leu Asp

1 5 10 15

Ser

<210> 52

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 52

Ala Arg Tyr Ile Val Glu Ser Pro Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 53

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 53

Ala Arg Arg Lys Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Asp Asp Tyr

1 5 10

<210> 54

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 54

Ala Arg Arg Ile Ser Ser Thr Gly Arg Ser Ser Ala Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 55

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 55

Ala Arg Ser Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys His Ala Thr Gly Tyr Phe

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 56

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 56

Ala Arg Tyr Ile Val Glu Gln Pro Ala Ala His Phe Asp His

1 5 10