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水稻ACCase突变型基因及其蛋白在植物抗除草剂中的应用

文献发布时间：2023-06-19 10:02:03

技术领域

本发明涉及水稻ACCase突变型基因及其蛋白在植物抗除草剂中的应用，属于植物基因工程和植物抗除草剂育种领域。

背景技术

乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是植物中脂肪酸从头合成途径中的限速酶，在质体内参与以乙酰辅酶A为前体生成丙二酰辅酶A的过程。ACCase由三部分组成，即生物素羧基载体蛋白(BCCP)、生物素羧化酶(BC)和羧基转移酶(CT)。由于ACCase对植物的正常生长发育具有关键作用，因此，农药公司以ACCase为靶标，开发研制了一系列除草剂，在市场推广至今。

ACCase是植物脂肪酸生物合成的关键酶，它催化ATP依赖乙酰辅酶A羧化作用诱导脂肪酸与类黄酮生物合成中的一种关键代谢产物——丙二酸单酰辅酶A，这是植物中脂肪酸生物合成的首要关键步骤，然后在脂肪酸合成酶作用下形成脂肪酸。若丙二酸单酰辅酶A的合成停止，则对ACCase的抑制将使植物丧失这种中间产物，导致膜结构的破坏，透性增强，细胞破坏。

ACCase抑制剂类除草剂对谷类作物和双子叶作物田中的禾本科杂草均有极强的防效，在全世界广泛使用，从而导致了抗ACCase抑制剂杂草的发生。由于化学除草剂的广泛使用，杂草抗性发生速度如此之快、范围如此之广，不但增加了除草成本，也增加了环境压力。

ACCase同乙酰乳酸合成酶(ALS)和多酚氧化酶(PPO)一样是高效除草剂的靶标酶，针对该靶标的除草剂主要有芳氧苯氧基丙酸类(AOPP)和环己烯酮类(CHD)除草剂，它们对双子叶植物有高度的选择性，而且具有低的哺乳动物毒性和良好的环境特性，受到越来越多的关注。AOPP类除草剂是一类著名的防除禾本科杂草的高活性除草剂，也是一类发展比较迅速、不断开发出新品种的除草剂类型。该类除草剂最早是在20世纪60年代开始研究。目前商品化的AOPP类除草剂有禾草灵、稳杀得、高效盖草能、精禾草克、恶草醚、精喹禾灵等。该类除草剂存在立体异构，而且这种异构体中只有右旋体对ACCase有显著活性。

由于化学除草剂的广泛使用，杂草抗性发生的速度如此之快、范围如此之广，不但增加了除草成本，也增加了环境压力。目前，对抗性杂草种群形成的原因有两种观点：一种认为杂草长期与除草剂接触，而使除草剂作用部位的编码基因发生突变或者基因表达发生改变，结果导致杂草对除草剂的解毒能力提高或者对除草剂具有耐药性或抗药性的种群。总的来说，杂草抗性的形成，基本上是一个抗性基因被选择的过程，抗药性基因的遗传是杂草产生抗药性的基础。之前的报道认为，抗药性的产生不仅是由于植物改变了对除草剂的吸收与转运或植物加速了除草剂的代谢，且主要是因为除草剂的作用部位发生了改变。相当一部分杂草通过靶标酶ACCase的变化来解除或减少其与除草剂的亲和性而获得抗性。瑞士黑麦草对禾草灵的抗性是由于部分ACCase基因突变造成。

目前，还没有研究报道水稻中的ACCase位点突变后可以用于抗精喹禾灵和盖草能等除草剂。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种可以赋予植物抗除草剂抗性的突变型蛋白。进一步地，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶A羧化酶类除草剂抗性的水稻ACCase突变型蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供一种编码水稻ACCase突变型蛋白的核酸或基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的突变型基因或核酸。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的蛋白，所述的突变型基因或核酸，所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定植物的方法。

