用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂与方法

技术领域

本发明属于医学基因工程及分子遗传学领域，尤其涉及用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂与方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)主要通过接触受感染者的血液或其它液体传播，可引起急性和慢性肝脏疾病。绝大多数为慢性感染，其中约5％最终发展成肝硬化或肝癌，每年约有一百万人死于HBV感染引起的各种终末期肝病。而我国HBV感染人群的比例则更高，据不完全统计约10％-20％。

乙型肝炎病毒在繁殖的过程中其基因组核苷酸序列可发生变异，这种变异有时可导致病毒生物特性的变化。人群中存在着很多乙型肝炎病毒亚型，而这些亚型有的就是乙型肝炎病毒的变异株。目前国内通过基因测序可以检测的乙型肝炎病毒亚型为A、B、C、D、E、F、G、H 8个基因型。感染不同基因型的患者，临床治疗和预后均有不同，研究HBV基因分型，对于发现新的HBV基因型及开展流行病学调查治疗等方面具有重要作用。

细胞外乙型肝炎病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA(relaxed circularDNA，rcDNA)分子，其两条链均不是闭合的，其中负链较长，约3200个碱基，含有乙肝病毒基因组的全长基因，在其5’起始端与3’末端之间有一个数个碱基的“缺刻”(nick)；正链较短，有较大的“缺口”(gap)，其3’末端不固定，故长度是可变的，约为负链长度的50％～100％。在乙肝病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(covalently closed circularDNA，cccDNA)。cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。

目前全球主要国家推荐的停药标准实质上基于两个方面，一是HBsAg清除，二是持续性治疗应答。但现有停药标准在两个方面与此共识不协调。第一，以HBsAg清除为标准，并不能完整和准确地反映cccDNA的状况，主要原因之一是存在相当比例的患者存在HBV DNA整合情况，这导致HBsAg并不仅仅来源于cccDNA。第二，基于传统检测指标来定义的“持续治疗应答”也不能足够准确地反映cccDNA的状况，按照这些标准停药的患者中，有很高的复发比例。在临床实践中，第一方面的问题，导致原本可以停药的患者无法停药，第二方面的问题，导致不该停药的患者却错误地停止治疗。无疑，这些问题将导致社会资源浪费，损害患者福利。所以现在急需一种可以准确检测cccDNA状况和HBV DNA整合情况的检测方法。

目前市面上，HBV核酸检测技术主要包括聚合酶链式反应-限制性酶切片断长度多态性、Q-PCR以及PCR-反向点杂交法等。然而这些HBV核酸检测手段存在操作繁琐、通量低,无法检测HBV整合状态，无法检测HBV基因型及判定结果不确定等缺点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种成套探针组。

本发明提供的成套探针组，其由80条探针组成；

所述80条探针为如下A1)-A3)中任一种：

A1)所述80条探针分别为序列表中序列1至序列80所示的探针；

A2)所述80条探针分别为序列表中序列1第16-135位至序列80中的第16-135位所示的探针；

A3)将A1)或A2)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。

每条探针对应一条序列。

上述成套探针组中，所述80条探针等摩尔质量混合。

上述成套探针组中，所述每条探针的5’端均标记功能基团，在本发明的实施例中每条探针的5’端均标记生物素。

上述成套探针组均可用于检测乙型肝炎病毒。

本发明第二个目的是提供用于检测或辅助检测乙型肝炎病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述成套探针组。

上述试剂盒还包括如下独立包装的含有引物1和引物2的富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、0.1M NaOH水溶液、1M且pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液、含有引物3和引物4的PCR反应液和TE缓冲液中的至少一种；

所述富集缓冲液包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA、引物1和引物2；所述引物1为序列表中序列81所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列82所示的单链DNA；

所述杂交缓冲液包括NaCl、柠檬酸钠、BSA和Tween20；

所述结合缓冲液包括NaCl和EDTA；

所述漂洗液1包括SDS和SSC溶液；

所述SSC溶液(即为1×SSC溶液)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述1×SSC溶液中的浓度分别为NaCl 175g/L和柠檬酸三钠88g/L，所述1×SSC溶液的pH值为7.4；

所述漂洗液2包括SDS和10倍稀释的SSC溶液；

所述PCR反应液包括引物3和引物4；

所述引物3和所述引物4的序列分别为序列表中序列83和序列84，

所述TE缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷和EDTA。

上述试剂具体配方如下：

所述富集缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为人cot-1DNA、鲑鱼精DNA、引物1和引物2，所述引物1为序列表中序列81所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列82所示的单链DNA；

所述杂交缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为50mM-200mM Tris-HCl(pH 7.6)，所述溶质及其在所述杂交缓冲液中的浓度分别为1.25M NaCl，0.125M柠檬酸钠，0.1g/100mL BSA，5％-10％(体积比)Tween20；其中，所述50mM-200mM Tris-HCl(pH 7.6)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷(Tris)和用于调节pH的HCl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为50mM-200mM，pH为7.6；

所述结合缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为10mM Tris-HCl(pH 7.5)，所述溶质及其浓度分别为1M NaCl，1mM EDTA；所述10mM Tris-HCl(pH 7.5)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷(Tris)和用于调节pH的HCl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mM，pH为7.5。

上述试剂盒中，所述富集缓冲液中所述溶质的含量分别可为Invitrogen的人cot-1DNA 35％(体积比)、Invitrogen的鲑鱼精DNA 15％(体积比)、所述引物10.5nmol/μl和所述引物2 0.5nmol/μl；

