一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组及其应用

技术领域

本发明涉及分子鉴定领域，特别是涉及一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组及其应用。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一种人兽共患病，最早于1881年在患有禽霍乱的病鸡中分离，可感染多种家畜、家禽、野生动物及人。

溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica，Mh)是一种可感染多种家畜和野生动物的条件致病菌，主要感染牛、羊等反刍动物。该菌是牛、羊肺炎及新生羔羊败血症的主要病原，已经严重危害养殖业业的健康发展。

近年来，多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌在世界范围内的流行趋势不断上升，一旦发病很难根治，所以快速而又准确的诊断出疾病病原极为关键。目前存在多种针对多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的PCR检测方法均为单一检测方法，同时检测牦牛源曼氏杆菌和巴氏杆菌且特异性好、敏感性高的双重PCR方法尚未公开。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组及其应用。本发明所述引物组能够同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌且特异性好、敏感性高，为同时检测牦牛曼氏杆菌和巴氏杆菌提供了有效的技术支持。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组，所述引物组包括LKTA引物对和KMT引物对；所述LKTA引物对包括LKTA-F和LKTA-R；所述LKTA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述LKTA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述KMT引物对包括KMT-F和KMT-R；所述KMT-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述KMT-R的核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述巴氏杆菌包括多杀性巴氏杆菌；所述曼氏杆菌包括溶血性曼氏杆菌。

本发明提供了上述引物组在制备同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的试剂盒中的应用。

本发明提供了一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括包括上述引物组。

优选的，所述试剂盒还包括2×PCR Mix和ddH

本发明提供了一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的方法，包括以下步骤：以待测样品的DNA为模板，与上述引物对或上述试剂盒中的引物对混合后进行PCR扩增；

当PCR产物在241bp和423bp各有1条DNA条带，则为曼氏杆菌阳性和巴氏杆菌阳性；当PCR产物只在241bp有1条DNA条带，则为曼氏杆菌阳性；当PCR产物只在423bp有1条DNA条带，则为巴氏杆菌阳性。

优选的，所述待测样品包括高原牦牛鼻部分泌物或高原牦牛肺脏组织。

优选的，所述PCR扩增的反应体系以25μL计，包括LKTA-F、LKTA-R、KMT-F和KMT-R各1μL，2×PCR Mix 12.5μL、模板DNA组1ng和余量的ddH

优选的，所述LKTA-F、LKTA-R、KMT-F和KMT-R的工作浓度均为0.4～0.6μmol·L

优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，58～59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。

有益效果：

本发明提供了一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组，所述引物组包括LKTA引物对和KMT引物对；所述LKTA引物对包括LKTA-F和LKTA-R；所述LKTA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述LKTA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述KMT引物对包括KMT-F和KMT-R；所述KMT-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述KMT-R的核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明针对巴氏杆菌和曼氏杆菌中LKT(Gene ID：JQ423930.1)和KMT(Gene ID：AE004439.1)两种毒力基因获得了能够同时检测巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组。实验结果表明：本发明所述引物组能检测到的曼氏杆菌和巴氏杆菌最低模板量分别为100pg和10pg基因组DNA，检测到的曼氏杆菌和巴氏杆菌最低模板量与单重一致，可见本发明所述引物组共同使用没有影响其敏感性；高敏感性有助于对感染初期的动物进行诊断，也可实现对含有较低病原体的样本进行成功检测，从而可以避免对感染动物的漏检，对于准确诊断及全面的流行病学调查均有重要意义。本发明所述引物组能够特异地扩增出牦牛源曼氏杆菌和巴氏杆菌的LKT和KMT基因片段，而牦牛源大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌等6种常见菌以及阴性对照的结果均为阴性(即无条带产生)，可见本发明所述引物组仅对溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌有阳性扩增结果，而不会检出其他病原，如大肠杆菌、沙门氏菌等，所以本发明所述引物组具有敏感度高和特异性好的优势，而且本发明的引物组中的两对引物在一个PCR反应体系内使用而互不干扰。本发明所述引物组有助于对临床病例进行正确诊断，从而对生产实践中指导正确用药及其他相应防治措施具有非常重要的意义。

本发明所述引物组能够同时检测巴氏杆菌和曼氏杆菌，较目前所使用的单独检测溶血性曼氏杆菌或多杀性巴氏杆菌的PCR方法更方便、省时、省力。

附图说明

图1为实施例2中单重PCR扩增结果，其中M为DNA Marker，1为巴氏杆菌KMT基因，2为阴性对照KMT基因，3为曼氏杆菌LKT基因，4为阴性对照LKT基因；