技术方案：本发明提供了水稻ACCase突变型蛋白，所述突变型蛋白的氨基酸序列对应于野生型水稻ACCase的氨基酸序列的第2010位和/或2099发生突变。

作为优选，所述突变型蛋白的氨基酸序列的第2010位由色氨酸突变为亮氨酸和/或2099位由半胱氨酸突变为精氨酸。

优选地，本发明的水稻ACCase的氨基酸序列第2010位氨基酸突变为除了亮氨酸之外的其它氨基酸并且第2099位氨基酸突变为除了精氨酸之外的其它氨基酸。

优选地，本发明的ACCase突变型蛋白发生突变的氨基酸包括但不仅限于上述几种突变，在上述位点突变成其他氨基酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：第2010位氨基酸由色氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、精氨酸；第2099位氨基酸由半胱氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、精氨酸。

本发明所述的水稻ACCase突变型蛋白，包括：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明内容还包括水稻ACCase突变型基因，其编码所述的突变型蛋白。

进一步地，本发明的水稻ACCase突变型基因在水稻ACCase基因的第6029位核苷酸发生突变和/或第6295位核苷酸发生突变。

作为优选，本发明的水稻ACCase突变型基因，所述水稻ACCase基因在水稻ACCase基因的第6029位核苷酸由G突变为T和/或第6295位核苷酸由T突变为C。

进一步地，本发明的水稻ACCase突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：3所示。

进一步地，本发明的水稻ACCase突变型基因还包括在严格条件下与限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；

本发明的ACCase突变型基因发生突变的核苷酸包括但不仅限于上述突变，在上述位点突变成其他核苷酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：G突变为C、A等均在本发明的保护范围之内。

本发明还提供一种表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的核酸或基因。

本发明还提供所述的水稻ACCase突变型蛋白、核酸或基因，表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。

进一步地，本发明的除草剂包括但不仅限于盖草能或精喹禾灵。

其中，本发明的除草剂还包括烯草酮、氰氟草酯、禾草灵、精氟吡禾草灵、禾草灭、烯禾啶、笨草酮、芳氧苯基环己二酮、三酮类环己二酮、拿扑净中的一种或多种。

本发明还提供获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述核酸或基因；或

2)使植物表达所述水稻ACCase突变型蛋白。

进一步地，所述获得具有除草剂抗性的植物的方法包括转基因、杂交、或回交。

本发明还提供一种鉴定植物的方法，其中所述植物是包含所述的核酸或基因的植物、表达所述的蛋白的植物或由所述的方法获得的植物，包括以下步骤：

1)测定所述植物是否包含所述的核酸或基因；或，

2)测定所述植物是否表达所述的突变型蛋白。

本发明还提供一种除草剂的防护剂，该防护剂包括所述的水稻ACCase突变型蛋白。

本发明还提供一种控制杂草的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述植物包含所述的核酸或基因或所述的表达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为精喹禾灵和盖草能中的一种或两种。

本发明还提供一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述植物包含所述的核酸或基因或将所述的表达盒、重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为精喹禾灵和盖草能中的一种或两种。

进一步地，本发明的野生型基因来源于水稻的禾广丝苗。

进一步地，本发明的禾广丝苗的野生型植株不具有盖草能或精喹禾灵除草剂抗性，本发明的含有ACCase突变位点的转基因植株能赋予水稻植物增加对乙酰辅酶A羧化酶类除草剂的耐受性。

其中，本发明的水稻禾广丝苗的ACCase突变型突变型基因序列的编号及其对应的核苷酸和氨基酸序列分别是：禾广丝苗的ACCase基因的第6029位核苷酸由G突变为T，2010位氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，其氨基酸序列如SEQID No：2所示；

此外，另一个禾广丝苗的ACCase突变基因的第6029位核苷酸由G突变为T、第6295位核苷酸由T突变为C，其蛋白在2010位氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，2099位氨基酸由半胱氨酸突变为精氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNo：4所示；

本发明还提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法。进一步地，本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞对于至少一种除草剂的耐受性的方法，所述除草剂干扰ACCase酶的活性。因此，本发明中除草剂抗性指的是抗(耐)乙酰辅酶A羧化酶类除草剂。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株包括本发明的核苷酸序列SEQ ID No：1和SEQ ID No：3中的一种。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株表达本发明的氨基酸序列SEQ ID No：2和SEQ ID No：4中的一种。