所述杂交缓冲液中，所述溶剂为100mM Tris-HCl(pH 7.6)，所述溶质及其在所述杂交缓冲液中的浓度分别为1.25M NaCl，0.125M柠檬酸钠，0.1g/100mL BSA，7％(体积比)Tween20；所述100mM Tris-HCl(pH 7.6)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和用于调节pH的HCl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为100mM，pH为7.6。

所述漂洗液1由溶剂和溶质组成，所述溶剂为1×SSC溶液，所述溶质为SDS，SDS在所述漂洗液1中的质量百分比浓度为0.1％；所述1×SSC溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述1×SSC溶液中的浓度分别为NaCl 175g/L和柠檬酸三钠88g/L，pH 7.4；

所述漂洗液2由溶剂和溶质组成，所述溶剂为0.1×SSC溶液，所述溶质为SDS，SDS在所述漂洗液2中的质量百分比浓度为0.1％；其中，所述0.1×SSC溶液为将所述1×SSC溶液稀释10倍得到的溶液；

所述NaOH溶液(0.1M)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及在所述NaOH溶液(0.1M)中的浓度为0.1M

所述Tris-HCl缓冲液(1M，pH 7.5)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和用于调节pH的HCl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为1M，pH为7.5；

所述PCR反应液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为1倍浓度的Phusion缓冲液，所述溶质及其在所述PCR反应液中的浓度分别为0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、0.2mMdGTP、2.5pmol引物3、2.5pmol引物4、0.05U/μl Hotstart Phusion酶、5％(体积比)DMSO；其中，所述1倍浓度的Phusion缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为50mM Tris-HCl(pH8.8)，所述溶质及其在所述1倍浓度的Phusion缓冲液中的浓度分别为4mM MgCl

所述TE缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、EDTA和用于调节pH的HCl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mM，EDTA的浓度为1mM，pH为8.0。

所述1倍浓度的Phusion缓冲液具体可为将New England Biolabs的5倍浓度的Phusion缓冲液稀释5倍得到的溶液。

所述Hotstart Phusion酶具体可为New England Biolabs产品。

上述试剂盒中，探针组和各个试剂单独包装。

上述成套探针组或上述试剂盒在制备具有如下B1)-B9)至少一种功能的产品中的应用：

B1)检测或辅助检测待测患者是否携带乙型肝炎病毒；

B2)检测或辅助检测待测患者携带乙型肝炎病毒分型种类；

B3)检测或辅助检测待测样本中是否含有乙型肝炎病毒；

B4)检测或辅助检测待测样本中乙型肝炎病毒分型种类；

B5)检测或辅助检测乙型肝炎病毒分型种类；

B6)检测或辅助检测待测患者或待测样本中乙型肝炎病毒的整合位点；

B7)检测检测乙型肝炎病毒DNA在人基因组中插入位点；

B8)捕获乙型肝炎病毒DNA；

B9)检测乙型肝炎病毒基因组序列。

本发明还有个目的是提供如下方法。

本发明提供了下述任一方法：

C1)捕获待测样本中乙型肝炎病毒DNA的方法，包括：利用上述成套探针组或上述试剂盒(具体采用富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗缓冲液等)对待测样本的基因组DNA进行捕获，得到捕获片段；实现捕获待测样本中乙型肝炎病毒DNA；

C2)检测乙型肝炎病毒基因组序列的方法，包括：利用上述成套探针组或上述试剂盒捕获待测样本中乙型肝炎病毒基因组DNA，得到捕获到的基因组DNA，对所述捕获到的基因组DNA进行测序，得到乙型肝炎病毒基因组序列；测序前需要进行纯化(结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、0.1M NaOH溶液、1M、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液)、PCR扩增(PCR反应液)、再次纯化(Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒)的步骤。

C3)检测待测样本中乙型肝炎病毒分型种类的方法，包括：利用上述成套探针组或上述试剂盒捕获待测样本乙型肝炎病毒基因组DNA，得到捕获到的基因组DNA，对所述捕获到的基因组DNA进行测序，得到待测样本乙型肝炎病毒基因组序列；测序前需要进行纯化(结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、0.1M NaOH溶液、1M、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液)、PCR扩增(PCR反应液)、再次纯化(Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒)的步骤。将所述待测样本乙型肝炎病毒基因组序列与乙型肝炎病毒基因组参考序列进行比对，得到所述待测样本的乙型肝炎病毒分型种类；

C4)检测乙型肝炎病毒DNA在人基因组中插入位点的方法，包括：利用上述成套探针组或上述试剂盒捕获待测样本基因组DNA，得到捕获到的基因组DNA，对所述捕获到的基因组DNA进行测序，得到测序序列；测序前需要进行纯化(结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、0.1M NaOH溶液、1M、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液)、PCR扩增(PCR反应液)、再次纯化(Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒)的步骤。将所述测序序列与乙型肝炎病毒基因组参考序列以及人参考基因组序列(hg19基因组)进行比对，确定所述待测样本的乙型肝炎病毒DNA在人基因组中的插入位点；

所述乙型肝炎病毒分型可为HBVA、B、C、D、E、F、G、H中的至少一种。

本发明提供的用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂，其在捕获乙型肝炎病毒基因组与测序中，可以区分其不同的分型，还可以确定乙型肝炎病毒DNA是否整合到人基因组，若有整合情况，可以检测到具体的整合位点和整合序列，具有分型准确、可获得整合信息与拷贝数、灵敏度高等特点。利用本发明的成套试剂可以同时检测8种HBV基因型别。本发明的成套试剂可以应用于乙型肝炎及癌前病变筛查、治疗后残留或复发病变的预测以及进行相应的健康咨询、探究HBV致病机制等，符合精准医疗的发展趋势，意义非常重大。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