图2为实施例3中双重PCR扩增结果，其中M为DNA Marker，1为曼氏杆菌和巴氏杆菌混合DNA；2为巴氏杆菌DNA；3为曼氏杆菌DNA；4为无模板对照；

图3为实施例3中双重PCR检测方法引物浓度优化，其中A为曼氏杆菌，B为巴氏杆菌，M为DNA Marker，1～3分别表示引物浓度为0.2、0.4、0.6μmol·L

图4为实施例3中双重PCR检测方法退火温度优化，其中M为DNA Marker，1～6分别表示退火温度56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃；7为阴性对照；

图5为实施例4中曼氏杆菌敏感性试验，其中M为DNA分子质量标准，1～7分别代表1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg，8为无模板对照；

图6为实施例4中巴氏杆菌敏感度试验，其中M为DNA分子质量标准，1～7分别代表1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg，8为无模板对照；

图7为实施例4中双重PCR检测方法敏感性，其中M为DNA Marker，1～7为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg，8为无模板对照；

图8为实施例5中双重PCR检测方法特异性，其中M为DNA Marker，1～10孔分别为曼氏杆菌和巴氏杆菌、曼氏杆菌、巴氏杆菌、戊糖片球菌、食窦魏斯氏、融和魏斯氏、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和ddH

具体实施方式

如无特殊要求，本发明所用菌株均为本领域技术人员常规购买所得。

本发明提供了一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组，所述引物组包括LKTA引物对和KMT引物对；所述LKTA引物对包括LKTA-F和LKTA-R；所述LKTA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：ATTGTGCCGGAAGACGATGT；所述LKTA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：GCCCATCAGGCGATGTTAGA；所述KMT引物对包括KMT-F和KMT-R；所述KMT-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：TGAAGCCATTAACGACAG；所述KMT-R的核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示：TGACTTGACCTCCGACTA。在本发明中，所述巴氏杆菌优选包括多杀性巴氏杆菌；所述曼氏杆菌优选包括溶血性曼氏杆菌。在本发明中，所述引物对优选由武汉金开瑞公司合成。

本发明所述引物组能检测到的曼氏杆菌和巴氏杆菌最低模板量为分别为100pg和10pg基因组DNA且检测到的曼氏杆菌和巴氏杆菌最低模板量与单重一致，本发明所述引物组还能够特异地扩增出牦牛源曼氏杆菌和巴氏杆菌的LKT和KMT基因片段，而牦牛源大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌等6种常见菌以及阴性对照的结果均为阴性(即无条带产生)，可见本发明所述引物组能够应用于制备同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的试剂盒中。

本发明提供了上述引物组在制备同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的试剂盒中的应用。

本发明提供了一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括包括上述引物组。在本发明中，所述试剂盒优选还包括2×PCR Mix和ddH

本发明所述引物组或所述试剂盒中的引物组针对巴氏杆菌和曼氏杆菌中LKT和KMT两种毒力基因设计得到，能够特异性的鉴定牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌且敏感度高，因此本发明所述引物组能够用于检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌。

本发明提供了一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的方法，包括以下步骤：以待测样品的DNA为模板，与上述引物对或上述试剂盒中的引物对混合后进行PCR扩增；

当PCR产物在241bp和423bp各有1条DNA条带，则为曼氏杆菌阳性和巴氏杆菌阳性；当PCR产物只在241bp有1条DNA条带，则为曼氏杆菌阳性；当PCR产物只在423bp有1条DNA条带，则为巴氏杆菌阳性。

在本发明中，所述待测样品优选包括高原牦牛鼻部分泌物或高原牦牛肺脏组织。在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以25μL计，优选包括LKTA-F、LKTA-R、KMT-F和KMT-R各1μL，2×PCR Mix12.5μL、模板DNA组1ng和余量的ddH