本发明还提供了耐受除草剂的水稻植物，其表达含有抗除草剂突变位点的ACCase基因，该基因序列不同于野生型水稻植物的ACCase基因序列，是ACCase基因含有抗除草剂突变位点的序列。

通过该方法获得的上述携带有突变位点的水稻ACCase突变序列的方法也在本发明的保护范围之内，将所述水稻ACCase突变序列转入到野生型水稻品种，发现携带有所述ACCase突变位点的转基因水稻可以抗ACCase类除草剂，而野生型水稻对ACCase类除草剂表现敏感。

本发明还提供了所述核酸或基因及蛋白在植物育种中的应用，用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还提供了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等植物中的应用。

本发明所述的农作物包括但不仅限于水稻，还可以包含其他的农作物。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：

1)本发明首次通过实验研究得出野生型水稻为籼型常规水稻种子禾广丝苗的水稻ACCase的氨基酸序列的第2010位发生突变，该基因突变得到的突变型蛋白对除草剂具有显著的抗性功能，特别是乙酰辅酶A羧化酶类除草剂。

2)本发明通过实验研究得出野生型水稻为籼型常规水稻种子禾广丝苗的水稻ACCase的氨基酸序列的第2010位和第2099位发生突变，该基因突变得到的突变型蛋白对除草剂具有显著的抗性功能，特别是乙酰辅酶A羧化酶类除草剂。

3)将ACCase突变序列转入到野生型水稻中，转基因水稻获得了ACCase酶类除草剂抗性。在田间喷施ACCase抑制剂类除草剂盖草能的实验结果表明，含有本发明的水稻ACCase突变蛋白的转基因水稻在施用4倍推荐使用浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型水稻幼苗在施用1倍推荐使用浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂后，植株生长逐渐停止，叶片逐渐失绿、变浅黄色，植株不能拔节，最终整株死亡。

4)在田间喷施ACCase抑制剂类除草剂精喹禾灵的实验结果表明，含有本发明的水稻ACCase突变蛋白的转基因水稻正常生长，而野生型水稻则死亡。

附图说明

图1、抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂突变体HGJK-3植株；

图2、抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂突变体HGJK-4植株；

图3、PCR扩增含有水稻ACCase突变位点的ACCase基因全长结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为15kb、8kb、5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp，第2泳道为野生型禾广丝苗的ACCase的DNA，第3泳道为突变体HGJK-3植株的ACCase的DNA，第4泳道为突变体HGJK-4植株的ACCase的DNA；

图4、突变型ACCase基因水稻PCR检测图；总共有5个泳道，第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为15kb、8kb、5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp；第2泳道为野生型禾广丝苗的ACCase的DNA，第3泳道为重组质粒的PCR扩增产物，第4泳道为转化含有ACCase-6029抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株的PCR扩增产物，第5泳道为转化含有ACCase-6029和ACCase-6295抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株的PCR扩增产物。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1水稻M3突变体抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂(精喹禾灵)

将粳型常规水稻种子禾广丝苗(江苏省农业种质资源保护与利用平台惠赠，此为M0，用清水浸泡2小时)150kg分6次用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS)室温下浸泡6-9小时，期间每1小时摇动一次种子；弃去EMS溶液，自来水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后用自来水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规肥水管理(此为M1)。植株成熟后，种子混收、晾干，过冬保存。次年播种田间。待水稻(此为M2)幼苗长至3-4叶期时，喷施1mL精喹禾灵/L水，30天后还呈正常绿色植株即为抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂的水稻突变体(图1)。将禾广丝苗抗除草剂突变体收获的种子播种出苗(此为M3)，待M3水稻幼苗长至3-4叶期时，喷施1mL精喹禾灵/L水(4倍推荐浓度)。喷施除草剂15天后，抗性苗M3呈正常绿色、能继续长高至20-30cm，而非抗性苗叶片失去绿色甚至部分枯黄，植株不长高，只有5-9cm。30天后，M3抗性株均呈正常绿色植株，而喷施同样浓度除草剂的野生型水稻都已全部枯死，而突变体的存活率在90.8％，表明突变水稻能够抗4倍推荐浓度的精喹禾灵除草剂。伤害比率为1-存活率。同时，我们又对ACCase类除草剂盖草能(1mL盖草能/L水)敏感性进行实验，发现突变体也可以抗盖草能除草剂(表1)。

