一种临床级神经干细胞培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学、神经生物学技术领域，尤其涉及一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基及其制备方法。

背景技术

中枢神经系统损伤曾被认为不可修复，传统的药物等治疗方法也以维持现有神经细胞存活和功能为主。近年来，随着干细胞技术的研究和发展，研究人员发现神经系统损伤疾病发生时损伤丢失的神经细胞可以通过移植干细胞来恢复，且这种方法十分有效。正是在这种形势下，神经干细胞的体外培养成成为当前业内研究者们研究的热门课题之一。

神经干细胞是指神经系统中处于较早发育阶段的细胞群体，它们可以通过自身的对称性或不对称性两种分裂方式进行自我复制，产生神经组织中不同发育阶段和不同分化方向的细胞，最终生成具有一定细胞数目和多种细胞类型的神经成神经元和星形胶质细胞及少突胶质细胞等三类细胞。由于神经干细胞来源于神经系统，是天生的神经细胞，神经干细胞移植治疗神经系统损伤疾病是最理想的选择。目前，神经干细胞的培养主要有两种方式：单层培养和神经球悬浮培养。悬浮聚球培养方式可以很好的支持干细胞的增殖并同时保持其特性，同时悬浮培养的方式也为以后实现干细胞在临床实验批量使用成为可能。这种培养方式成功的关键在于培养基的选择，因此，寻求培养效果优异的适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基显得尤为重要。

目前，适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基种类较少，仅有的几种培养效果不佳，细胞稳定性、干性保持效果和扩增速率有待进一步提高。如申请号为201811464620.5的中国发明专利公开了一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基制备方法，包含：DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、WNT3a、Notch1、牛血清白蛋白、肝素钠、腐胺、亚硒酸钠、Glutamax-I、内皮生长因子、黄体酮、HEPES、NaHCO

发明内容

本发明旨在解决上述问题，提供了一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，该培养基安全性高，干细胞培养效果好，细胞稳定性、干性保持效果佳，扩增速率快；同时还提供一种所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基的制备方法，该制备方法简单，可重复性强，操作简便易行，设备投资少，具有较高的推广应用价值。

为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案，一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其特征在于，其组分如下：基础培养基13-20g/L，胰岛素生长因子-11-5ng/mL，转化生长因子β11-3ng/mL，表皮生长因子3-10ng/mL，胎牛血清5-12ng/mL，丙酮酸钠0.001-0.003mg/mL，谷氨酰胺0.01-0.03mM，氯甲基三甲基锗烷改性腺苷120-220μM，复合维生素5-50μM，超支化聚氨基酸3-15μM，超支化聚壳多糖1-7μM，羧苄西林3-6μg/mL，氯化钠0.008-0.012mg/mL，碳酸氢钠0.008-0.012mg/mL。

较佳的，所述基础培养基为DMEM、IMDM、ES培养基中的任意一种。

较佳的，所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基还包括：戊酸雌二醇4-12nM。

较佳的，所述氯甲基三甲基锗烷改性腺苷的制备方法，包括如下步骤：将氯甲基三甲基锗烷、腺苷加入到有机溶剂中，在40-60℃下搅拌反应6-8小时，后旋蒸除去溶剂，用乙醚洗涤产物3-6次，后旋蒸除去乙醚，得到氯甲基三甲基锗烷改性腺苷。

较佳的，所述氯甲基三甲基锗烷、腺苷、有机溶剂的摩尔比为3:1:(15-25)。

较佳的，所述有机溶剂为乙醚、乙酸乙酯、丙酮中的任意一种。

较佳的，所述复合维生素为维生素C、维生素B2、维生素E、维生素D3按质量比1:(1-3):2:(0.5-1.2)。

较佳的，所述超支化聚氨基酸的制备方法参见CN101575412A实施例1。所述超支化聚壳多糖的制备方法参见CN201910272273.4 实施例1。

本发明的另一个目的，在于提供一种所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括：将各组分按重量份混合，然后溶于水中，搅拌均匀后，紫外杀菌，得到所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基成品。

较佳的，所述水为三蒸水、超纯水中的至少一种。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

（1）本发明提供的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基的制备方法，该制备方法工艺简单，可重复性强，操作简便易行，设备投资少，具有较高的推广应用价值。

（2）本发明提供的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，克服了目前适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基种类较少，仅有的几种培养效果不佳，细胞稳定性、干性保持效果和扩增速率有待进一步提高的缺陷，通过各组分协同作用，使得制成的适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基安全性高，干细胞培养效果好，细胞稳定性、干性保持效果佳，扩增速率快。

