一种重组MARC-145细胞及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组MARC-145细胞及其构建方法和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的一种全球性的猪的病毒性传染病，主要以母猪繁殖障碍及仔猪严重的呼吸道疾病为主要特征，成为危害我国养猪业最严重的疾病之一。给中国的养猪业造成了巨大的经济损失。

PRRSV具有相当严格的细胞嗜性，在猪源细胞中，原代猪肺泡巨噬细胞(PAMs)是其主要宿主细胞，除此之外PRRSV在体外主要感染猴肾细胞MA-104及其衍生的细胞系，如非洲绿猴的肾细胞系Marc-145细胞。研究表明PRRSV的细胞嗜性主要由细胞上病毒的受体所决定。目前已鉴定出存在于PAM细胞上的PRRSV受体有三个：硫酸乙酰肝素(HS)、唾液酸粘附素(Siglec-1，CD169)和CD163等。在自然宿主细胞PAM上，已经确定的PRRSV的受体有三个：硫酸乙酰肝素，Siglec-1和CD163。硫酸乙酰肝素主要是吸附病毒粒子，而Siglec-1既可以吸附病毒又可以介导病毒的内吞，而且这种内吞作用是不依赖硫酸乙酰肝素的。此外，CD163可能协助Siglec-1内吞，病毒脱衣壳和将基因组RNA释放到细胞质中的作用，因此Siglec-1和CDl63分子在介导RRSV进入PAM的过程中具有协同作用。Siglec-10是一种与Siglec-1属于同一家族的唾液酸结合蛋白，最新研究表明Siglec-10也参与PRRSV的胞吞作用，在PRRSV进入细胞过程中发挥重要作用。目前用于分离PRRSV的细胞系是传代细胞系非洲绿猴的肾细胞系Marc-145细胞，但是Marc-145只表达CD163受体，而不表达Siglec-10受体，导致目前部分PRRSV无法在Marc-145细胞上分离。由于最容易感染、分离PRRSV的PAMS只能原代培养，制作过程麻烦，成本高昂且易被其他微生物污染，而目前常用的MARC-145细胞虽然可以增殖PRRSV，但来源于猴，其受限于自然宿主，同时存在着PRRSV增殖速度慢、滴度低的局限性。基于此，建立一种猪源细胞用于PRRSV的分离培养及相关研究成为当务之急。

因此，提供一种重组MARC-145细胞及其构建方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种同时表达猪源CD163和唾液酸结合Ig样凝集素10(Siglec-10)基因的重组MARC-145细胞及其构建方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组MARC-145细胞，是在MARC-145细胞中同时表达猪源CD163和唾液酸结合Ig样凝集素10基因的MARC-145

进一步，所述的一种重组MARC-145细胞的构建方法，具体步骤如下：

(1)PCR分别扩增pCD163、pSiglec-10基因；

(2)分别构建pLVX-pCD163-PGK-Puro和pCDNA3.1-Siglec-10重组质粒；

(3)慢病毒包装：将重组质粒pLVX-pCD163-PGK-Puro以及系统包装质粒一起导入293T细胞，获得rLV-pCD163；

(4)将rLV-pCD163加入Marc145细胞中孵育，用含有puromycin的完全培养基筛选稳转株，传代获得多克隆稳转细胞株MARC-145

(5)重组质粒pCDNA3.1-pSiglec-10转染MARC-145

进一步，步骤(1)所述PCR扩增pCD163基因所用的引物序列如下：

P1：5’-

P2：5’-

PCR扩增pSiglec-10基因所用的引物序列如下：

P3：5’-

P4：5’-

进一步，所述的MARC-145

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种重组MARC-145细胞及其构建方法和应用，PRRSV的感染能力与CD163受体的表达水平具有直接的相关性，基于此，本发明将猪源CD163和Siglec-10基因转染到Marc-145细胞，构建一株能能够高效稳定表达CD163和Siglec-10的MARC-145

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明pLVX-PGK-Puro载体图谱；

图2附图为本发明293T细胞转染pLVX-PGK-Puro 24h形态观察图；

图3附图为本发明293T细胞转染pLVX-pCD163-PGK-Puro 48h形态观察图；

图4附图为本发明rLV-pCD163病毒感染细胞48h形态观察图；

图5附图为本发明rLV-PP病毒感染细胞48h形态观察图；

图6附图为本发明rLV-pCD163病毒稳转Marc145细胞药筛完成时细胞状态形态观察图；

图7附图为本发明rLV-PP病毒稳转Marc145细胞药筛完成时细胞状态形态观察图；

图8附图为本发明pCD163 PCR鉴定结果图；

其中，M、DL2000 Marker；1、扩增条带；

图9附图为本发明MARC-145

图10附图为本发明rLV-PP病毒稳转Marc145细胞获得的混合克隆冻存前细胞状态形态观察图；

图11附图为本发明Western Blot鉴定Marc-145和Marc145

其中，1、MARC-145；2、MARC-145

图12附图为本发明Siglec-10基因PCR鉴定结果图；

其中，M、DL2000 Marker；1、扩增条带；

图13附图为本发明Western Blot鉴定Marc-145和Marc145

其中，1、MARC-145

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，Superscript III reversetranscriptase和