表1除草剂对野生型和HGJK-3突变体的伤害比率

实施例2：水稻镇糯19号野生型Accase全长基因的获得

选取禾广丝苗野生型植株的叶片，提取基因组DNA，根据NCBI中日本晴ACCase基因(NCBI：XM_015783727)设计引物进行扩增，采用KOD DNApolymerase聚合酶(购自Toyobo公司)扩增ACCase基因，其反应体系如下：

PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。

程序如下：预变性：94℃3min；35个循环：变性94℃10sec；延伸68℃10min；保温：72℃10min。

取2μl PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图3)，剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收后，克隆至pMD19-T载体(购自Takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行PCR检测，取PCR结果呈阳性的6个单克隆，送南京一道生物科技有限公司测序，获得野生型ACCase基因序列，该基因片段长度为6984bp，禾广丝苗野生型ACCase序列全长基因片段的测序结果如下：

实施例3：水稻抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂突变体HGJK-3突变位点分析

将获得的抗除草剂水稻突变植株HGJK-3选取叶片并提取基因组DNA，分别将野生型水稻禾广丝苗和水稻突变植株HGJK-3的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件同实施例2，扩增结果如图3。同时送南京一道生物科技有限公司进行测序。测序结果与禾广丝苗野生型ACCase基因比较，发现在ACCase基因上发生了1个位点的突变，第6029位点碱基发生突变，由G变成T，导致其相应编码的氨基酸序列的第2010位点由色氨酸变为亮氨酸，即抗除草剂突变体的ACCase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的ACCase蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。此水稻突变体其分类命名为水稻种子HGJK-3(Oryza sativa Indica Group HGJK-3)，该菌株已于2020年9月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为CCTCC No：P202012。

实施例4：水稻抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂突变体HGJK-4突变位点分析

将上述抗乙酰辅酶A羧化酶类突变体HGJK-3进行二次诱变，用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS)室温下浸泡6-9小时，期间每1小时摇动一次种子；弃去EMS溶液，自来水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后用自来水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规肥水管理(此为M1)。植株成熟后，种子混收、晾干，过冬保存。次年播种田间。待水稻(此为M2)幼苗长至3-4叶期时，喷施1mL精喹禾灵/L水，30天后还呈正常绿色植株即为抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂的水稻突变体HGJK-4(图2)。将HGJK-4抗除草剂突变体收获的种子播种出苗(此为M3)，待M3水稻幼苗长至3-4叶期时，喷施1mL精喹禾灵/L水(4倍推荐浓度)。喷施除草剂15天后，抗性苗HGJK-4的存活率要比HGJK-3高2.8％。同时，我们对突变体HGJK-4对盖草能的敏感性进行实验，发现HGJK-4的存活率要比HGJK-3突变体高2.7％。

通过提取HGJK-4的基因组DNA，分别将野生型水稻禾广丝苗和水稻突变植株HGJK-3的基因组DNA以及HGJK-4的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件同实施例2，扩增结果如图3，同时送南京一道生物科技有限公司进行测序，测序结果与HGJK-3的ACCase基因比较，发现除了在第6029位点碱基发生突变由G变成T之外，在第6295位点碱基由T变为C，导致其相应编码的氨基酸序列第2010位点由色氨酸变为亮氨酸和第2099位点由半胱氨酸变为精氨酸，即抗除草剂突变体的ACCase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的ACCase蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。此水稻突变体其分类命名为水稻种子HGJK-04(Oryza sativa Indica Group HGJK-04)，该菌株已于2020年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：P202013。