实施例1、检测乙型肝炎病毒的成套探针组与试剂盒的制备

1、检测乙型肝炎病毒的成套探针组

根据8种乙型肝炎病毒HBV基因型别设计用于识别这8种HBV基因型别的80条探针，这8种HBV基因型别分别为HBV A、B、C、D、E、F、G、H，并且对探针调整和优化。

这80条探针的核苷酸序列分别为序列表中序列1-80，每条序列的第16-135位用于识别乙型肝炎病毒，每条序列的第1-15位和第136-150位均相同，可以用来扩增探针，每条探针的5’端均标记生物素(与捕获富集纯化步骤中的MyOne C1链霉亲和素磁珠结合)。

检测乙型肝炎病毒的成套探针组，由上述80条探针组成，且所有探针包装在一起，各探针的摩尔数均相等(等摩尔质量混合)。

2、检测乙型肝炎病毒的试剂盒

本实施例提供的检测乙型肝炎病毒的试剂盒由上述1的成套探针组和以下试剂组成：富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、NaOH溶液(0.1M)、Tris-HCl缓冲液(1M，pH 7.5)、PCR反应液、TE缓冲液。探针和各试剂单独包装。

其中各溶液组成如下：

(1)富集缓冲液：

富集缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，各种溶质及其浓度分别为35％(体积百分比)人cot-1DNA(Invitrogen)、15％(体积百分比)鲑鱼精DNA(Invitrogen)、0.5nmol/μl引物1和0.5nmol/μl引物2。

其中引物1和引物2(用来封闭文库两端引物)的序列如下：

引物1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT(序列表中序列81)；

引物2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC(序列表中序列82)。

(2)杂交缓冲液：

杂交缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为100mM Tris-HCl(pH 7.6)，各种溶质及其浓度分别为1.25M NaCl，0.125M柠檬酸钠，0.001g/mLBSA和7％(体积比)Tween20；

其中，100mM Tris-HCl(pH 7.6)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为浓度为100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，用HCl调节pH值为7.6。

(3)结合缓冲液：

结合缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为10mM Tris-HCl(pH 7.5)，各种溶质及其浓度分别为1M NaCl和1mM EDTA；

10mM Tris-HCl(pH 7.5)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Tris的浓度为10mM，用HCl调节pH值为7.5。

(4)漂洗液1：

漂洗液1由溶剂和溶质组成，溶剂为1×SSC溶液，溶质为质量百分比浓度为0.1％的SDS。

其中，1×SSC溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在1×SSC溶液中的浓度分别为175g/L NaCl和88g/L柠檬酸三钠，pH 7.4。

(5)漂洗液2：

漂洗液2由溶剂和溶质组成，溶剂为0.1×SSC溶液，溶质为质量百分比浓度为0.1％SDS；

其中，0.1×SSC溶液为将1×SSC溶液稀释10倍得到的溶液。

(6)NaOH溶液(0.1M)

NaOH溶液(0.1M)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为0.1M NaOH。

(7)Tris-HCl缓冲液(1M，pH 7.5)

Tris-HCl缓冲液(1M，pH 7.5)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)，用HCl调节pH值为7.5。

(8)PCR反应液：

PCR反应液由溶剂和溶质组成，溶剂为1倍浓度的Phusion缓冲液(New EnglandBiolabs)，溶质及其浓度分别为0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、2.5pmol/μl引物3、2.5pmol/μl引物4、0.05U/μl Hotstart Phusion酶(New EnglandBiolabs)、5％(体积百分比)DMSO；

其中，1倍浓度的Phusion缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为50mM Tris-HCl(pH8.8)，溶质及其浓度分别为4mM MgCl

50mM Tris-HCl(pH 8.8)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，用HCl调节pH值为8.8。

其中，引物序列如下：

引物3：AATGATACGGCGACCACCGA*G(序列表中序列83)；

引物4：CAAGCAGAAGACGGCATACG*A(序列表中序列84)；*表示硫代修饰。

(9)TE缓冲液

TE缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为10mM Tris和1mM EDTA，用HCl调节pH值为8.0。

实施例2、检测乙型肝炎病毒基因型的方法的建立

本发明利用实施例1的试剂盒中的探针组和试剂检测乙型肝炎病毒的方法如下：

1、全基因组文库的制备

经患者知情同意，提取HBV病毒感染个体的血清的cfDNA，总量10ng DNA，利用KAPAHyper prip文库构建试剂盒(货号为KK8504)构建cfDNA文库。

所用接头的两条单链DNA的序列如下：

单链DNA1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

单链DNA2：

AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG，其中，N为A、T、C或G。

2、HBV基因片段的特异性捕获及测序

捕获富集：

1)取步骤1的cfDNA文库，向其中加入13μl富集缓冲液和5μl成套探针组溶液(该溶液为利用水溶解实施例1的成套探针组得到的液体，该溶液中探针的总浓度为100ng/μl)，将得到的反应体系置于PCR仪上，反应条件为95℃7min，之后65℃2min，反应结束得到反应产物；

2)将65℃预热的杂交缓冲液23μl加入到上述步骤1)得到的反应产物中,然后于PCR仪上65℃杂交22小时，得到富集体系混合物；

纯化：

3)将MyOne C1链霉亲和素磁珠(Invitrogen)漩涡震荡使磁珠充分悬浮，取50μlMyOne C1链霉亲和素磁珠到新的1.5ml的离心管；

4)将步骤3)的装有50μl MyOne C1链霉亲和素磁珠的1.5ml离心管漩涡震荡至少5s，使磁珠充分悬浮，短暂离心后放入磁力架上保持静止一分钟(不要旋转离心管)，小心吸弃上清；

5)取下步骤4)的离心管，向其中加入50μl结合缓冲液，漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，小心吸弃上清，重复三次；