（3）本发明提供的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，通过胰岛素生长因子-1、转化生长因子β1和表皮生长因子的协同作用，具有多种生物学功能，参与细胞的形成与发展，调节细胞的迁徙与增值，刺激细胞免疫反应，促进细胞的增值、稳定；胎牛血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的，较好地保持干性。它们协同作用，降低血清添加量，减少了其危害，同时又不会对干性造成影响，使得制成的培养基综合性能和性能稳定性好。

（4）本发明提供的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，氯甲基三甲基锗烷改性腺苷、复合维生素、超支化聚氨基酸、超支化聚壳多糖协同作用，能为细胞生长提供充足的营养，协同作用，能促进细胞的增殖，提高细胞培养效果，保持干性；提高细胞的稳定性，明显增加了细胞的扩增数量，临床研究效果增强。

（5）本发明提供的一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，丙酮酸钠、羧苄西林和戊酸雌二醇的添加，与其它组分协同作用，能促进细胞增殖，改善免疫抑制功能，改善培养效果；使得培养得到的神经干细胞临床活性高，实用性强。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明产品作进一步详细的说明。

本实施例中所需原料均为商业购买；所述超支化聚氨基酸的制备方法参见CN101575412A实施例1；所述超支化聚壳多糖的制备方法参见CN201910272273.4 实施例1。

实施例1

一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其特征在于，其组分如下：基础培养基13g/L，胰岛素生长因子-1 1ng/mL，转化生长因子β1 1ng/mL，表皮生长因子3ng/mL，胎牛血清5ng/mL，丙酮酸钠0.001mg/mL，谷氨酰胺0.01mM，氯甲基三甲基锗烷改性腺苷120μM，复合维生素5μM，超支化聚氨基酸3μM，超支化聚壳多糖1μM，羧苄西林3μg/mL，氯化钠0.008mg/mL，碳酸氢钠0.008mg/mL。

所述基础培养基为DMEM；所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基还包括：戊酸雌二醇4nM。

所述氯甲基三甲基锗烷改性腺苷的制备方法，包括如下步骤：将氯甲基三甲基锗烷、腺苷加入到有机溶剂中，在40℃下搅拌反应6小时，后旋蒸除去溶剂，用乙醚洗涤产物3次，后旋蒸除去乙醚，得到氯甲基三甲基锗烷改性腺苷；所述氯甲基三甲基锗烷、腺苷、有机溶剂的摩尔比为3:1:15；所述有机溶剂为乙醚。

所述复合维生素为维生素C、维生素B2、维生素E、维生素D3按质量比1:1:2:0.5。

一种所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括：将各组分按重量份混合，然后溶于水中，搅拌均匀后，紫外杀菌，得到所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基成品；所述水为三蒸水。

实施例2

一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其特征在于，其组分如下：基础培养基15g/L，胰岛素生长因子-1 2.5ng/mL，转化生长因子β1 1.5ng/mL，表皮生长因子5ng/mL，胎牛血清7ng/mL，丙酮酸钠0.0015mg/mL，谷氨酰胺0.015mM，氯甲基三甲基锗烷改性腺苷140μM，复合维生素20μM，超支化聚氨基酸8μM，超支化聚壳多糖3μM，羧苄西林4μg/mL，氯化钠0.009mg/mL，碳酸氢钠0.009mg/mL。

所述基础培养基为IMDM培养基；所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基还包括：戊酸雌二醇6nM。

所述氯甲基三甲基锗烷改性腺苷的制备方法，包括如下步骤：将氯甲基三甲基锗烷、腺苷加入到有机溶剂中，在45℃下搅拌反应6.5小时，后旋蒸除去溶剂，用乙醚洗涤产物4次，后旋蒸除去乙醚，得到氯甲基三甲基锗烷改性腺苷；所述氯甲基三甲基锗烷、腺苷、有机溶剂的摩尔比为3:1:17；所述有机溶剂为乙酸乙酯。

所述复合维生素为维生素C、维生素B2、维生素E、维生素D3按质量比1:1.5:2:0.8。

一种所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括：将各组分按重量份混合，然后溶于水中，搅拌均匀后，紫外杀菌，得到所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基成品；所述水为超纯水。

实施例3

一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其特征在于，其组分如下：基础培养基16g/L，胰岛素生长因子-1 3.5ng/mL，转化生长因子β1 2ng/mL，表皮生长因子7ng/mL，胎牛血清8ng/mL，丙酮酸钠0.002mg/mL，谷氨酰胺0.02mM，氯甲基三甲基锗烷改性腺苷190μM，复合维生素35μM，超支化聚氨基酸12μM，超支化聚壳多糖5μM，羧苄西林4.5μg/mL，氯化钠0.001mg/mL，碳酸氢钠0.01mg/mL。