实施例1总RNA的提取及pCD163、pSiglec-10基因的扩增

(1)总RNA的提取

按照RNA提取试剂盒说明书，提取肺泡巨噬细胞(PAMs)细胞总RNA，参照Superscipt III reverse transcriptase产品说明书进行，反转录反应体系为20μL，RNA 8μL，oligo(dT)201μL，dNTP(10mmol/L)1μL，ddH

(2)pCD163基因和pSiglec-10基因PCR扩增

反应体系为50μL，PCR扩增参照

其中，pCD163基因扩增所用引物序列如下：

P1：5’-

P2：5’-

pSiglec-10基因扩增所用引物序列如下：

P3：5’-

P4：5’-

实施例2pLVX-pCD163-PGK-Puro及pCDNA3.1-Siglec-10重组质粒的构建

用Xho I/BamHI分别双酶切pCD163基因的PCR产物和pLVX-PGK-Puro载体(图1)，将胶回收得到pCD163基因和载体基因片段用T4 DNA连接酶连接，T4 DNA Ligase 1μL，5×Ligase Reaction Buffer 2μL，pCD163回收产物6μL，pLVX-PGK-Puro载体质粒3μL，ddH

实施例3慢病毒包装

将携带目的基因的重组质粒pLVX-pCD163-PGK-Puro以及pSPAX2质粒、pMD2.G质粒(华越洋生物(北京)科技有限公司)一起导入293T细胞，产生携带目的基因的高滴度慢病毒(以下简称rLV-pCD163)；同时用重组质粒pLVX-PGK-Puro做对照病毒(简称rLV-PP)。具体操作按照慢病毒包装试剂盒说明书(华越洋生物(北京)科技有限公司)进行。

293T细胞转染pLVX-PGK-Puro 24h形态观察图见图2，293T细胞转染pLVX-pCD163-PGK-Puro 48h形态观察图见图3。

实施例4构建稳转pCD163细胞株

(1)复苏Marc145细胞，待细胞长至80％-90％时传代细胞，连续传代2-3次；

(2)培养Marc145细胞，待细胞长至80％-90％消化细胞并计数，按6x10

(3)第二天换无血清培养基并以MOI＝10加入病毒(rLV-pCD163或rLV-PP)；培养箱中孵育2h，换成DMEM完全培养基(Thermo Fisher Scientific)培养；

rLV-pCD163病毒感染细胞48h形态观察图见图4；rLV-PP病毒感染细胞48h形态观察图见图5。

(4)48h后换带有浓度6μg/ml的puromycin的DMEM完全培养基加入筛选细胞，每2天换液(带6μg/ml的puromycin DMEM完全培养基)；同时以空白细胞做对照组实验；

(5)待对照组细胞全部死亡，换成2μg/ml的puromycin DMEM完全培养基培养；

rLV-pCD163病毒稳转Marc145细胞药筛完成时细胞状态形态观察图见图6；rLV-PP病毒稳转Marc145细胞药筛完成时细胞状态形态观察图见图7。

(6)待细胞长满后消化细胞扩大培养并取部分细胞提取基因组做PCR鉴定；

稳转株PCR鉴定引物序列如下：

CD163-RT3001-F：5’-GAAACCTCCTTGTGGGATTGT-3’；SEQ ID NO.5；

XWF-PGK-R：5’-GCCTACCGGTGGATGTGGAAT-3’；SEQ ID NO.6；

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图8，扩增片段大小为510bp，与预期目的基因大小一致。

(7)继续传2～3代，获得多克隆稳转细胞株MARC-145

MARC-145

(8)Westernblot检测CD163蛋白表达：用RIPA细胞裂解液裂(碧云天生物技术有限公司)裂解筛选的MARC-145

实施例5构建稳转MARC-145

(1)重组质粒pCDNA3.1-pSiglec-10转染MARC-145

在转染实验前一天将MARC-145

(2)MARC-145

转染24h后，在DMEM完全培养基中加入筛选好的600μg/mL的G418，每3d更换新鲜培养基，筛选到第6天，对照组全部死亡，挑取存活下来的单克隆抗性细胞并扩大培养，采用有限稀释法稀释细胞，接种96孔细胞培养板，使得每个孔细胞数量为1～3个，每3d更换1次含G418(600μg/mL)的DMEM完全培养基。进行3次细胞亚克隆后将得到的单克隆细胞株扩大培养。待细胞长满后消化细胞扩大培养并取部分细胞提取基因组，用P3/P4引物进行PCR鉴定，条带大小为1800bp。结果见图12。

(3)Westernblot检测pSiglec10蛋白表达

用RIPA细胞裂解液裂解(碧云天生物技术有限公司)筛选的MARC-145

实施例6MARC-145

将本实验室2016-2018临床上RT-PCR检测阳性的PRRSV病料样品100份同时接种MARC-145

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 龙岩学院

<120> 一种重组MARC-145细胞及其构建方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ctcgagatgg acaaactcag aatggtg 27

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