6)取下步骤5)的离心管，向其中加入100μl的2倍浓度的结合缓冲液(即将实施例1中结合缓冲液的各溶质浓度加倍得到的溶液，即2倍浓度的结合缓冲液中各溶质浓度为实施例结合缓冲液相应溶质浓度的2倍)，漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟；

7)将步骤2)得到的富集体系混合物加入到骤6)处理后的离心管中，漩涡震荡至少5s，然后置于旋转仪上室温旋转1小时(60转/分钟)；

8)步骤7)完成后，利用漂洗液1室温清洗步骤7)的磁珠一次，15分钟，然后再用漂洗液2于65℃下清洗3次，每次15分钟；

9)步骤8)完成后，将磁珠用NaOH溶液(0.1M)室温下洗脱10分钟，然后将得到的洗脱液漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，然后将上清液转移到含有70μl Tris-HCl缓冲液(1M，pH 7.5)的干净离心管中，即得到DNA溶液；

10)采用Qiagen MinElute Column(Qiagen产品)对步骤9)得到的DNA溶液进行纯化，将得到DNA利用TE缓冲液溶解，得到纯化DNA溶液；

PCR扩增：

11)向30μl步骤10)得到的纯化DNA溶液中加入70ul PCR反应液进行PCR扩增，得到PCR产物；

PCR反应条件为：98℃30s，1个循环；98℃25s,65℃30s,72℃30s，15个循环；72℃5min，1个循环；

纯化：

12)利用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒(Beckman Coulter)纯化步骤11)的PCR产物，得到纯化产物。

测序：

13)将步骤12)得到的纯化产物在Illumina NextSeq 500测序仪上进行测序，所用测序引物为测序引物1和测序引物2，测序引物1：AATGATACGGCGACCACCGA；测序引物2：CAAGCAGAAG ACGGC ATACG AGAT。

3、生物信息学分析流程及结果输出

根据步骤2的测序结果对HBV病毒分型和确定HBV病毒的整合位点：

(1)HBV病毒分型分析流程

①获取测序原始序列；

②数据预处理：去除测序数据中的防污染接头和低质量数据等，所用到的参数：-m40-q10,10-O 6-e 0.08，具体参数含义参考：http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/；

③用BWA工具将预处理后数据与所有HBV参考基因组进行比对，所用到的参数：bwamem-M，具体参数含义参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml

④统计测序结果信息，确定HBV病毒域覆盖大小、平均测序深度以及HBV病毒的分型等；

得到HBV病毒分型。

(2)HBV病毒整合分析流程

①根据步骤(1)的分型信息，选取每种型比对最优株型作为HBV-Integration分析参考基因组；

②筛选后数据与人参考基因组序列hg19和HBV-Integration分析参考基因组进行bwa mem比对，得到比对bam结果，所用到的参数：bwa mem-M，具体参数含义参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；

③根据比对bam结果，用SVdetect分析structral variations，得到初步整合位点区域，具体参数含义参考：http://svdetect.sourceforge.net/Site/Manual.html；

④用CREST分析HBV整合位点，将CREST分析结果和SVdetect分析结果整合，得到HBV病毒整合结果。

实施例3、利用实施例1的试剂盒检测HBV分型结果

利用实施例1的试剂盒检测11例HBV患者(均经患者知情同意)的HBV基因型别，按照实施例2的方法进行。

结果证实，实施例1的试剂盒对HBV基因具有高捕获率，目标区域(HBV基因)的平均有效测序READ量达到20Mb，目标区域(HBV基因)的平均测序深度为1000X以上(见表1)，检测到不同患者感染的HBV基因型别如表1所示，所检测到的患者感染的HBV基因型别均为中国大陆常见的HBV基因型别。

表1为利用本发明试剂盒对12例乙型肝炎患者检测的HBV分型结果

用之江乙型肝炎病毒(HBV)基因分型测定试剂盒(荧光PCR法)(国食药监械(准)字2011第3400126号)检测以上样本，所检测各样本的HBV基因型别与利用实施例1的试剂盒检测结果完全一致。

其中检测到病毒整合到人基因组的样本及整合位点如下表2所示。

表2为利用本发明试剂盒对部分乙型肝炎患者检测到的HBV整合情况

上述表中每列分别为如下：第1列为样品编号，第2列为整合到人基因组上的HBV病毒的转录基因名称，第3列和第4列为整合到人基因组上的HBV的转录基因的genbank ID和该基因的断点，代表病毒整合位点位置，第5列为HBV整合到人基因组上的染色体及染色体上的位置，代表人整合位点位置。

分别在每个插入位点的上下游设计引物，并对插入位点进行PCR扩增与Sanger测序，引物序列如表3所示。结果显示，利用实施例1的试剂盒得到的结果与Sanger测序的结果完全一致。