表2除草剂对野生型和HGJK-3突变体和HGJK-4突变体的伤害比率

实施例5：转基因ACCase水稻抗精喹禾灵除草剂

设计特异引物5’-

表3乙酰辅酶A羧化酶类除草剂对野生型和转基因水稻的伤害比率

序列表

<110> 江苏省农业科学院江苏中旗作物保护科技有限公司

<120> 水稻ACCase突变型基因及其蛋白在植物抗除草剂中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6984

<212> DNA

<213> 水稻禾广丝苗ACCase-6029突变核苷酸序列(Oryza sativa)

<400> 1

atgacatcca cacatgtggc gacattggga gttggtgccc aggcacctcc tcgtcaccag 60

aaaaagtcag ctggcactgc atttgtatca tctgggtcat caagaccctc ataccgaaag 120

aatggtcagc gtactcggtc acttagggaa gaaagcaatg gaggagtgtc tgattccaaa 180

aagcttaacc actctattcg ccaaggtctt gctggcatca ttgacctccc aaatgacgca 240

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ataaatgcag agcacatcag aattgccgat caatttgtag aggtacctgg tggaacaaac 600

aacaacaact atgcaaatgt ccaactcata gtggagatag cagagagaac aggtgtttct 660

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gcttgtgtta ctaccacaga ggaagcagtt gcaagttgtc aggtggttgg ttatcctgcc 960

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gggtttaagc ctactggtgg aaaagtaaag gagataagtt tcaagagtaa accaaatgtt 1680

tgggcctatt tctcagtaaa gtctggtgga ggcatccatg aattcgctga ttctcagttc 1740

ggacatgttt ttgcgtatgg aactactaga tcggcagcaa taactaccat ggctcttgca 1800

ctaaaagagg ttcaaattcg tggagaaatt cattcaaacg tagactacac agttgaccta 1860

ttaaatgcct cagattttag agaaaataag attcatactg gttggctgga taccaggata 1920

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tataaaacag taactgccaa cacggccact gtttctgatt atgttggtta tcttaccaag 2040