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、菌株的活化

先将溶血性曼氏杆菌标准株冻干粉(ATCC BAA-410

实施例2

1、引物的筛选

针对曼氏杆菌和巴氏杆菌的毒力基因(LKTA，KMT)各设计了1对特异性引物，由武汉金开瑞公司合成。引物序列及扩增片段长度见表1。

表1引物序列及扩增片段长度

2、单重PCR检测方法的建立及扩增产物的鉴定

按照细菌基因组DNA提取试剂盒(艾德莱生物，货号DN11)说明书分别提取牦牛源曼氏杆菌和巴氏杆菌的基因组DNA。

以牦牛源曼氏杆菌的基因组DNA为模板，利用LKTA基因引物对(LKTA-F和LKTA-R)进行单重PCR扩增。

以牦牛源巴氏杆菌的基因组DNA为模板，利用KMT基因引物对(KMT-F和KMT-R)进行单重PCR扩增。

PCR扩增的反应体系为25μL：包含12.5μL 2×PCR Mix，基因组DNA 1ng，0.6μmol·L

PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。

本发明所述引物对能特异地扩增出曼氏杆菌LKTA(241bp)和KMT(423bp)基因片段，而阴性对照(灭菌ddH

实施例3

1、双重PCR检测方法的建立及反应条件的优化

将浓度稀释至10μmol·L

在单重PCR检测方法的建立的基础上建立双重PCR检测方法，PCR扩增的反应体系为25μL：包含12.5μL 2×PCR Mix、曼氏杆菌和巴氏杆菌基因组DNA各1ng，0.4μmol·L

PCR扩增的反应体系为25μL：包含12.5μL 2×PCRMix、曼氏杆菌和巴氏杆菌基因组DNA各1ng，0.4μmol·L

实验结果如图2所示，将曼氏杆菌和巴氏杆菌基因组DNA的量固定为1ng进行双重PCR扩增，结果表明混合引物浓度为0.4μmol·L

2、双重PCR检测方法反应条件的优化

2.1、引物浓度的优化

PCR扩增的反应体系为25μL：包含12.5μL 2×PCRMix、曼氏杆菌和巴氏杆菌基因组DNA各1ng，0.2μmol·L

PCR扩增的反应体系为25μL：包含12.5μL 2×PCRMix、曼氏杆菌和巴氏杆菌基因组DNA各1ng和0.4μmol·L

PCR扩增的反应体系为25μL：包含12.5μL 2×PCRMix、曼氏杆菌和巴氏杆菌基因组DNA各1ng和0.6μmol·L

PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。

2.1、退火温度的优化

PCR扩增的反应体系为25μL：包含12.5μL 2×PCRMix、曼氏杆菌和巴氏杆菌基因组DNA各1ng和0.4μmol·L

PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。在此基础上，将双重PCR检测方法的退火温度分别设置为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃和70℃，确定最佳的退火温度。

实验结果如图3和图4所示，表明当混合引物的浓度为0.4～0.6μmol·L

实施例4

双重PCR检测方法敏感性

取曼氏杆菌的LKT基因组DNA和巴氏杆菌的KMT基因组DNA各1ng，进行连续的10倍倍比稀释，使双重PCR反应体系中模板的量分别为1fg、10fg、1pg、10pg、100pg和1ng，进行扩增。

PCR扩增的反应体系为25μL：包含12.5μL 2×PCRMix、基因组DNA 1ng和0.4μmol·L

PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。

扩增结果显示，单重PCR检测方法能检测到的曼氏杆菌和巴氏杆菌最低模板量为分别为100pg(图5)和10pg(图6)基因组DNA。双重PCR检测方法能检测到的曼氏杆菌和巴氏杆菌最低模板量与单重一致(图7)。结果表明，该双重PCR检测方法具有良好的敏感性。

实施例5

双重PCR检测方法的特异性

牦牛源曼氏杆菌、牦牛源巴氏杆菌以及牦牛源大肠杆菌、牦牛源沙门氏菌、牦牛源枯草芽孢杆菌、牦牛源戊糖片球菌、牦牛源食窦魏斯氏菌、牦牛源融合魏斯氏菌6种常见菌采用细菌基因组DNA提取试剂盒(艾德莱生物，货号DN11)进行提取DNA后，进行PCR扩增PCR扩增的反应体系为25μL：包含12.5μL 2×PCR Mix、曼氏杆菌和巴氏杆菌基因组DNA各1ng和0.4μmol·L

结果如图8所示应用建立的双重PCR检测方法能特异地扩增出牦牛源曼氏杆菌和巴氏杆菌的LKT和KMT基因片段，而牦牛源大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌6种常见菌以及阴性对照(灭菌ddH

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 西藏农牧学院

<120> 一种同时检测牦牛源巴氏杆菌和曼氏杆菌的引物组及其应用

<150> 2021100738557

<151> 2021-01-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attgtgccgg aagacgatgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcccatcagg cgatgttaga 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaagccatt aacgacag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgacttgacc tccgacta 18