表3为引物序列

上述结果表明，本发明的试剂盒同时可以实现HBV基因分型和整合位点检测。

SEQUENCE LISTING

<110>迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司

<120>用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂与方法

<160> 84

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gactacatgg gacatctcca ccacattcca ccaagctctg ctacacccca gagtaagggg 60

cctatacttt cctgctggtg gctccagttc cggaacagta aaccctgttc cgactactgc 120

ctctcccata tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gactacatgg gacatttcca caacatttca ccaagctctg caggatccca gagtaagagg 60

cctgtatttt cctgctggtg gctccagttc cggaacagtg aaccctgttc cgactactgc 120

ctcactcatc tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 3

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gactacatgg gacatctcca ccacgttcca ccaaactctt caagatccca gagtcagggc 60

tctgtacttt cctgctggtg gctccagttc aggaacagta aaccctgttc agaacactgc 120

ctcttccata tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 4

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gactacatgg gacatctcaa ctcagttcca ccaggctctg ttggatccga gggtaagggc 60

tctgtatttt cctgctggtg gctccagttc agggacacag aaccctgctc cgactattgc 120

ctctctcaca tcatcggaac ctacgacgta 150

<210> 5

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gactacatgg gacatctcta cagcattcca ccaagctcta caaaatccca aagtcagggg 60

cctgtatttt cctgctggtg gctccagttc agggatagtg aaccctgttc cgactattgc 120

ctctcacatc tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 6

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gactacatgg gacatatggc tgctaggttg tactgccaac tggattcttc gagggacgtc 60

ctttgtttac gtcccgtcgg cgctgaatcc cgcggacgac ccctcgcgag gccgcttggg 120

gctgtatcgt cccctggaac ctacgacgta 150

<210> 7

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gactacatgg gacataactc caccactttc caccaaactc ttcaagatcc cagagtcagg 60

gccctgtact ttcctgctgg tggctccagt tcaggaacag tgagccctgc tctgaatact 120

gtctctgcca tatcgggaac ctacgacgta 150

<210> 8

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gactacatgg gacatctcta cagcattcca ccaagctcta caaaatccca aagtcagggg 60

cctgtatttt cctgctggtg gctccagttc agggatagtg aaccctgttc cgactattgc 120

ctctcacatc tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 9

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

gactacatgg gacatctcaa cccagttcca ccaggccttg ttggatccga gggtaagggc 60

tctgtatttt cctgctggtg gctccagttc agagacgcag aaccctgctc cgactattgc 120

ctctctcaca tcatcggaac ctacgacgta 150

<210> 10

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gactacatgg gacatctcta cagcattcca ccaagctcta caaaatccca aagtcagggg 60