所述基础培养基为ES培养基；所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基还包括：戊酸雌二醇8nM。

所述氯甲基三甲基锗烷改性腺苷的制备方法，包括如下步骤：将氯甲基三甲基锗烷、腺苷加入到有机溶剂中，在50℃下搅拌反应7小时，后旋蒸除去溶剂，用乙醚洗涤产物5次，后旋蒸除去乙醚，得到氯甲基三甲基锗烷改性腺苷；所述氯甲基三甲基锗烷、腺苷、有机溶剂的摩尔比为3:1:20；所述有机溶剂为丙酮。

所述复合维生素为维生素C、维生素B2、维生素E、维生素D3按质量比1:2:2:0.9。

一种所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括：将各组分按重量份混合，然后溶于水中，搅拌均匀后，紫外杀菌，得到所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基成品；所述水为三蒸水。

实施例4

一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其特征在于，其组分如下：基础培养基18g/L，胰岛素生长因子-1 4.5ng/mL，转化生长因子β1 2.5ng/mL，表皮生长因子9ng/mL，胎牛血清11ng/mL，丙酮酸钠0.0025mg/mL，谷氨酰胺0.028mM，氯甲基三甲基锗烷改性腺苷210μM，复合维生素45μM，超支化聚氨基酸13μM，超支化聚壳多糖6μM，羧苄西林5.5μg/mL，氯化钠0.011mg/mL，碳酸氢钠0.011mg/mL。

所述基础培养基为DMEM培养基；所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基还包括：戊酸雌二醇11nM。

所述氯甲基三甲基锗烷改性腺苷的制备方法，包括如下步骤：将氯甲基三甲基锗烷、腺苷加入到有机溶剂中，在55℃下搅拌反应7.8小时，后旋蒸除去溶剂，用乙醚洗涤产物6次，后旋蒸除去乙醚，得到氯甲基三甲基锗烷改性腺苷；所述氯甲基三甲基锗烷、腺苷、有机溶剂的摩尔比为3:1:23；所述有机溶剂为乙醚。

所述复合维生素为维生素C、维生素B2、维生素E、维生素D3按质量比1:2.5:2:1.1。

一种所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括：将各组分按重量份混合，然后溶于水中，搅拌均匀后，紫外杀菌，得到所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基成品；所述水为三蒸水、超纯水按质量比3:5混合而成。

实施例5

一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其特征在于，其组分如下：基础培养基20g/L，胰岛素生长因子-1 5ng/mL，转化生长因子β1 3ng/mL，表皮生长因子10ng/mL，胎牛血清12ng/mL，丙酮酸钠0.003mg/mL，谷氨酰胺0.03mM，氯甲基三甲基锗烷改性腺苷220μM，复合维生素50μM，超支化聚氨基酸15μM，超支化聚壳多糖7μM，羧苄西林6μg/mL，氯化钠0.012mg/mL，碳酸氢钠0.012mg/mL。

所述基础培养基为DMEM；所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基还包括：戊酸雌二醇12nM。

所述氯甲基三甲基锗烷改性腺苷的制备方法，包括如下步骤：将氯甲基三甲基锗烷、腺苷加入到有机溶剂中，在60℃下搅拌反应8小时，后旋蒸除去溶剂，用乙醚洗涤产物6次，后旋蒸除去乙醚，得到氯甲基三甲基锗烷改性腺苷；所述氯甲基三甲基锗烷、腺苷、有机溶剂的摩尔比为3:1:25；所述有机溶剂为丙酮。

所述复合维生素为维生素C、维生素B2、维生素E、维生素D3按质量比1:3:2:1.2。

一种所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括：将各组分按重量份混合，然后溶于水中，搅拌均匀后，紫外杀菌，得到所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基成品；所述水为三蒸水。

对比例1

一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加胰岛素生长因子-1和转化生长因子β1。

对比例2

一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加氯甲基三甲基锗烷改性腺苷。

对比例3

一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加超支化聚氨基酸和超支化聚壳多糖。

对比例4

一种适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加羧苄西林和戊酸雌二醇。

为了进一步说明本发明的的有益技术效果，对各例所述适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基进行效果测试，利用各例的培养基培养神经干细胞，培养方法为本领域常规方法，分别培养2天，5天和7天后统计神经干细胞数目。

表1

从表1中可以看出，实施例1-5中的适合大规模培养临床级神经干细胞的培养基较对比例具有更加优异的培养效果，这是各组分协同作用的结果。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。