ggccagattc caccaaagca tatatccctt gtctatacga ctgttgcttt gaatatagat 2100

gggaaaaaat atacaatcga tactgtgagg agtggacatg gtagctacag attgcgaatg 2160

aatggatcaa cggttgacgc aaatgtacaa atattatgtg atggtgggct tttaatgcag 2220

ctggatggaa acagccatgt aatttatgct gaagaagagg ccagtggtac acgacttctt 2280

attgatggaa agacatgcat gttacagaat gaccatgacc catcaaagtt attagctgag 2340

acaccatgca aacttcttcg tttcttggtt gctgatggtg ctcatgttga tgctgatgta 2400

ccatatgcgg aagttgaggt tatgaagatg tgcatgcccc tcttatcacc cgcttctggt 2460

gtcatacatg ttgtaatgtc tgagggccaa gcaatgcagg ctggtgatct tatagctagg 2520

ctggatcttg atgacccttc tgctgttaag agagctgagc cgttcgaaga tacttttcca 2580

caaatgggtc tccctattgc tgcttctggc caagttcaca aattatgtgc tgcaagtctg 2640

aatgcttgtc gaatgatcct tgcggggtat gagcatgata ttgacaaggt tgtgccagag 2700

ttggtatact gcctagacac tccggagctt cctttcctgc agtgggagga gcttatgtct 2760

gttttagcaa ctagacttcc aagaaatctt aaaagtgagt tggagggcaa atatgaggaa 2820

tacaaagtaa aatttgactc tgggataatc aatgatttcc ctgccaatat gctacgagtg 2880

ataattgagg aaaatcttgc atgtggttct gagaaggaga aggctacaaa tgagaggctt 2940

gttgagcctc ttatgagcct actgaagtca tatgagggtg ggagagaaag tcatgctcac 3000

tttgttgtca agtccctttt tgaggagtat ctctatgttg aagaattgtt cagtgatgga 3060

attcagtctg atgtgattga gcgtctgcgc cttcaacata gtaaagacct acagaaggtc 3120

gtagacattg tgttgtccca ccagagtgtt agaaataaaa ctaagctgat actaaaactc 3180

atggagagtc tggtctatcc aaatcctgct gcctacaggg atcaattgat tcgcttttct 3240

tcccttaatc acaaagcgta ttacaagttg gcacttaaag ctagtgaact tcttgaacaa 3300

acaaaactta gtgagctccg tgcaagaata gcaaggagcc tttcagagct ggagatgttt 3360

actgaggaaa gcaagggtct ctccatgcat aagcgagaaa ttgccattaa ggagagcatg 3420

gaagatttag tcactgctcc actgccagtt gaagatgcgc tcatttcttt atttgattgt 3480

agtgatacaa ctgttcaaca gagagtgatt gagacttata tagctcgatt ataccagcct 3540

catcttgtaa aggacagtat caaaatgaaa tggatagaat cgggtgttat tgctttatgg 3600

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tctgatgaaa agctttctta tgaggaagag ccaattctcc ggcatgtgga acctcctctt 4020

tctgcacttc ttgagttgga caagttgaaa gtgaaaggat acaatgaaat gaagtatacc 4080

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tcgggccaga ttggtgacat ggaagttggg agtgctgaag aacctctgtc atttacatca 4260

accagcatat taagatcttt gatgactgct atagaggaat tggagcttca cgcaattaga 4320

actggccatt cacacatgta tttgcatgta ttgaaagaac aaaagcttct tgatcttgtt 4380

ccagtttcag ggaatacagt tttggatgtt ggtcaagatg aagctactgc atattcactt 4440

ttaaaagaaa tggctatgaa gatacatgaa cttgttggtg caagaatgca ccatctttct 4500

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aggattgtaa caaccaatgt tactagtcac acttgcactg tggatatcta ccgtgagatg 4620

gaagataaag aatcacggaa gttagtatac catcccgcca ctccggcggc tggtcctctg 4680

catggtgtgg cactgaataa tccatatcag cctttgagtg tcattgatct caaacgctgt 4740

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tgttatgtta aagctacaga gttggtattt gcggacaaac atgggtcatg gggcactcct 4920

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gctgagagga ctgcaaaagg caatgttctg gaaccgcaag ggttaattga gatcaagttc 6360

aggtcagagg aactccagga ttgcatgagt cggcttgacc caacattaat tgatctgaaa 6420

gcaaaactcg aagtagcaaa taaaaatgga agtgctgaca caaaatcgct tcaagaaaat 6480

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gaattgcatg atacatccct cagaatggct gcgaaaggtg tgattaagaa agttgtggac 6600

tgggaagaat cacgatcttt cttctataag agattacgga ggaggatctc tgaggatgtt 6660

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Ser Ser Arg Pro Ser Tyr Arg Lys Asn Gly Gln Arg Thr Arg Ser Leu

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Arg Glu Glu Ser Asn Gly Gly Val Ser Asp Ser Lys Lys Leu Asn His

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Ser Ile Arg Gln Gly Leu Ala Gly Ile Ile Asp Leu Pro Asn Asp Ala

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Ala Ser Glu Val Asp Ile Ser His Gly Ser Glu Asp Pro Arg Gly Pro

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Thr Val Pro Gly Ser Tyr Gln Met Asn Gly Ile Ile Asn Glu Thr His

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Met Ala Ala Ala Lys Phe Met Arg Ser Val Arg Thr Trp Ala Asn Asp

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Met Ile Lys Ala Ser Trp Gly Gly Gly Gly Lys Gly Ile Arg Lys Val

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His Asn Asp Asp Glu Val Arg Thr Leu Phe Lys Gln Val Gln Gly Glu

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Pro Ile Ala Ala Ser Gly Gln Val His Lys Leu Cys Ala Ala Ser Leu

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Asn Ala Cys Arg Met Ile Leu Ala Gly Tyr Glu His Asp Ile Asp Lys

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Gly Asp Lys Arg Trp Gly Ala Met Val Ile Val Lys Ser Leu Glu Ser

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Thr Met Arg Arg Thr Phe Leu Trp Ser Asp Glu Lys Leu Ser Tyr Glu

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<212> DNA

<213> 水稻禾广丝苗ACCase-6029、6295突变核苷酸序列 (Oryza sativa)

<400> 3