cctgtatttt cctgctggtg gctccagttc agggatagtg aaccctgttc cgactattgc 120

ctctcacatc tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 11

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

gactacatgg gacatgaact caacacagtt ccaccaagca ctgttggatc cgagagtcag 60

gggtctgtat tttcctgctg gtggctccag ttcagaaaca cagaaccctg ttccgactat 120

tgcctctctc acatcggaac ctacgacgta 150

<210> 12

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

gactacatgg gacatgaact caacacagtt ccaccaagca ctgttggatc cgagagtaag 60

gggtctgtat cttcctgctg gtggctccag ttcagaaaca cagaaccctg ttccgactat 120

tgcctctctc acatcggaac ctacgacgta 150

<210> 13

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

gactacatgg gacatgaact caacacagtt ccaccaagca ctgttggatc cgagagtaag 60

gggtctgtat tttcctgctg gtggctccag ttcagaaaca cagaaccctg ctccgactat 120

tgcctctctc acatcggaac ctacgacgta 150

<210> 14

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

gactacatgg gacatctcga ggactgggga ccctgcaccg aacatggaga gcacaacatc 60

aggattccta ggacccctgc tcgtgttaca ggcggggttt ttcttgttga caagaatcct 120

cacaatacca cagagggaac ctacgacgta 150

<210> 15

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

gactacatgg gacatctcca ccactttcca ccaaactctt caagatccca gagtcagggc 60

tctgtacttt cctgctggtg gctccagttc aggaacagta agccctgctc agaatactgt 120

ctcagccata tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 16

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

gactacatgg gacataactc cacaaccttc caccaaactc tgcaagatcc cagagtgaga 60

ggcctgtatc tccctgctgg tggctccagt tcaggaacag taaaccctgt tccgactact 120

gtctctccca tatcgggaac ctacgacgta 150

<210> 17

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

gactacatgg gacatcatgc aactttttca cctctgccta atcatctctt gtacatgtcc 60

cactgttcaa gcctccaagc tgtgccttgg gtggctttgg ggcatggaca ttgaccctta 120

taaagaattt ggagcggaac ctacgacgta 150

<210> 18

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

gactacatgg gacatctcca caacattcca ccaagctctg ctagatccca gagtgagggg 60

cctatatttt cctgctggtg gctccagttc cggaacagta aaccctgttc cgactactgc 120

ctcacccata tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 19

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

gactacatgg gacatttcca ctgccttcca ccaagctctg caagacccca gagtcagggg 60

tctgtatttt cctgctggtg gctccagttc aggaacagta aaccctgctc cgaatattgc 120

ctctcacatc tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 20

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

gactacatgg gacataactc cacaaccttc caccaaactc tgcaagatcc cagagtgaga 60

ggcctgtatt tccctgctgg tggctccagt tcaggaacag taaaccctgt tctgactact 120

gcctctccct tatcgggaac ctacgacgta 150

<210> 21

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

gactacatgg gacatctcaa cccagttcca ccaagctctg ttggatccca gggtaagggc 60

tctgtacttc cctgctggtg gctccagttc agggacacag aaccctgctc cgactattgc 120

ctctctcaca tcatcggaac ctacgacgta 150

<210> 22

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

gactacatgg gacatttcca caacattcca ccaagctctg caggatccca gagtaagagg 60

cctgtatttt cctgctggtg gctccagttc cggaacagtg aaccctgttc cgactactgc 120

ctcactcatc tcgtcggaac ctacgacgta 150

<210> 23

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

gactacatgg gacataactc cacaaccttc caacacactc tgcaagatcc cagagtgaaa 60

ggcctgtatc tccctgctgg tggctccagt tcaggaacag taaaccctgt tccgaccact 120

gcctctccct tatcgggaac ctacgacgta 150

<210> 24

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

gactacatgg gacatctggg aggagttggg ggaggagatt aggttaatga tctttgtact 60

aggaggctgt aggcataaat tggtctgttc accagcacca tgcaactttt tcacctctgc 120

ctaatcatct catgtggaac ctacgacgta 150

<210> 25

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

gactacatgg gacattctgg ccacctgggt gggaagtaat ttggaagacc cagcatccag 60

ggaattagta gtcagctatg tcaatgttaa tatgggccta aaaatcagac aactactgtg 120

gtttcacatt tcctgggaac ctacgacgta 150

<210> 26

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

gactacatgg gacattgtat cgggaggcct tagagtctcc ggaacattgt tcacctcacc 60

atacagcact cagacaagcc attctgtgtt ggggtgagtt gatgaatctg gccacctggg 120

tgggaagtaa tttggggaac ctacgacgta 150

<210> 27

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

gactacatgg gacatgactc ttgctcaagg aacctctatg tttccctcat gttgctgttc 60

aaaaccttcg gacggaaatt gcacttgtat tcccatccca tcatcatggg ctttcggaaa 120

attcctatgg gagtgggaac ctacgacgta 150

<210> 28

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

gactacatgg gacatattgg aaagtatgtc aacgaattgt gggtcttttg ggctttgctg 60

ccccttttac acaatgtggg tatcctgctt taatgcctct gtatgcgtgt attcaatcta 120

agcaggcttt cacttggaac ctacgacgta 150

<210> 29

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

gactacatgg gacatgacag ataattctgt cgttctctcc cggaaatata catcctttcc 60

atggctgcta ggctgtgctg ccaactggat cctgcgaggg acgtcctttg tctacgtccc 120

gtcagcgctg aatccggaac ctacgacgta 150

<210> 30

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

gactacatgg gacatttaga ttaaaggtct ttgtactagg aggctgtagg cataaattgg 60

tctgcgcacc agcaccatgc aactttttca cctctgccta atcatctctt gttcatgtcc 120

tactgttcaa gcctcggaac ctacgacgta 150

<210> 31

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 31

gactacatgg gacatatctc ttgttcatgt cctactgttc aagcctccaa gctgtgcctt 60

gggtggcttt ggggcatgga cattgaccct tataaagaat ttggagctac tgtggagtta 120

ctctcgtttt tgcctggaac ctacgacgta 150

<210> 32

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 32

gactacatgg gacatggcat cttatataaa agagaaacta cacgtagcgc ctcattttgt 60

gggtcacctt attcttggga acaagagcta catcatgggg ctttcttgga cggtccctct 120

cgaatggggg aagaaggaac ctacgacgta 150

<210> 33

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 33

gactacatgg gacatctatt cgagatcttc tcgacaccgc ctctgctctg tatcgggagg 60

ccttagagtc tccggaacat tgttcacctc accatacggc actcaggcaa gctattgtgt 120

gttggggtga gttgaggaac ctacgacgta 150

<210> 34

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 34

gactacatgg gacatgatct tctcgacacc gcctctgctc tgtatcggga ggccttagag 60

tctccggaac attgttcacc tcaccatacg gcactcaggc aagctattgt gtgttggggt 120

gagttgatga atctaggaac ctacgacgta 150

<210> 35

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 35

gactacatgg gacatcgaca ccgcctctgc tctgtatcgg gaggccttag agtctccgga 60

acattgttca cctcaccata cggcactcag gcaagctatt gtgtgttggg gtgagttgat 120

gaatctagcc acctgggaac ctacgacgta 150

<210> 36

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 36

gactacatgg gacatcctct gctctgtatc gggaggcctt agagtctccg gaacattgtt 60

cacctcacca tacggcactc aggcaagcta ttgtgtgttg gggtgagttg atgaatctag 120

ccacctgggt gggaaggaac ctacgacgta 150

<210> 37

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 37

gactacatgg gacatctgta tcgggaggcc ttagagtctc cggaacattg ttcacctcac 60

catacggcac tcaggcaagc tattgtgtgt tggggtgagt tgatgaatct agccacctgg 120

gtgggaagta atttgggaac ctacgacgta 150

<210> 38

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 38

gactacatgg gacatggagg ccttagagtc tccggaacat tgttcacctc accatacggc 60

actcaggcaa gctattgtgt gttggggtga gttgatgaat ctagccacct gggtgggaag 120

taatttggaa gacccggaac ctacgacgta 150

<210> 39

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 39

gactacatgg gacattagag tctccggaac attgttcacc tcaccatacg gcactcaggc 60

aagctattgt gtgttggggt gagttgatga atctagccac ctgggtggga agtaatttgg 120

aagacccagc ctcccggaac ctacgacgta 150

<210> 40

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 40

gactacatgg gacatcttcc agacgagaca ttatttacat actctttgga aggcgggtat 60

cttatataaa agagagacaa cacgtagcgc ctcattttgc gggtcaccat attcttggga 120

acaagagcta cagcaggaac ctacgacgta 150

<210> 41

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 41

gactacatgg gacatcgaga cattatttac atactctttg gaaggcgggt atcttatata 60

aaagagagac aacacgtagc gcctcatttt gcgggtcacc atattcttgg gaacaagagc 120

tacagcatgg gaggtggaac ctacgacgta 150

<210> 42

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 42

gactacatgg gacattattt acatactctt tggaaggcgg gtatcttata taaaagagag 60

acaacacgta gcgcctcatt ttgcgggtca ccatattctt gggaacaaga gctacagcat 120

gggaggttgg tcctcggaac ctacgacgta 150

<210> 43

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 43

gactacatgg gacattactc tttggaaggc gggtatctta tataaaagag agacaacacg 60

tagcgcctca ttttgcgggt caccatattc ttgggaacaa gagctacagc atgggaggtt 120

ggtcctccaa acctcggaac ctacgacgta 150

<210> 44

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 44

gactacatgg gacatgcacc atgcaacttt ttcacctctg cctaatcatc ttttgttcat 60

gtcccactgt tcaagcctcc aagctgtgcc ttgggtggct ttggggcatg gacattgacc 120

cttataaaga atttgggaac ctacgacgta 150

<210> 45

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 45

gactacatgg gacatcaact ttttcacctc tgcctaatca tcttttgttc atgtcccact 60

gttcaagcct ccaagctgtg ccttgggtgg ctttggggca tggacattga cccttataaa 120

gaatttggag cttctggaac ctacgacgta 150

<210> 46

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 46

gactacatgg gacattcacc tctgcctaat catcttttgt tcatgtccca ctgttcaagc 60

ctccaagctg tgccttgggt ggctttgggg catggacatt gacccttata aagaatttgg 120

agcttctgtg gaattggaac ctacgacgta 150

<210> 47

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 47

gactacatgg gacatacgag gcaggtcccc tagaagaaga actccctcgc ctcgccgacg 60

aaggtctcaa tcgccgcgtc gcagaagatc tcaatctcca gcttcccaat gttagtattc 120

cttggactca taaggggaac ctacgacgta 150

<210> 48

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 48

gactacatgg gacatggtcc cctagaagaa gaactccctc gcctcgccga cgaaggtctc 60

aatcgccgcg tcgcagaaga tctcaatctc cagcttccca atgttagtat tccttggact 120

cataaggtgg gaaatggaac ctacgacgta 150

<210> 49

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 49

gactacatgg gacatggtca tgccagctag attttatcct aaggttacca aatactttcc 60

tatggagaaa gggattaaac cctattatcc tgagcatgca gttaatcatt attttaaaac 120

aagacattat ttgcaggaac ctacgacgta 150

<210> 50

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 50

gactacatgg gacatcagct agattttatc ctaaggttac caaatacttt cctatggaga 60

aagggattaa accctattat cctgagcatg cagttaatca ttattttaaa acaagacatt 120

atttgcatac tttatggaac ctacgacgta 150

<210> 51

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 51

gactacatgg gacattttta tcctaaggtt accaaatact ttcctatgga gaaagggatt 60

aaaccctatt atcctgagca tgcagttaat cattatttta aaacaagaca ttatttgcat 120

actttatgga aggcgggaac ctacgacgta 150

<210> 52

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 52

gactacatgg gacattaagg ttaccaaata ctttcctatg gagaaaggga ttaaacccta 60

ttatcctgag catgcagtta atcattattt taaaacaaga cattatttgc atactttatg 120

gaaggcggga atcttggaac ctacgacgta 150

<210> 53

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 53

gactacatgg gacattatat aagagggaaa ctacacgtag cgcctcattt tgcgggtcac 60

catattcttg ggaacaagag ctacatcatg ggaggttggt catcaaaacc tcgcaaaggc 120

atggggacga accttggaac ctacgacgta 150

<210> 54

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 54

gactacatgg gacataggga aactacacgt agcgcctcat tttgcgggtc accatattct 60

tgggaacaag agctacatca tgggaggttg gtcatcaaaa cctcgcaaag gcatggggac 120

gaacctttct gttccggaac ctacgacgta 150

<210> 55

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 55

gactacatgg gacattacac gtagcgcctc attttgcggg tcaccatatt cttgggaaca 60

agagctacat catgggaggt tggtcatcaa aacctcgcaa aggcatgggg acgaaccttt 120

ctgttcccaa ccctcggaac ctacgacgta 150

<210> 56

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 56

gactacatgg gacatgcgcc tcattttgcg ggtcaccata ttcttgggaa caagagctac 60

atcatgggag gttggtcatc aaaacctcgc aaaggcatgg ggacgaacct ttctgttccc 120

aaccctctgg gattcggaac ctacgacgta 150

<210> 57

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 57

gactacatgg gacattgcat caagacatta taactaaatg tgaacaattt gtgggccctc 60

tcacagtaaa tgagaaacga agattaaaac tagttatgcc tgccagattt ttcccaaact 120

ctactaaata tttacggaac ctacgacgta 150

<210> 58

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 58

gactacatgg gacatgacat tataactaaa tgtgaacaat ttgtgggccc tctcacagta 60

aatgagaaac gaagattaaa actagttatg cctgccagat ttttcccaaa ctctactaaa 120

tatttaccat tagacggaac ctacgacgta 150

<210> 59

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 59

gactacatgg gacataacta aatgtgaaca atttgtgggc cctctcacag taaatgagaa 60

acgaagatta aaactagtta tgcctgccag atttttccca aactctacta aatatttacc 120

attagacaaa ggtatggaac ctacgacgta 150

<210> 60

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 60

gactacatgg gacatgtgaa caatttgtgg gccctctcac agtaaatgag aaacgaagat 60

taaaactagt tatgcctgcc agatttttcc caaactctac taaatattta ccattagaca 120

aaggtatcaa accgtggaac ctacgacgta 150

<210> 61

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 61

gactacatgg gacatgctag gcaacggccc ggtctgtgcc aagtgtttgc tgacgcaacc 60

cccactggtt ggggcttggc catcggccat cagcgcatgc gtggaacctt tgtggctcct 120

ctgccgatcc atactggaac ctacgacgta 150

<210> 62

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 62

gactacatgg gacatacggc ccggtctgtg ccaagtgttt gctgacgcaa cccccactgg 60

ttggggcttg gccatcggcc atcagcgcat gcgtggaacc tttgtggctc ctctgccgat 120

ccatactgcg gaactggaac ctacgacgta 150

<210> 63

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 63

gactacatgg gacatcgacc cgtctcgggg ccgtttgggc ctctaccgtc ccttgctttc 60

tctgccgttc cagccgacca cggggcgcac ctctctttac gcggtctccc cgtctgtgcc 120

ttctcatctg ccggaggaac ctacgacgta 150

<210> 64

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 64

gactacatgg gacatctcgg ggccgtttgg gcctctaccg tcccttgctt tctctgccgt 60

tccagccgac cacggggcgc acctctcttt acgcggtctc cccgtctgtg ccttctcatc 120

tgccggaccg tgtgcggaac ctacgacgta 150

<210> 65

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 65

gactacatgg gacatcgttt gggcctctac cgtcccttgc tttctctgcc gttccagccg 60

accacggggc gcacctctct ttacgcggtc tccccgtctg tgccttctca tctgccggac 120

cgtgtgcact tcgctggaac ctacgacgta 150

<210> 66

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 66

gactacatgg gacatacccg tgtgtcttgg ccaaaattcg cagtcccaaa tctccagtca 60

ctcaccaacc tgttgtcctc caatttgtcc tggttatcgc tggatgtgtc tgcggcgttt 120

tatcatcttc ctctgggaac ctacgacgta 150

<210> 67

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 67

gactacatgg gacatgtctt ggccaaaatt cgcagtccca aatctccagt cactcaccaa 60

cctgttgtcc tccaatttgt cctggttatc gctggatgtg tctgcggcgt tttatcatct 120

tcctctgcat cctgcggaac ctacgacgta 150

<210> 68

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 68

gactacatgg gacatataat ttggaagatc cagcatcccg ggatctagta gtcaattatg 60

ttaacactaa catgggccta aagatcaggc aactatggtg gtttcacatt tcctgtctta 120

cttttggaag agaaaggaac ctacgacgta 150

<210> 69

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 69

gactacatgg gacatgaaga tccagcatcc cgggatctag tagtcaatta tgttaacact 60

aacatgggcc taaagatcag gcaactatgg tggtttcaca tttcctgtct tacttttgga 120

agagaaactg ttctgggaac ctacgacgta 150

<210> 70

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 70

gactacatgg gacatagcat cccgggatct agtagtcaat tatgttaaca ctaacatggg 60

cctaaagatc aggcaactat ggtggtttca catttcctgt cttacttttg gaagagaaac 120

tgttctggaa tatttggaac ctacgacgta 150

<210> 71

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 71

gactacatgg gacattcttg tagtaaatta tgttaatact aacgtgggtt taaagatcag 60

gcaactattg tggtttcata tatcttgcct tacttttgga agagagactg tacttgaata 120

tttggtctct ttcggggaac ctacgacgta 150

<210> 72

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 72

gactacatgg gacattaaat tatgttaata ctaacgtggg tttaaagatc aggcaactat 60

tgtggtttca tatatcttgc cttacttttg gaagagagac tgtacttgaa tatttggtct 120

ctttcggagt gtggaggaac ctacgacgta 150

<210> 73

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 73

gactacatgg gacatgtcaa tgagaaaaga agactgcaat tgattatgcc tgctaggttt 60

tatccaaatg tcaccaaata tttgccattg gataagggta ttaaacctta ttatccagag 120

catctagtta atcatggaac ctacgacgta 150

<210> 74

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 74

gactacatgg gacatgaaaa gaagactgca attgattatg cctgctaggt tttatccaaa 60

tgtcaccaaa tatttgccat tggataaggg tattaaacct tattatccag agcatctagt 120

taatcattac ttccaggaac ctacgacgta 150

<210> 75

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 75

gactacatgg gacattgccc gtttgtcctc tacttccagg atccacgacc accagcacgg 60

gaccctgcaa aacctgcaca actcttgcac aaggaacctc tatgtttccc tcctgttgct 120

gttccaaacc ctcggggaac ctacgacgta 150

<210> 76

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 76

gactacatgg gacattgtcc tctacttcca ggatccacga ccaccagcac gggaccctgc 60

aaaacctgca caactcttgc acaaggaacc tctatgtttc cctcctgttg ctgttccaaa 120

ccctcggacg gaaacggaac ctacgacgta 150

<210> 77

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 77

gactacatgg gacattattt gcatacttta tggaaggcgg gaattttata taagagagaa 60

tccacacgta gcgcctcatt ttgtgggtca ccatattcct gggaacaaga gctacagcat 120

gggagcacct ctctcggaac ctacgacgta 150

<210> 78

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 78

gactacatgg gacattactt tatggaaggc gggaatttta tataagagag aatccacacg 60

tagcgcctca ttttgtgggt caccatattc ctgggaacaa gagctacagc atgggagcac 120

ctctctcaac gacacggaac ctacgacgta 150

<210> 79

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 79

gactacatgg gacatggaag gcgggaattt tatataagag agaatccaca cgtagcgcct 60

cattttgtgg gtcaccatat tcctgggaac aagagctaca gcatgggagc acctctctca 120

acgacacgaa gaggcggaac ctacgacgta 150

<210> 80

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 80

gactacatgg gacatggcct cagcccgttt ctcctggctc agtttactag tgccatttgt 60

tcagtggttc gccgggcttt cccccactgt ctggctttca gttatatgga tgatgtggta 120

ttgggggcca agtctggaac ctacgacgta 150

<210> 81

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 81

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct 50

<210> 82

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 82

caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc 50

<210> 83

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 83

aatgatacgg cgaccaccga g 21

<210> 84

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 84

caagcagaag acggcatacg a 21